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Neuroscience

माउस हिप्पोकैंपस में Oligomeric Amyloid-बीटा की Stereotaxic आसव

Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52805
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, 2The Taub Institute for Research on Alzheimer's Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, 3Department of Neurology, Columbia University Medical Center

Abstract

अल्जाइमर रोग उम्र बढ़ने की आबादी को प्रभावित करने वाले एक neurodegenerative रोग है। बीमारी का एक प्रमुख नयूरोपथोलोगिकल सुविधा एमीलोयड-बीटा का अधिक उत्पादन और पीड़ित व्यक्तियों के मस्तिष्क क्षेत्रों में amyloid बीटा सजीले टुकड़े के बयान है। वर्ष के दौरान वैज्ञानिकों एमीलोयड-बीटा विकृति को दोहराने के लिए प्रयास है कि कई अल्जाइमर रोग के माउस मॉडल उत्पन्न किया है। दुर्भाग्य से, माउस मॉडल केवल चुनिंदा रोग विशेषताओं की नकल। Neuronal मौत, अल्जाइमर रोग के रोगियों के दिमाग में एक प्रमुख प्रभाव, ज़ाहिर इन चूहों में कमी है। न्यूरॉन्स के लिए सबसे जहरीले साबित हो गया है कि एमीलोयड-बीटा के रूपों - - इसलिए, हम और दूसरों को सीधे एमीलोयड-बीटा के घुलनशील oligomeric प्रजातियों के निवेश की एक विधि कार्यरत है stereotaxically मस्तिष्क में। इस रिपोर्ट में हम एक का चयन मस्तिष्क क्षेत्र में amyloid बीटा स्तर को बढ़ाने के लिए इस सर्जरी तकनीक दस्तावेज़ करने के लिए पुरुष C57BL / 6J चूहों का उपयोग।कोलीनर्जिक सर्किट से जुड़ा हुआ है कि बेसल अग्रमस्तिष्क के साथ-साथ यह मस्तिष्क संरचना, बीमारी में अध: पतन के क्षेत्रों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि आसव लक्ष्य हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस है। ब्रोका के विकर्ण बैंड के ऊर्ध्वाधर अंग में कोशिका मृत्यु और कोलीनर्जिक न्यूरॉन नुकसान में एक सहवर्ती वृद्धि हुई है, जबकि stereotaxic निषेचन के माध्यम से दांतेदार गाइरस में amyloid बीटा को ऊपर उठाने के परिणाम, 1 सप्ताह के भीतर दांतेदार गाइरस में न्यूरॉन नुकसान में वृद्धि का पता चलता है बेसल अग्रमस्तिष्क की। इन प्रभावों को 2 सप्ताह तक मनाया जाता है। हमारे डेटा वर्तमान एमीलोयड-बीटा अर्क मॉडल एक अल्पकालिक आधार में इस क्षेत्र के लिए विशिष्ट न्यूरॉन मौत को संबोधित करने के लिए एक विकल्प के माउस मॉडल प्रदान करता है कि पता चलता है। इस मॉडल का लाभ एमीलोयड-बीटा एक स्थानिक और लौकिक ढंग से उठाया जा सकता है।

Introduction

एमीलोयड-बीटा (Aβ 1-42) से बना रहे हैं, जो Amyloid पट्टिका जमा, अल्जाइमर रोग (ई) की विकृति की एक प्रमुख विशेषता हैं। कई अध्ययनों से neuronal मौत, अन्तर्ग्रथनी डिस्ट्रोफी, हानि और शिथिलता बटोर पुनः संयोजक oligomeric Aβ 1-42 की है कि उच्च या विषाक्त स्तर से पता चला है; के रूप में अच्छी तरह से सीखने और स्मृति घाटे 1-4 के रूप में। प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस, कॉर्टेक्स, और बेसल अग्रमस्तिष्क और प्रमस्तिष्कखंड 5,6 के रूप में इस तरह के subcortical संरचनाओं शामिल हैं। तारीख करने के लिए विज्ञापन के Aβ 1-42 विकृति अनुकरण करने का प्रयास है कि कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल हैं। तनाव के आधार पर इन जानवरों ईस्वी का चयन करें रोग सुविधाओं की जांच करने में उपयोगी साबित होते हैं। दुर्भाग्य से, 2 ट्रांसजेनिक लाइनों, APP23 और 5XFAD के अपवाद के साथ, इन चूहों को पूरी तरह से न्यूरोनल हानि, विज्ञापन का एक महत्वपूर्ण पहलू को दोहराने कभी नहीं। यहां तक ​​कि APP23 और 5XFAD में मनाया न्यूरोनल हानि, neuronal मौत obser साथवेद कुछ चुनिंदा क्षेत्रों 7,8 करने के लिए, सूक्ष्म उम्र निर्भर है, और पृथक किया गया।

जंगली प्रकार माउस मस्तिष्क में oligomeric Aβ 1-42 के प्रत्यक्ष अर्क amyloidopathy 1,9,10 के neuronal मौत पहलू प्रतिकृति जो vivo मॉडल में एक उत्कृष्ट प्रदान करता है। आमतौर पर उपयोग किया ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के विपरीत oligomeric Aβ 1-42 अर्क मॉडल तीव्रता से एक स्थानिक और लौकिक ढंग से Aβ 1-42 के स्तर को ऊपर उठाने के लिए आदर्श है। इस मॉडल के लिए जंगली प्रकार चूहों का उपयोग करने का लाभ यह है कि ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में पेश म्यूटेशन से संभावित मुआवजा या साइड इफेक्ट अनावश्यक। विगत पढ़ाई हिप्पोकैम्पस में Aβ 1-42 के विषाक्त स्तर infusing 1 सप्ताह 1 भीतर इंजेक्शन स्थल के आसपास के क्षेत्र में न्यूरॉन मौत elicits दिखाया है। इसके अलावा, Aβ 1-42 कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स 11 बेसल अग्रमस्तिष्क के लिए विषाक्त अवलोकन के साथ संगत है किहिप्पोकैम्पस के लिए परियोजनाओं जो कोलीनर्जिक न्यूरॉन (BFCN) जनसंख्या प्रभावी रूप से मस्तिष्क में पृथक न्यूरोनल circuitry की परीक्षाओं के लिए अनुमति देता है, चूहों में बीटा amyloid अर्क 1,10 निम्नलिखित 7-14 दिनों के भीतर 20-50% की कमी हुई है। अधिकांश भाग के नियंत्रण / वाहन और oligomeric Aβ 1-42 समाधान के लिए हिप्पोकैम्पस 12 की दांतेदार गाइरस, को ipsilaterally BFCN परियोजना के बाद से तुलना बाएँ और दाएँ गोलार्द्धों के बीच 1 किए जाने के लिए अनुमति देने के मस्तिष्क के दोनों तरफ इंजेक्ट किया जा सकता है।

