Abstract
Alzheimers sygdom er en neurodegenerativ sygdom, der påvirker den aldrende befolkning. Et centralt neuropatologisk træk ved sygdommen er den overproduktion af amyloid-beta og aflejring af amyloid-beta plaques i hjernen regioner af de ramte individer. Gennem årene har forskerne skabt mange Alzheimers sygdom musemodeller, der forsøger at kopiere amyloid-beta patologi. Desværre kun de musemodeller selektivt efterligne sygdomstilstande funktioner. Neuronal død, en fremtrædende virkning i hjernen hos patienter med Alzheimers sygdom, er mærkbart mangler i disse mus. Derfor har vi og andre ansat en metode til direkte infusion opløselige oligomere arter af amyloid-beta - former for amyloid-beta, der har vist sig at være mest giftige for neuroner - stereotaksisk ind i hjernen. I denne rapport anvender vi mandlige C57BL / 6J mus til at dokumentere denne kirurgisk teknik til at øge amyloid-beta-niveauer i en udvalgt område af hjernen. Deninfusion mål er gyrus dentatus i hippocampus, fordi denne hjerne struktur, sammen med den basale forhjerne, der er forbundet med det cholinerge kredsløb, udgør en af de områder af degeneration i sygdommen. Resultaterne af opløftende amyloid-beta i den tandede gyrus via stereotaktisk infusion afsløre stigninger i neurontab i gyrus dentatus inden for 1 uge, mens der er en ledsagende stigning i celledød og cholinerg neuron tab i den lodrette led af det diagonale bånd af Broca af den basale forhjerne. Disse virkninger observeres op til 2 uger. Vores data tyder på, at den nuværende amyloid-beta infusion model giver en alternativ musemodel til at løse region specifik neuron død på kort sigt. Fordelen ved denne model er, at amyloid-beta kan være forhøjet i en rumlig og tidsmæssig måde.
Introduction
Amyloid plaque indskud, som er sammensat af amyloid-beta (Ap 1-42), er et centralt element i patologien af Alzheimers sygdom (AD). Talrige undersøgelser har vist, at høje eller toksiske niveauer af rekombinant oligomert AB 1-42 fremkalde neuronal død, synaptisk dystrofi, tab og dysfunktion; samt indlæring og hukommelse underskud 1-4. Hjerneregioner berørte inkluderer hippocampus, cortex, og subkortikale strukturer såsom basale forhjerne og amygdala 5,6. Til dato er der flere transgene musemodeller, der forsøger at simulere Ap 1-42 patologi af AD. Afhængigt af stammen disse dyr vise sig at være nyttige i behandlingen af udvalgte patologiske træk ved AD. Desværre, med undtagelse af 2 transgene linjer, APP23 og 5XFAD, disse mus aldrig replikere fuldt neuronal tab, et centralt aspekt af AD. Selv med den neuronale tab observeret i APP23 og 5XFAD, den neuronale død obseraba var subtile, alder afhængig, og isoleret til nogle få udvalgte områder 7,8.
Den direkte infusion af oligomert Ap 1-42 i vildtype mus hjerne giver en fremragende in vivo-model, som replikerer den neuronale død aspekt af amyloidopathy 1,9,10. I modsætning til de almindeligt anvendte transgene musemodeller den oligomere Ap 1-42 infusion model er ideel til akut opløftende Ap 1-42 niveauer i en rumlig og tidsmæssig måde. Fordelen ved at anvende vildtype-mus for denne model undgår potentielle erstatninger og bivirkninger fra mutationerne introduceret i transgene mus linjer. Tidligere undersøgelser har vist, at infusion af toksiske niveauer af Ap 1-42 i hippocampus fremkalder neurondød i nærheden af injektionsstedet inden for 1 uge 1. Øvrigt i overensstemmelse med den observation, at Ap 1-42 er toksisk for cholinerge neuroner 11 den basale forhjernecholinerge neuron (BFCN) population, der rager til hippocampus er faldet 20-50% inden for 7-14 dage efter beta-amyloid infusion 1,10 i mus, effektivt giver mulighed for undersøgelser af isolerede neuronal kredsløb i hjernen. Siden BFCN projekt ipsilaterally til tandede gyrus af hippocampus 12, for det meste kontrol / køretøj og oligomere Ap 1-42 løsninger kan injiceres på begge sider af hjernen giver sammenligninger mellem venstre og højre hjernehalvdel 1.
I denne rapport vil vi give en detaljeret kirurgisk og injektion metode til voksne vildtype C57BL / 6J mus. Denne musestamme er valgt på grund af sin omfattende brug i forskning. Teknisk set kan enhver hjerne region målrettes til infusion, men her vil vi bruge gyrus dentatus i hippocampus som målet at illustrere teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: For alle dyreforsøg, blev Institutionelle og nationale retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr fulgt.
1. Forbered kirurgiske instrumenter og løsninger for Kirurgi
- Autoklaver alle rustfrit stål kirurgiske instrumenter.
- Forbered 70% ethanol ved at fortynde 200 proof absolut ethanol med sterilt molekylærbiologisk kvalitet deioniseret destilleret vand.
- Fastgør 29 G nål til Hamilton-sprøjte. Rengør det indvendige af Hamilton sprøjte og kanyle ved at udarbejde og skubbe nanorent vand gentagne gange i 1 min. Gentag denne procedure med 70% ethanol.
- Fjern stemplet og nålen fra Hamilton-sprøjte. Lufttørre delene i en laminar flow hætte O / N.
- Bestråle nål og sprøjte med ultraviolet lys i 30 minutter inden brug.
- Forbered saltopløsning ved opløsning NaCl i vand af molekylærbiologisk kvalitet til en endelig vægt til volumen-koncentration på 0,9%. Sterilize opløsningen ved at filtrere det gennem 0,2 um porefilter.
2. Forbered Oligomert Ap 1-42
- Monomerize og resuspender rekombinant human AB 1-42 i DMSO til 5 mM nøjagtigt som beskrevet i offentliggørelsen af Fa «, og andre 13.
- Fortynd 5 mM Ap 1-42 med sterilt (1x) PBS til 100 uM på dagen før operation.
- Bland opløsningen godt ved triturering.
- Inkuber Ap 1-42 opløsning i 12 timer ved 4 ° C.
Bemærk: Kontrol løsninger såsom at fortynde DMSO i PBS eller krypteret / reverse Ap 1-42 peptid bør være forberedt på samme måde som Ap 1-42.
3. Bestem Injection Koordinater
- Brug de voksne mus hjerneatlas at bestemme den nøjagtige anterior-posterior (AP), medial-lateral (ML), og dorsal-ventrale (DV) koordinater for hjernen område af interesse 14.
Ingente: For at illustrere den teknik, vi plukket gyrus dentatus i hippocampus som målet med følgende koordinater fra bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. Den negative fortegnet AP værdi indikerer, at det er 2,00 mm posteriort for bregma. Den ± fortegnet ML værdi angiver venstre og højre retning fra midten. Endelig den negativt fortegn forud for DV indikerer det bevæger sig ventralt fra hjernens overflade.
4. stereotaktisk ramme Setup
- Bær en kirurgisk ansigtsmaske, ren kittel og sterile kirurgiske handsker.
- Tør stereotaktisk instrument og mus adapter med 70% ethanol ned.
- Fastsætte steril kirurgisk afdækningsstykke på disken.
- Placer stereotaktisk instrument med muse adapter på toppen af den sterile kirurgiske afdækningsstykke.
- Tør muse varmepude med 70% ethanol. Placer varmepude over stereotaktisk ramme sengen. Brug generelle formål laboratory mærkning bånd til bånd ned varmepude over museadapter sengen.
- Fastgør varmepude til det varme vand recirculator pumpe ifølge producentens anvisninger.
- Tænd for varmt vand recirculator pumpe og sæt temperaturen til 37 ° C, og derefter vente, indtil den når temperaturen.
- Anbringer 50 pi Hamilton-sprøjte med en 29 G nål på stereotaktisk ramme ved at skrue den på den motoriserede lodrette intravenøse aksel ifølge producentens anvisninger.