इस रिपोर्ट में हम वयस्क जंगली प्रकार C57BL / 6J चूहों के लिए एक विस्तृत शल्य चिकित्सा और इंजेक्शन पद्धति प्रदान करेगा। यह माउस तनाव की वजह से अनुसंधान के क्षेत्र में अपने व्यापक उपयोग की चुन लिया जाता है। तकनीकी तौर पर, किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र लेकिन यहाँ हम तकनीक को वर्णन करने के लक्ष्य के रूप में हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस का उपयोग करेगा, संचार के लिए निशाना बनाया जा सकता है।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रयोगों के लिए, संस्थागत और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए राष्ट्रीय दिशा निर्देशों का पालन कर रहे थे।

1. सर्जरी के लिए सर्जिकल उपकरण और समाधानों को तैयार

  1. सभी स्टेनलेस स्टील सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव।
  2. बाँझ आणविक ग्रेड विआयनीकृत आसुत जल के साथ 200 प्रमाण पूर्ण इथेनॉल गिराए द्वारा 70% इथेनॉल तैयार करें।
  3. हैमिल्टन सिरिंज से 29 जी सुई संलग्न। 1 मिनट के लिए बार-बार ऊपर ड्राइंग और बाहर खदेड़ना nanopure पानी से हैमिल्टन सिरिंज और सुई के इंटीरियर को साफ करें। 70% इथेनॉल के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
    1. हैमिल्टन सिरिंज से सवार और सुई निकालें। एयर एक लामिना का प्रवाह हुड हे / एन भागों में सूखे।
    2. उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ सुई और सिरिंज चमकाना।
  4. 0.9% की मात्रा एकाग्रता के लिए एक अंतिम वजन करने के लिए आणविक ग्रेड पानी में सोडियम क्लोराइड भंग करके नमकीन घोल तैयार करें। Sterili0.2 माइक्रोन रोमकूप फिल्टर के माध्यम से इसे छान कर समाधान ज़ी।

2. Oligomeric Aβ 1-42 तैयार करें

  1. सो 'और दूसरों 13 के प्रकाशन में वर्णित के रूप में Monomerize और वास्तव में 5 मिमी के DMSO में पुनः संयोजक मानव Aβ 1-42 resuspend।
  2. सर्जरी से पहले दिन पर 100 माइक्रोन बाँझ (1x) पीबीएस के साथ 5 मिमी Aβ 1-42 पतला।
  3. विचूर्णन द्वारा अच्छी तरह से समाधान मिलाएं।
  4. 4C पर 12 घंटे के लिए Aβ 1-42 समाधान सेते हैं।
    नोट: इस तरह के पीबीएस में DMSO के गिराए या तले रूप में नियंत्रण समाधान / Aβ ​​1-42 पेप्टाइड Aβ 1-42 के रूप में एक ही तरह से तैयार किया जाना चाहिए रिवर्स।

इंजेक्शन निर्देशांक निर्धारित 3.

  1. सटीक पूर्वकाल पीछे (एपी), औसत दर्जे का पार्श्व (माले) निर्धारित करने के लिए वयस्क माउस ब्रेन एटलस प्रयोग करें, और पृष्ठीय उदर (डीवी) ब्याज 14 के मस्तिष्क क्षेत्र के लिए निर्देशांक।
    नहींते: हम पर्वबिन्दु से निम्नलिखित निर्देशांक के साथ लक्ष्य के रूप में हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस उठाया तकनीक को वर्णन करने के लिए: एपी, -2.00 मिमी; एमएल, 1.3 मिमी ±; डीवी, -2.2 मिमी। एपी मूल्य पूर्ववर्ती नकारात्मक संकेत यह पर्वबिन्दु की 2.00 मिमी पीछे है कि इंगित करता है। एमएल मूल्य पूर्ववर्ती ± साइन केंद्र से छोड़ दिया और सही दिशा इंगित करता है। अन्त में, डीवी पूर्ववर्ती नकारात्मक संकेत यह मस्तिष्क की सतह से पेट के बल बढ़ रहा है इंगित करता है।

4. stereotaxic फ्रेम सेटअप

  1. एक सर्जिकल मास्क चेहरा, साफ प्रयोगशाला कोट, और बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहनें।
  2. Stereotaxic साधन और 70% इथेनॉल के साथ माउस एडाप्टर के नीचे साफ कर लें।
  3. काउंटर पर बाँझ सर्जिकल कपड़ा नीचे निर्धारित करना।
  4. बाँझ सर्जिकल कपड़ा के शीर्ष पर माउस एडाप्टर के साथ stereotaxic साधन रखें।
  5. 70% इथेनॉल के साथ माउस हीटिंग पैड साफ कर लें। Stereotaxic फ्रेम बिस्तर पर हीटिंग पैड स्थिति। सामान्य प्रयोजन प्रयोगशाला का प्रयोग करेंमाउस एडाप्टर बिस्तर पर हीटिंग पैड नीचे टेप करने के लिए इतिहास लेबलिंग टेप।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार गर्म पानी recirculator पंप करने के लिए हीटिंग पैड संलग्न।
    2. गर्म पानी recirculator पंप पर बारी और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान सेट, और यह तापमान तक पहुँच जाता है तब तक प्रतीक्षा करें।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मोटर चालित खड़ी इंजेक्शन शाफ्ट पर यह पंगा लेना stereotaxic फ्रेम पर एक 29 जी सुई के साथ 50 μl हैमिल्टन सिरिंज प्रत्यय।
  7. मनका अजीवाणु पर मुड़ें और यह निर्माता के पूर्व निर्धारित तापमान तक पहुँच जाता है जब तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: यह जानवरों के बीच स्टेनलेस स्टील के उपकरणों स्टरलाइज़ के लिए प्रयोग किया जाता है। यह यंत्र नसबंदी के लिए मोती के साथ संपर्क के लिए 20 सेकंड लेता है।
  8. गर्म थाली पर मुड़ें और 42 डिग्री सेल्सियस के लिए यह सेट और ऊपर एक स्वच्छ खाली पिंजरे जगह है।
  9. हैमिल्टन सिरिंज stereotaxic फ्रेम पर तय हो गई है, जबकि मोटर चालित stereotaxic मैं उपयोगnjector Aβ 1-42 समाधान को आकर्षित करने के लिए।
    नोट: सिरिंज में समाधान का अधिक से अधिक 4 μl ड्रा और फिर इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए stereotaxic इंजेक्टर का उपयोग करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार इंजेक्टर कार्य करते हैं।