- Tænd perlen sterilizer og vente, indtil den når producentens forudindstillede temperatur.
Bemærk: Dette bruges til sterilisering af rustfrit stål instrumenter mellem dyr. Det tager 20 sek instrumenter for kontakt med perlerne for sterilisation. - Tænd varmeplade og sæt den til 42 ° C og placere en ren tom bur på toppen.
- Mens Hamilton sprøjte er fastgjort på stereotaktisk ramme bruge den motoriserede stereotaktisk injector udarbejde Ap 1-42 løsning.
Bemærk: Udarbejde mere end 4 ul af opløsningen i sprøjten og derefter bruge stereotaktisk injektor at indstille intravenøs lydstyrke. Betjene injektoren ifølge producentens anvisninger.
5. Animal Forberedelse
- Bestemme vægten af musen ved at bruge vejer skala.
- Bedøver mus med ketamin / xylazin cocktail ved 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin ved injektion intraperitonealt (IP). Overvåge dybden af bedøvelse ved tabet af tå knivspids refleks.
- Efter musen er bedøvet tager hårklipperen og barbere sit hoved til at udsætte huden over kraniet.
- Placer musen på toppen af varmepude på toppen af stereotaktisk sengen.
- Brug spatel til at åbne munden og placere fortænder inde i tænderne vagt. Fastgør næsestykket over ansigtet på musen. Klemme det ned forsigtigt og ikke for stramt.
- Position de bilaterale øre tværstænger i øregang for at sikre hovedet. Flytte hver overliggeren ind, indtil den rammer kraniet, og drej skruen for at låse den.
- For at sikre, hovedet er sikret bruge din pegefinger til forsigtigt at skubbe ned på hovedet. Hvis hovedet er ordentligt sikret, vil det ikke give ud eller flytte, når der trykkes.
- Påfør en dråbe øjencreme eller øjendråber til øjnene for at holde dem fugtige. Sørg for, at øjnene er fugtige hele det kirurgiske indgreb.
- At desinficere operationsstedet anvende sterile vatpinde til at anvende betadinopløsning til huden over kraniet, efterfulgt af 70% ethanol. Udfør vekslende betadine og 70% ethanol rengøring 2 gange mere.
6. Kirurgi og Infusion
- Brug en skalpel til at lave en 2-3 mm snit i midterlinjen af hovedbunden, og derefter bruge en straight fin saks til at forlænge snittet linje til 1,0-1,5 cm at afsløre den sagittale sutur, bregma, og lambda af kraniet, seværdigheds hvilke stereotaksiske koordinater er baseret på. Bruge mikro klemmer til at holde huden fra hinanden.
Bemærk: bregma og lambda positioner er forklaret i musehjernen atlas "musehjernen i stereotaktisk Koordinater" 14. - Tag en vatpind, lægges i sterilt saltvand, og bruge det til at rense kraniet. Brug derefter en ren tør vatpind til at tørre kraniet.
- Brug en steril fin spids pen til at markere en prik på bregma. Brug stereotaktisk mikromanipulator at placere Hamilton-sprøjte, således at spidsen af nålen netop rører prik på bregma.
- Optage DV koordinat.
- At kontrollere, om AP-aksen af kraniet er niveauet flytte Hamilton sprøjte posteriort så spidsen af nålen rører lambda punkt.
- Optage DV position. Sørg for, at DV koordinater for bregma og lambda er inden for 0,5 mm.
Bemærk: Målet er at minimere DV forskellen mellem bregma og lambda.
- Bruge micromanipulator at returnere Hamilton-sprøjte nålespidsen tilbage til bregma prik.
- Registrere start AP position.
- Beregn slutter AP position ved at trække 2,00 mm fra start AP koordinat.
- Brug mikromanipulator at flytte Hamilton-sprøjte nål til den endelige AP koordinat.
- Optag den aktuelle ML koordinat.
- Beregn venstre og højre slutter ML koordinater ved at tilføje eller fratrække 1,3 mm fra start ML koordinere.
- Brug mikromanipulator at flytte Hamilton-sprøjte nål til enten slutter ML koordinat.