5. पशु तैयारी

  1. वजन पैमाने का उपयोग करने के लिए माउस का वजन निर्धारित करते हैं।
  2. Intraperitoneally (आईपी) इंजेक्शन लगाने के द्वारा 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine पर ketamine / xylazine कॉकटेल के साथ माउस anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी पलटा के नुकसान से संज्ञाहरण की गहराई मॉनिटर।
  3. माउस बेहोश हो जाने के बाद बाल क्लिपर लेने के लिए और खोपड़ी पर त्वचा को बेनकाब करने के लिए अपने सिर दाढ़ी।
  4. Stereotaxic बिस्तर के शीर्ष पर हीटिंग पैड के शीर्ष पर माउस रखें।
  5. दांत गार्ड अंदर छेनी दांत मुंह खोलने के लिए और स्थान के लिए रंग का प्रयोग करें। माउस के चेहरे पर nosepiece सुरक्षित। धीरे और भी तंग नहीं यह शिकंजा कसने।
  6. Posiसिर को सुरक्षित करने के कर्णद्वार में द्विपक्षीय कान crossbars tion। यह खोपड़ी हिट जब तक में प्रत्येक क्रॉसबार ले जाएँ, और फिर इसे बंद करने के लिए पेंच बारी है।
    1. सिर धीरे सिर पर नीचे पुश करने के लिए अपने सूचकांक उंगली का उपयोग सुरक्षित है सुनिश्चित करने के लिए। सिर ठीक से सुरक्षित है, तो इसे बाहर नहीं देंगे या जब दबाया चाल है।
  7. उन्हें नम रखने के लिए आंखों को नेत्र क्रीम या आंख बूंद की एक बूंद लागू करें। आंखों के शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान नम कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  8. शल्य साइट 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा खोपड़ी पर त्वचा, को betadine समाधान लागू करने के लिए बाँझ कपास swabs का उपयोग कीटाणुरहित। बारी betadine और 2 से अधिक बार की सफाई 70% इथेनॉल प्रदर्शन करते हैं।

6. सर्जरी और आसव

  1. खोपड़ी के midline में एक 2-3 मिमी चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें, और फिर खोपड़ी, मील का पत्थर के बाण के समान सिवनी, पर्वबिन्दु, और लैम्ब्डा बेनकाब करने के लिए 1.0-1.5 सेमी चीरा लाइन का विस्तार करने के लिए एक सीधी ठीक कैंची का उपयोगstereotaxic निर्देशांक के आधार पर कर रहे हैं, जो एस। अलग त्वचा रखने के लिए माइक्रो clamps का प्रयोग करें।
    नोट: शीर्षस्थान और लैम्ब्डा पदों पर माउस ब्रेन एटलस "stereotaxic निर्देशांक में माउस ब्रेन" 14 में समझाया जाता है।
  2. एक कपास झाड़ू ले लो बाँझ खारा में लेना, और खोपड़ी को साफ करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं। फिर, खोपड़ी सुखाने के लिए एक साफ सूखी कपास झाड़ू का उपयोग करें।
  3. शीर्षस्थान पर बिंदी चिह्नित करने के लिए एक बाँझ ठीक प्वाइंट पेन का प्रयोग करें। सुई की नोक सिर्फ शीर्षस्थान पर डॉट को छू लेती है, ताकि हैमिल्टन सिरिंज की स्थिति के लिए stereotaxic micromanipulator का प्रयोग करें।
    1. DV के समन्वय रिकॉर्ड।
    2. खोपड़ी के एपी अक्ष स्तर सुई की नोक लैम्ब्डा बिंदु को छू लेती है, ताकि पीछे हैमिल्टन सिरिंज के लिए कदम है की जाँच करने के लिए।
    3. DV इस स्थिति को रिकॉर्ड है। 0.5 मिमी के भीतर कर रहे हैं DV शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के लिए निर्देशांक सुनिश्चित करें।
      नोट: लक्ष्य शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के बीच DV के फर्क को कम से कम करने के लिए है।
  4. एम का प्रयोग करेंicromanipulator पर्वबिन्दु डॉट वापस करने के लिए हैमिल्टन सिरिंज सुई की नोक पर लौटने के लिए।
  5. शुरू करने एपी स्थिति रिकॉर्ड।
  6. समन्वय शुरू करने एपी से 2.00 मिमी घटाकर समाप्त होने एपी स्थिति की गणना।
  7. समन्वय अंतिम एपी के हैमिल्टन सिरिंज सुई का स्थान micromanipulator का प्रयोग करें।
  8. वर्तमान एमएल समन्वय रिकॉर्ड।
  9. बाएं गणना और सही एमएल समाप्त होने जोड़ने या समन्वय एमएल प्रारंभ होने से 1.3 मिमी घटाकर की समन्वय करता है।
  10. न खत्म होने वाली एमएल समन्वय के लिए या तो हैमिल्टन सिरिंज सुई ले जाने के लिए micromanipulator का प्रयोग करें।
    1. दोनों समाप्त होने एमएल निर्देशांक पर खोपड़ी की सतह के लिए सुई की नोक स्पर्श करें और डीवी निर्देशांक रिकॉर्ड और मूल्यों में 0.5 मिमी के भीतर कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
      नोट: लक्ष्य एमएल निर्देशांक समाप्त होने से दोनों के बीच में DV का अंतर कम करने के लिए है।
    2. एक को समाप्त पर खोपड़ी पर ऊपर 0.5-1 सेमी सुई खींच समन्वय है। वें पर एक बिंदु चिह्नित करने के लिए एक बाँझ ठीक बिंदु कलम ले लोखोपड़ी के ई सतह। खोपड़ी के प्रतिपक्षी पक्ष के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  11. जिस तरह से बाहर स्पष्ट हैमिल्टन सिरिंज घुमाओ।
  12. ड्रिल करने के लिए 0.8 मिमी ड्रिल सिर संलग्न। दोनों हाथों से ड्रिल लो स्थिरता के लिए टेबल की सतह पर कोहनी सेट, और बाईं या दाईं एमएल या तो समन्वय पर Sharpie डॉट से थोड़ा ऊपर ड्रिल सिर की स्थिति। खोपड़ी में एक छेद शुरू करने की खोपड़ी की सतह पर ड्रिल टिप के निचले हिस्से, ड्रिल को सक्रिय करें। प्रतिपक्षी पक्ष के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    नोट: कुछ खून बह रहा है नव शुरू छेद से हो सकती है। फिर वहाँ से खून बह रहा है, तो रक्त थपका करने के लिए एक साफ सूखी कपास झाड़ू का उपयोग करें।
  13. नव शुरू एमएल छेद में से किसी पर वापस स्थिति में हैमिल्टन सिरिंज ले जाएँ। सिर्फ खोपड़ी अतीत हैमिल्टन सुई लोअर। इस बिंदु पर मस्तिष्क पंचर करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। सुनिश्चित करने के लिए सुई सुर खोपड़ी अपने सूचकांक उंगली लेने के लिए और धीरे बनाने के लिए खोपड़ी के खिलाफ सुई धक्का बीत चुका हैई सुई के छेद से बाहर निकलने नहीं करता है।
  14. शुरू करने के लिए DV समन्वय रिकॉर्ड।
  15. न खत्म होने वाली है DV शुरू करने के लिए DV समन्वय से 2.2 मिमी घटाकर समन्वय की गणना।
  16. समन्वय नीचे समाप्त होने के लिए DV सुई लोअर।
  17. 0.5 μl / मिनट की दर से दांतेदार गाइरस में Aβ 1-42 के 4 μl पंप करने के लिए stereotaxic इंजेक्टर पंप को सक्रिय करें।
  18. निषेचन के पूर्ण होने पर सुई इंजेक्शन साइट के बाहर समाधान की backflow को कम से कम करने के लिए एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए जगह में रहते हैं।
  19. मस्तिष्क के दूसरे पक्ष के लिए सुई ले जाएँ और 6.13-6.18 चरणों को दोहराएँ।

7. पशु निकालना और पश्चात की देखभाल

  1. कान सलाखों और चेहरा / नाक गार्ड खोल देना। तंत्र से माउस निकालें।
  2. खोपड़ी को बंद खींचने के लिए और फिर सीवन के साथ घाव सील करने के लिए एक छात्र के मानक स्वरूप संदंश का प्रयोग करें।
  3. जलयोजन के लिए आईपी के माध्यम से माउस में बाँझ खारा के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन।
  4. मेंJECT buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously दर्द को दूर करने के लिए।
  5. यह उठता है जब तक 42 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली के शीर्ष पर सेट साफ खाली पिंजरे में माउस को बनाए रखना है, तो पर्याप्त भोजन और पानी के साथ अपने आवास पिंजरे के लिए यह वापसी।
  6. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से दर्द से राहत के लिए 3 दिनों के लिए हर 12 घंटा buprenorphine प्रशासन।

8. सिवनी निकालना

  1. आईपी ​​से 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा xlyazine पर ketamine / xylazine कॉकटेल के साथ माउस anesthetize। नोट: यह 7-10 दिनों सर्जरी के बाद किया जाता है।
  2. सीवन को हटाने के लिए एक छात्र के मानक स्वरूप संदंश और सीधे ठीक कैंची का प्रयोग करें।
  3. जलयोजन के लिए आईपी के माध्यम से माउस में बाँझ खारा के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन।
  4. यह उठता है जब तक 42 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली के शीर्ष पर सेट एक साफ खाली पिंजरे में माउस बनाए रखें, और उसके बाद पर्याप्त भोजन और पानी के साथ अपने आवास पिंजरे के लिए यह वापसी।

9. पशु बलि और ऊतक प्रसंस्करण

  1. माउस और पी चतनाशून्य, 4% paraformaldehyde के 15 के साथ यह erfuse मस्तिष्क को हटा दें, और 16 cryosectioning के लिए यह प्रक्रिया।
    नोट: पशु बलि के समय प्रयोगकर्ता पर निर्भर करता है। हालांकि, हमारे अध्ययन के लिए हम 7 और 14 दिनों के बाद सर्जरी चुना है।