- Tryk på nålespidsen til overfladen af kraniet på begge slutter ML koordinater og registrere DV koordinaterne og sørg værdierne er inden for 0,5 mm.
Bemærk: Målet er at minimere DV forskellen mellem de to slutter ML koordinater. - Mens han var på en slutning koordinere trække nålen op 0,5-1 cm over kraniet. Tag en steril fin spids pen til at markere en prik på the overflade af kraniet. Gentag dette trin for den kontralaterale side af kraniet.
- Tryk på nålespidsen til overfladen af kraniet på begge slutter ML koordinater og registrere DV koordinaterne og sørg værdierne er inden for 0,5 mm.
- Sving Hamilton sprøjte klar af vejen.
- Vedhæft 0,8 mm borehoved til boret. Tag boret med begge hænder, sæt albuerne på overfladen af bordet for stabilitet, og placer borehovedet lidt over Sharpie prik på enten venstre eller højre ML koordinat. Aktivere boret, sænkes borspids på kraniet overflade for at indføre et hul i kraniet. Gentag dette trin for den kontralaterale side.
Bemærk: Nogle blødning kan forekomme fra de nyligt indførte huller. Hvis der er blødning derefter bruge en ren tør vatpind til at duppe blodet. - Flyt Hamilton-sprøjte tilbage i position over en af de nyligt indførte ML huller. Sænk Hamilton nålen lige forbi kraniet. På dette tidspunkt skal passe på ikke at punktere hjernen. For at sikre, at nålen har passeret kraniet tage din pegefinger og skub forsigtigt nålen mod kraniet til at gøre sure nålen ikke forlade hullet.
- Optag start DV koordinat.
- Beregn slutter DV koordinere ved at fratrække 2,2 mm fra start DV koordinat.
- Sænk nålen ned til den slutter DV koordinat.
- Aktivere stereotaktisk injektor pumpe til at pumpe 4 pi Ap 1-42 i den tandede gyrus med en hastighed på 0,5 ul / min.
- Når infusionen er gennemført lade nålen forblive på plads i yderligere 1 min for at minimere tilbagestrømning af opløsning ud af injektionsstedet.
- Flytte nålen til den anden side af hjernen, og gentag trin 6,13-6,18.
7. Animal Fjernelse og Postoperativ pleje
- Skru øre barer og ansigt / næse vagt. Fjern musen fra apparatet.
- Brug en studerende standard mønster pincet til at trække lukke hovedbunden og derefter forsegle såret med sutur.
- Injicer 1 ml sterilt saltvand i musen via IP til hydrering.
- Ijekt buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutant til at lindre smerter.
- Bevar musen i den rene tomme bur sæt oven på 42 ° C varmeplade, indtil det vågner, derefter returnere det til sin bolig bur med rigelig mad og vand.
- Administrere buprenorphin via subkutan injektion hver 12 timer i 3 dage for smertelindring.
8. Sutur fjernelse
- Bedøver mus med ketamin / xylazin cocktail på 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xlyazine ved IP. Bemærk: Dette gøres 7-10 dage efter operationen.
- Brug en studerende standard mønster pincet og lige fine saks til at fjerne sutur.
- Injicer 1 ml sterilt saltvand i musen via IP til hydrering.
- Bevar musen i en ren tom bur sæt oven på 42 ° C varmeplade, indtil det vågner, og derefter returnere det til sin bolig bur med rigelig mad og vand.
9. Animal Sacrifice og Tissue Processing
- Bedøver musen og perfuse det med 4% paraformaldehyd 15, fjernes hjernen, og behandle det for cryosectioning 16.