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Representative Results

मानव पुनः संयोजक oligomeric Aβ 1-42 तैयारी की वर्तमान पद्धति मोनोमर्स, dimers, trimers, और tetramers (चित्रा 1 ए) से मिलकर घुलनशील oligomeric प्रजातियों की पैदावार। ये कम आणविक भार Aβ 1-42 प्रजातियों, लेकिन नहीं तंतुओं और सजीले टुकड़े, न्यूरॉन्स 1,4,9,17-19 करने के लिए सबसे जहरीले होने के लिए कई सेटिंग्स में दिखाया गया है। Oligomeric Aβ 1-42 माउस मस्तिष्क में Aβ 1-42 न्यूरॉन मौत लाती है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए (100 माइक्रोन शेयर समाधान के 4 μl) 9 महीने पुराने जंगली प्रकार C57BL में से एक गोलार्द्ध में हिप्पोकैम्पस के महानिदेशक में संचार कर रहा था / 6J चूहों। C57BL / 6J के लिए एक हिप्पोकैम्पस के वजन के आसपास 0.018 छ होने का अनुमान है और इसलिए Aβ 1-42 के वितरण के लगभग 100 माइक्रोग्राम / छ था। Aβ 1- भंग में इस्तेमाल DMSO के बराबर मात्रा के शामिल है - जो एक ही माउस मस्तिष्क के प्रतिपक्षी महानिदेशक एक नियंत्रण / वाहन समाधान के साथ संचार किया गया था42 (1x) पीबीएस में पतला - तुलना के लिए। जैसा कि पहले उल्लेख तले या Aβ रिवर्स के रूप में हम पहले से हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 1 पर कोई प्रभाव नहीं पाया के बाद से 1-42 पेप्टाइड तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। मस्तिष्क में सुई की शुरूआत स्थानीय ऊतकों को नुकसान (चित्रा 1 बी) बनाता है और हम के बाद इंजेक्शन प्रदर्शन करने का विकल्प चुना अंतिम महानिदेशक पतन का कारण बनता है ऊतक के रूप में अभी भी बरकरार है, जहां इंजेक्शन पथ से सटे विश्लेषण करती है। Aβ 1-42 इंजेक्शन के 1 सप्ताह के भीतर महानिदेशक आणविक परत और इंजेक्शन साइट (2A चित्रा) के आसपास के क्षेत्र में बहुरूपी सेल परत में ऊंचा Aβ 1-42 के स्तर का प्रदर्शन किया। Aβ 1-42 (चित्रा 2 बी) के neurodegenerative प्रभाव की पुष्टि, 7 और 14 दिनों में Aβ 1-42 TUNEL के पॉजिटिव धुंधला में बढ़ जाती हासिल और महानिदेशक मोटाई में कम हो जाती है।

बीएफ कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स महानिदेशक को परियोजना की वजह सेमहानिदेशक में न्यूरॉन नुकसान बीएफ अध: पतन का घोड़ा अगर हिप्पोकैम्पस के हम अगले निर्धारित की। इस अध्ययन के लिए एक प्रतिगामी अनुरेखक fluorogold (2% निलंबन) के सह-इंजेक्शन के महानिदेशक में Aβ 1-42 के साथ था। इंजेक्शन fluorogold के बाद 7 दिनों कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के माध्यम से लेबल के प्रतिगामी परिवहन के सुझाव बीएफ (चित्रा -2) में पाया गया था। इस न्यूरोनल टर्मिनलों महानिदेशक में Aβ 1-42 से अवगत कराया गया है कि इंगित करता है क्योंकि इसलिए, बीएफ में मात्रा का ठहराव के प्रयोजन के लिए हम fluorogold पॉजिटिव न्यूरॉन्स चुना है। डीजी Aβ 1-42 अर्क निम्न दोनों 1 और 2 हफ्तों में, विकर्ण बैंड के नाभिक - कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स महानिदेशक को परियोजना जहां बीएफ की एक उपप्रदेश - Aβ 1-42 -injected साइट पर ipsilateral TUNEL के धुंधला में बढ़ जाती है का प्रदर्शन और कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स (चित्रा 2 डी) में कम हो जाती है। बीएफ में मनाया न्यूरॉन नुकसान विनाशकारी जोड़ने पिछले अध्ययनों की पुष्टिबीएफ हिप्पोकैम्पस मार्ग 1,10 करने के लिए Aβ 1-42 का प्रभाव। यह नियंत्रण / वाहन समाधान TUNEL के धुंधला में आगे बढ़ जाती थे और महानिदेशक में इंजेक्ट किया गया था, जहां विकर्ण बैंड के नाभिक की तरफ 1 सप्ताह का समय बात करने के लिए 2 सप्ताह का समय बिंदु की तुलना से भी ध्यान दें कि महत्वपूर्ण है कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स (चित्रा 2 डी, तालिका) में कम हो जाती है। ये परिणाम सुई की वजह से शारीरिक आघात करने के लिए योगदान देता है जिसका अर्थ है कि 2 पोस्ट इंजेक्शन समय बिंदुओं के बीच तुलना वाहन इंजेक्ट पक्ष के महानिदेशक में TUNEL के पॉजिटिव लेबलिंग (चित्रा 2B, तालिका) में महत्वपूर्ण GCL मोटाई में कम हो जाती है और बढ़ जाती है को प्रतिबिंबित समय के साथ अध: पतन। यहां तक कि सुई के इस अवांछनीय पक्ष प्रभाव के साथ, Aβ 1-42 की neurodegenerative प्रभाव अभी भी नियंत्रण / वाहन समाधान (चित्रा 2 डी) के उन लोगों की तुलना में काफी अधिक हैं। साथ में ले ली, वर्तमान अर्क मॉडल effectivelY अल्पकालिक Aβ 1-42 उत्तेजना अध्ययन करने के लिए यह एक आकर्षक मॉडल बनाने के 7 दिनों के भीतर माउस मस्तिष्क में Aβ 1-42 के जहरीले प्रभाव reproduces।

चित्र 1
चित्रा 1. Oligomeric Aβ 1-42 तैयारी और माउस मस्तिष्क इंजेक्शन पथ दृश्य। (ए) 2 माइक्रोन Oligomeric Aβ 1-42 10-20% tricine जेल पर अलग और nitrocellulose झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया था। झिल्ली Aβ 1-42 एंटीबॉडी 6E10 (: 1,000 1) के साथ मिट गया था। (बी) Aβ 1-42 या नियंत्रण / वाहन (100 माइक्रोन समाधान के 4 μl) 9 महीने पुरानी C57BL / 6J चूहों की, क्रमशः, हिप्पोकैम्पस के बाएँ और दाएँ महानिदेशकों में संचार किया गया था। चूहे 7 दिनों के लिए बच गया। दिमाग क्रमानुसार अनुभाग के अनुसार 20 माइक्रोन से कम sectioned थे। Hippocampal वर्गों DAPI के लिए दाग रहे थे। हैश निशान को दर्शातीइंजेक्शन पथ। तीर महानिदेशक ढह दिखा। पैमाने बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Oligomeric Aβ 1-42 महानिदेशक और बीएफ में न्यूरॉन मौत लाती है। नियंत्रण / वाहन या AΒ 1-42 (100 माइक्रोन समाधान के 4 μl) 9, क्रमशः, हिप्पोकैम्पस के बाएँ और दाएँ महानिदेशकों में संचार किया गया था महीने पुराने C57BL / 6J चूहों। चूहे या तो 7 या 14 दिनों के लिए बच गया। दिमाग क्रमानुसार अनुभाग के अनुसार 20 माइक्रोन से कम sectioned थे। (ए) के 7 दिन (: 2,000 1, NU4 एंटीबॉडी) Aβ 1-42 के लिए दाग इंजेक्शन हिप्पोकैम्पस वर्गों के बाद। एमएल, आणविक परत; GCL, नाड़ीग्रन्थि सेल परत; पीसीएल, बहुरूपी सेल परत। पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी (सी) वाहन या Aβ 1-42 fluorogold (2% समाधान) के साथ सह-इंजेक्शन। Fluorogold लेबलिंग बीएफ 7 दिनों के बाद इंजेक्शन में निर्धारित की। बीएफ युक्त स्लाइड्स बेतरतीब ढंग से चुने गए हैं। Fluorogold लेबलिंग हित के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ब्याज के क्षेत्र में पहचान की थी एक बार आसन्न मस्तिष्क के स्लाइस ब्याज की मार्करों के लिए दाग इस्तेमाल किया गया। insets (डी) में छवियों को चुना जाता है, जिसमें क्षेत्र हैं। पैमाने बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (: 100, बकरी पॉलीक्लोनल 1) या TUNEL के (डी) 7 या 14 दिनों चैट के लिए दाग इंजेक्शन बीएफ वर्गों के बाद। *** पी <0.001 1 सप्ताह की तुलना में। * पी <0.05 वाहन की तुलना में। मात्रा पूरे क्षेत्र पर किया गया थाब्याज की। औसत दर्जे का पट और विकर्ण बैंड के बीच की सीमा पूर्वकाल संयोजिका के स्थान पर आधारित चित्रित किया जाता है। पैमाने बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (एन = 5 चूहों)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

1) सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करें;: प्रयोगकर्ता या सर्जन चाहिए एक सफल Aβ 1-42 इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए 2) सही ढंग से सटीक निर्देशांक के साथ ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान; 3) ठीक से एपी और एमएल अक्ष में लगाए मस्तिष्क के साथ stereotaxic फ्रेम में माउस सुरक्षित करने में सक्षम हो सकता है; 4) परिशुद्धता के साथ micromanipulator संचालित करने की क्षमता है; 5) उचित पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल करता है। इन महत्वपूर्ण कदम का पालन कर रहे हैं माउस कोई नमूदार संक्रमण के साथ सर्जरी के जीवित रहने चाहिए।

इन विट्रो के साथ समझौते में अध्ययन, और हम दूसरों Aβ 1-42 सीधे हिप्पोकैम्पस में संचार ईस्वी के प्रमुख विशेषताओं में से एक का चित्रण, न्यूरॉन मौत 1,4,9,10 elicits दिखाया है। अध: पतन 1 के लिए मार्कर में वृद्धि से पूरित है कि दांतेदार गाइरस की मात्रा में कमी आई एक रूप में दिखाया द्वारा अध: पतन इंजेक्शन स्थल के आसपास के क्षेत्र में स्पष्ट रूप से स्पष्ट है। इसके अलावा, टीवह कोलीनर्जिक लेबलिंग में कमी और बीएफ 1,10 में TUNEL के पॉजिटिव धुंधला में वृद्धि के रूप में दिखाया गया हिप्पोकैम्पस के लिए परियोजना न्यूरॉन्स कि एक प्रतिगामी फैशन में मरने कोलीनर्जिक। इसलिए, यह इन विवो मॉडल स्थानीय स्तर पर Aβ 1-42 की अर्द्ध तीव्र प्रभाव की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है। इस इंजेक्शन मॉडल के प्रमुख लाभ अपनी गतिशील स्वभाव है: किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र को निशाना बनाया जा सकता है और अलग-अलग आयु वर्ग के जानवरों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 9 माह पुराने नर चूहों हम बेहतर बड़े चूहों में Aβ 1-42 स्तर में वृद्धि, क्योंकि उनका मानना ​​हमारे प्रयोगों में चुना पुराने लोगों में पाया जाता है, जो रोग simulates गया। इसके अलावा, हम एक ही उम्र के चूहों का उपयोग करके लगातार प्रयोगों रखने के उद्देश्य। हालांकि, किसी भी उम्र के चूहों इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अतीत में हम 16 महीने पुराने थे कि चूहों पर प्रयोग किया है और दूसरों को 9,10 पुराने 2 महीने के थे कि चूहों का इस्तेमाल किया है। केवल नर चूहों मादा चूहों प्रदर्शनी ESTRO के रूप में अध्ययन में इस्तेमाल किया जाना चाहिएजनरल स्तर के उतार चढ़ाव और एस्ट्रोजन न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव 20 पास करने के लिए जाना जाता है। Aβ 1-42 के रोग प्रभाव भर के कई अनुसंधान के हितों केंद्र हालांकि, यह भी कम या शारीरिक Aβ 1-42 स्तरों सीखने और स्मृति 21,22 के लिए सामान्य कार्य के लिए आवश्यक हैं कि वहाँ सबूत है। इन अध्ययनों में जांचकर्ताओं Aβ 1-42 की एकाग्रता इंजेक्ट उतारा और प्रभावी ढंग से इस प्रतिमान की उपयोगिता के गतिशील स्वभाव का एक और उदाहरण खुलासा, हिप्पोकैम्पस 22,23 में संचार। सफलतापूर्वक stereotaxically संचार किया गया है कि अन्य यौगिकों कोशिका मृत्यु / अस्तित्व से पशुओं के व्यवहार को लेकर विभिन्न प्रभाव की जांच करने के लिए दवाओं, वायरस, siRNA, एंटीबॉडी, और पेप्टाइड्स 1,22-26 शामिल हैं। इस प्रकार, इस अर्क प्रतिमान को रोजगार के लिए कई आवेदन कर रहे हैं।