Bemærk: Timingen af animalsk offer afhænger af forsøgslederen. , For vores studier vi valgte dog 7 og 14 dage efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreliggende fremgangsmåde til fremstilling af humant rekombinant oligomert Ap 1-42 giver opløselige oligomere species bestående af monomerer, dimerer, trimerer og tetramerer (figur 1A). Disse lavmolekylære Ap 1-42 arter, men ikke de fibriller og plakker, er blevet vist i talrige indstillinger for at være mest toksisk for neuroner 1,4,9,17-19. At afgøre, hvorvidt oligomere Ap 1-42 inducerer neurondød i musehjernen Ap 1-42 (4 pi 100 pM stamopløsning) blev infunderet i GD af hippocampus i en halvkugle af 9 måned gammel vildtype C57BL / 6J mus. Vægten af en hippocampus for C57BL / 6J skønnes at være omkring 0,018 g, og derfor leveringen af Ap 1-42 var ca. 100 pg / g. Den kontralaterale GD af samme musehjerne blev infunderet med en kontrol / bærestof løsning - som bestod af tilsvarende volumen af DMSO anvendt i opløsning Ap 1-42 fortyndet i (1x) PBS - til sammenligning. Som tidligere nævnt krypteret eller omvendt Ap 1-42 peptid kan anvendes som kontrol til sammenligning, da vi tidligere fundet nogen virkning på hippocampale neuroner 1. Indførelsen af nålen ind i hjernen skaber lokal vævsbeskadigelse (figur 1B) og forårsager eventuel GD sammenbrud vi valgt at udføre efter injektion analyser støder op til injektion tarmkanalen hvor vævet er stadig intakt. Inden for 1 uge Ap 1-42 injektion GD udviste forhøjede Ap 1-42 niveauer i den molekylære lag og det polymorfe cellelag i nærheden af injektionsstedet (figur 2A). Ved 7 og 14 dage Ap 1-42 fremkaldte TUNEL-positiv farvning og fald i GD tykkelse, hvilket bekræfter de neurodegenerative virkninger af Ap 1-42 (figur 2B).
Fordi BF cholinerge neuroner projicerer til GDaf hippocampus vi bestemt næste hvis neuron tab i GD udløser BF degeneration. Til denne undersøgelse et tilbageskridt sporstof Fluorogold (2% suspension) blev co-injiceret sammen med Ap 1-42 i GD. 7 dage efter injektion Fluorogold blev påvist i BF (figur 2C), hvilket tyder retrograd transport af etiketten via cholinerge neuroner. Derfor med henblik på kvantificering i BF vi valgte Fluorogold-positive neuroner, fordi det viser, at de neuronale terminaler blev udsat for Ap 1-42 i GD. Ved begge 1 og 2 uger efter GD Ap 1-42 infusion, kernen i den diagonale bånd - et underområde af BF, hvor cholinerge neuroner rager til GD - ipsilaterale til Ap 1-42 -injiceret websted udviste stigninger i TUNEL-farvning og fald i cholinerge neuroner (figur 2D). Den observerede neurontab i BF bekræfter tidligere undersøgelser, der forbinder den destruktivevirkninger af Ap 1-42 til BF-hippocampale reaktionsvej 1,10. Det er også afgørende at bemærke, at fra sammenligningen af to uger tidspunkt til 1 uge tidspunkt på den side af kernen i diagonale bånd, hvor kontrol / bilen opløsning blev injiceret i GD var der yderligere stigninger i TUNEL farvning og fald i cholinerge neuroner (figur 2D, tabel). Disse resultater afspejler signifikante fald i GCL tykkelse og stigninger i TUNEL-positive mærkning (figur 2B, tabel) i GD af den injicerede køretøjets side sammenligning mellem de 2 post-injektion tidspunkter, hvilket indebærer, at den fysiske traumer forårsaget af nålen bidrager til degeneration over tid. Selv med denne uønskede bivirkning af nålen, de neurodegenerative virkninger af Ap 1-42 er stadig signifikant større end dem i kontroldelen / bærestof-opløsning (figur 2D). Tilsammen den nuværende infusion model effectively gengiver de toksiske virkninger af Ap 1-42 i musehjernen indenfor 7 dage gør dette til en attraktiv model til at studere kortsigtede Ap 1-42 stimulering.