वर्णित अर्क कार्यप्रणाली, वी के लिए विभिन्न क्षमता का प्रदर्शन करते हुएइवो, इस तकनीक का उपयोग अध्ययनों से यह भी निहित सीमाओं के साथ आता है। सबसे पहले, इस मॉडल को केवल एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र में Aβ 1-42 के प्रभाव को पुन: पेश करने के लिए प्रयास करता है। दूसरा, इंजेक्शन साइट मस्तिष्क में एक सुई की शुरूआत से क्षतिग्रस्त है। इस अतिरिक्त कोशिका मृत्यु और gliosis करने के लिए योगदान देता है। इसलिए, विश्लेषण इंजेक्शन पथ से दूर प्रदर्शन किया जा रहा है। एक ही मस्तिष्क की contralateral ओर उपयुक्त वाहन पर नियंत्रण के साथ इस ऊतक आसपास करने के लिए इंजेक्शन वाहन और Aβ 1-42 समाधान प्रसार के रूप में एक समस्या नहीं होनी चाहिए। बीएफ कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स हिप्पोकैम्पस के लिए परियोजना क्योंकि तीसरा, सुई (चित्रा 1 बी) द्वारा महानिदेशक के पतन के द्वारा स्पष्ट रूप हिप्पोकैम्पस की शारीरिक क्षति अनजाने कुछ BFCNs मार सकता है। सौभाग्य से, अल्पावधि में neuronal circuitry के परीक्षण कर रहा है - एक एकल शॉट लगाने की 1 सप्ताह के भीतर - हमारे डेटा वृद्धि हुई पता चलता है कि एक के बाद से समस्या उत्पन्न नहीं करताबेसल अग्रमस्तिष्क में कोलीनर्जिक मौत Aβ 1-42 का नतीजा है और न सुई के आघात से; नियंत्रण इंजेक्शन उचित विश्लेषण प्रदान करते हैं। डेटा इन न्यूरॉन्स उनके अन्तर्ग्रथनी लक्ष्य (चित्रा 2 बी) खोने के रूप में महानिदेशक के अध: पतन भी बीएफ कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान के लिए आवश्यक है कि सलाह देते हैं। दुर्भाग्य से, 2 सप्ताह तक जीवित जानवरों के लिए वाहन इंजेक्ट पक्ष की शारीरिक आघात से उत्पन्न दांतेदार गाइरस के अध: पतन और thinning के कारण भाग में प्रतीत होता है कि 1 सप्ताह के बाद वाहन इंजेक्शन के पशुओं पर BFCN मौत के महत्वपूर्ण ऊंचाई से पता चलता है सुई। हालांकि, यहां तक कि इस स्तर पर डेटा Aβ 1-42 -injected साइट के लिए बीएफ ipsilateral में काफी अधिक मौत होती है पता चलता है। चौथा, सूक्ष्म शारीरिक सीमाओं की पहचान के लक्ष्य को हासिल करने के लिए मुश्किल हो सकता है। उदाहरण के लिए, औसत दर्जे का पट और विकर्ण बैंड के बीच की सीमा निर्धारित पूर्वकाल के स्थान पर आधारित थासंयोजिका था, एक तकनीक है कि पहले से 27 में वर्णित है। इसके अलावा, ipsilateral बीएफ कोलीनर्जिक न्यूरोनल प्रक्षेपण की वजह से - मुख्य रूप से औसत दर्जे का पट और विकर्ण बैंड (एमएस / डीबी) के ऊर्ध्वाधर अंग से - हिप्पोकैम्पस 12,28,29 के दांतेदार गाइरस करने के लिए हम Aβ साथ एक गोलार्द्ध इंजेक्षन करने का निर्णय लिया 1-42 और तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में विपरीत गोलार्द्ध का उपयोग करें। यह इस प्रतिमान के लिए एक चिंता का विषय बाएँ और दाएँ एमएस / डीबी को अलग सीमा के समुचित पहचान के लिए किया जाएगा कि बोधगम्य है। एमएस midline के क्षेत्र में है जबकि, डीबीएस अधिक पार्श्व हैं। इस मौजूदा काम और हमारे सबसे हाल ही में प्रकाशन 1 के लिए हम आराम से छोड़ दिया और सही डीबी भेद करने में सक्षम थे। हमारी मात्रा का ठहराव चैट (+) न्यूरॉन्स Aβ 1-42 -injected पक्ष में DB में लगभग 25% की कमी का पता चलता है। हालांकि, हम एमएस 1 में कोई महत्वपूर्ण चैट में परिवर्तन (+) न्यूरॉन्स का पता नहीं चला। क्योंकि पार्श्व नियंत्रण रेखा कीडीबीएस के व्यावहारिक और परिवर्तन हम हम एक ही जानवर के भीतर वाहन और Aβ 1-42 इंजेक्शन को रोजगार के लिए उचित थे महसूस किया मनाया। इसके अलावा, एक ही जानवर के भीतर 2 अलग प्रयोगात्मक शर्तों का परीक्षण जानवर के उपयोग को अधिकतम सीमा तक ही नहीं बल्कि संभावित पशु-से-जानवर परिवर्तनशीलता कम कर देता है। हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन हमें यह कल्पना है बाएँ और दाएँ गोलार्द्धों तुलना करने के लिए अनुमति देता है, जबकि औसत दर्जे का पट अध्ययन का मुख्य फोकस है, तो इस तुलना तकनीक, यानी भविष्य के अध्ययनों में संभव नहीं हो सकता। ऐसे मामले में प्रत्येक जानवर एक प्रयोगात्मक हालत के रूप में काम करना होगा। इसलिए, पशुओं के उपयोग प्रयोगकर्ताओं के विवेक पर है। पांचवां, वर्तमान इंजेक्शन मॉडल इस तरह के व्यवहार के रूप में अन्य पठन-बहिष्कार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है? वर्तमान Aβ 1-42 इंजेक्शन मॉडल को रोजगार में हमारा उद्देश्य विवो में Aβ 1-42 की नयूरोपथोलोगिकल प्रभाव का आकलन और इन विट्रो निष्कर्षों 1 करने के लिए यह तुलना करने के लिए किया गया था (चित्रा 1 बी और 2 बी) मनाया के बाद उदाहरण के लिए, महानिदेशक के विनाश अनपेक्षित व्यवहार असामान्यताओं को जन्म दे सकता है। एक अध्ययन हिप्पोकैम्पस पर निर्भर व्यवहार पर Aβ 1-42 के प्रभाव की जांच की आवश्यकता है इसलिए, अगर है, तो इंजेक्शन लक्ष्य हिप्पोकैम्पस के पास repositioned के बजाय इसमें सीधे और हिप्पोकैम्पस में फैलाना Aβ 1-42 की अनुमति देने होना पड़ सकता है। यही व्यवहार के परीक्षण के लिए वर्तमान इंजेक्शन प्रतिमान का उपयोग संभव है, लेकिन कहा कि और अधिक परीक्षण की आवश्यकता हैआईएनजी और लक्षण, और अंतिम प्रयोगात्मक रणनीति अंत उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाएगा। दिलचस्प है, सीधे मस्तिष्क में Aβ 1-42 के बाहरी वितरण शामिल है कि पूर्व कृंतक व्यवहार का अध्ययन किया गया है। 22,30 साथ में ले ली, इन सीमाओं के इस मॉडल को रोजगार विवो माउस अध्ययन में जब डिजाइनिंग विचार किया जाना चाहिए।

कोई अस्तित्व में एक माउस मॉडल को विज्ञापन की सम्पूर्ण रोग प्रभाव कैप्चर करता है के बाद से stereotaxic Aβ 1-42 निषेचन तकनीक विवो Aβ 1-42 माउस मॉडल में एक विकल्प के साथ प्रयोगकर्ताओं प्रदान करता है। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्ति द्वारा निष्पादित जब इस मॉडल को एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र या circuitry पर Aβ 1-42 के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित लघु अवधि के अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

इस काम के मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित और स्ट्रोक अल्जाइमर रोग अनुसंधान वित्त पोषित उम्र बढ़ने पर (CMT के लिए) NS081333, अल्जाइमर एसोसिएशन अनुदान NIRG-10-171721 और (उह करने के लिए) मानसिक स्वास्थ्य अनुदान MH096702 के राष्ट्रीय संस्थान, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ अनुदान दिया गया था (YYJ और जेबी के लिए) कोलंबिया विश्वविद्यालय पायलट अनुदान AG008702 पर केंद्र।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine HCl (100 mg/ml) Henry Schein Medical 1049007 100 mg ketamine per 1 kg animal
Xylazine (20 mg/ml) Henry Schein Medical not available 10 mg xylazine per 1 kg animal
Buprenex (0.3 mg/ml) Henry Schein Medical 1217793 0.1 mg buprenex per 1 kg animal
Aβ1-42 David Teplow/UCLA not available 100 μM; This amyloid was used in the paper
Aβ1-42 Bachem H-1368 Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Aβ1-42 American Peptide 62-0-80B Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Scrambled Aβ1-42 American Peptide 62-0-46B Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) Gift from William Klein/Northwestern U. not available 1:2,000 dilution
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody  (Polyclonal Rabbit) EMD Millipore AB9234 May be used in place of Nu4; needs to  be tested by the end user
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) Biolegend sig-39320 1:1,000 dilution
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) Millipore AB144P 1:100 dilution
DeadEnd Fluorometric TUNEL system Promega G3250 Follow manufacturer's directions for use
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P36935 Use when coverslipping slides
Fluorogold Fluorochrome, LLC not available 2% solution
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-4 For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting
Novex 10-20% Tricine gel Life Technologies EC6625BOX For separating Aβ1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Life Technologies LC1675 For running 10-20% Tricine gels
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Life Technologies LC3675 For transferring 10-20% Tricine gels
SuperSignal Western Blot Enhancer Thermo Scientific 46640 For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm GE Healthcare Life Sciences 10402088 For transferring 10-20% Tricine gels
Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001 Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels
GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores
 
Name Company Catalog Number Comments
Refresh Optive Lubricant Eye Drops Allergan not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal
Betadine Stoelting 50998 For sanitizing and disinfecting
Round/Tapered Spatula  VWR 82027-490 For opening animal mouth
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) Fine Science Tools 18050-28 Optional; For keeping scalp skin apart during injection
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 14060-11 For cutting scalp
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Surgical Blade Fine Science Tools 10011-00 For making scalp incision
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 91100-12 For holding scalp closed during suturing
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201 For shaving hair
T/Pump Warm Water Recirculator  Kent Scientific  TP-700 For warming animal during surgery
Resusable Warmining Pad (5" x 10") Kent Scientific  TPZ-0510FEA For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery
Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor Stoelting 51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument Stoelting 51730 Can use this in place of Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotaxic Injector Stoelting 53311
Dry Glass Bead Sterilizer Stoelting 50287 For sterilizing stainless steel instruments
Sterile Surgical Drape (18" x 26") Stoelting 50981
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL Hamilton Company 7637-01 For brain injection; use different syringes for different solutions
29 G Needle, Small Hub RN NDL Hamilton Company 7803-06 For attaching to the Hamilton syringe for brain injection
1 ml BD Tuberculin Syringes VWR BD309659 For administering anesthesia and saline
30 G Needle (0.5") VWR BD305106 For administering anesthesia and saline
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) VWR 65500-202 For weighing animals to determine anesthesia dose
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) VWR 47751-148 For warming animals post-surgery
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm Covidien S1173 For closing wound
Vetbond Tissue Adhesive (3M) Santa Cruz Biotechnology sc-361931 Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators Fisher scientific 22-029-488 For cleaning and drying surgical wound
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific  12-550-15 For collecting brain sections
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm VWR 48393241 For mounting microscope slides
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm Fisher Scientific 194-2520 For sterilizing saline solution
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical Medline VIS1422SRL91 For marking coordinates on the skull

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References

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माउस हिप्पोकैंपस में Oligomeric Amyloid-बीटा की Stereotaxic आसव
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Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, … More

Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, M., Hengst, U., Troy, C. M. Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (100), e52805, doi:10.3791/52805 (2015).

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