Figur 1. Oligomert Ap 1-42 forberedelse og musehjerne injektion tarmkanalen visualisering. (A) 2 uM Oligomert Ap 1-42 blev separeret på 10-20% tricin-gel og overført til nitrocellulosemembran. Membranen blev blottet med Ap 1-42 antistof 6E10 (1: 1.000). (B) Ap 1-42 (4 pi 100 pM opløsning) eller kontrol / køretøjet var infunderet i venstre og højre GD'er af hippocampus henholdsvis 9 måneder gamle C57BL / 6J mus. Mus blev overlevede i 7 dage. Hjerner blev serielt i snit på 20 um pr sektion. Hippocampale snit blev farvet for DAPI. Hash mærker skildrerinjektionen tarmkanalen. Pile viser kollapsede GD. Skalaen søjle repræsenterer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Oligomert Ap 1-42 inducerer neuron død i GD og BF. Kontrol / køretøj eller Ap 1-42 (4 pi 100 uM opløsning) blev infunderet i venstre og højre generaldirektorater i hippocampus, henholdsvis 9 måneder gamle C57BL / 6J-mus. Mus blev overlevet i enten 7 eller 14 dage. Hjerner blev serielt i snit på 20 um pr sektion. (A) 7 dage efter injektion hippocampale snit farvet for Ap 1-42 (NU4 antistof, 1: 2.000). ML, molekylær lag; GCL, ganglion cellelag; PCL, polymorf cellelag. Skalaen søjle repræsenterer 50 um. (B (C) Køretøj eller Ap 1-42 co-injiceret med Fluorogold (2% opløsning). Fluorogold mærkning bestemmes i BF 7 dage efter injektion. Objektglas indeholdende BF blev tilfældigt udvalgt. Fluorogold mærkning blev anvendt til bestemmelse af området af interesse. Når området af interesse blev identificeret tilstødende hjernen skiver blev anvendt til at farve for markører af interesse. De mellemværker er områder, hvor billeder i (D) er valgt. Skalaen søjle repræsenterer 200 um. (D) 7 eller 14 dage efter injektion BF sektioner farvet for ChAT (1: 100, ged polyklonale) eller TUNEL. *** P <0,001 sammenlignet med 1 uge. * P <0,05 sammenlignet med vehikel. Kvantificering blev udført på hele regionenaf interesse. Grænsen mellem det mediale septum og den diagonale bånd er afgrænset baseret på placeringen af den forreste kommissur. Skalaen søjle repræsenterer 100 um. (N = 5 mus). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå en succesfuld Ap 1-42 injektion forsøgslederen eller kirurg skal: 1) Brug aseptisk teknik; 2) identificere hjernen område af interesse med nøjagtige koordinater korrekt; 3) være i stand til korrekt fastgøre musen i stereotaktisk ramme med hjernen nivelleret i AP og ML akse; 4) har evnen til at betjene mikromanipulator med præcision; 5) sikre korrekt postoperativ pleje. Hvis følges disse vigtige trin musen skulle overleve operationen med ingen observerbar infektion.
I overensstemmelse med in vitro undersøgelser har vi og andre vist, at Ap 1-42 direkte infunderes i hippocampus fremkalder neuron død 1,4,9,10, skildrer en af de vigtigste funktioner i AD. Degeneration er tydeligt i nærheden af injektionsstedet som vist ved en nedsat i mængden af den tandede gyrus, der suppleres af stigninger i markører for degeneration 1. Endvidere than cholinerge neuroner, der projicerer til hippocampus dø i en retrograd måde som vist ved et fald i kolinerg mærkning og en stigning i TUNEL-positiv farvning i BF 1,10. Derfor har dette in vivo-model tjener som en glimrende model til at undersøge de semi-akutte virkninger af Ap 1-42 lokalt. Den vigtigste fordel ved denne injektion model er dens dynamiske karakter: enhver hjerne region kan være målrettet og forskellige gamle dyr kan anvendes. 9 måneder gammel hanmus blev valgt i vores eksperimenter, fordi vi tror stigende Ap 1-42 niveauer i ældre mus bedre simulerer sygdom, der opstår hos ældre mennesker. Desuden er vi tilstræber at holde eksperimenterne konsekvent ved at bruge mus på samme alder. Imidlertid kunne mus i alle aldre anvendes til injektion. Tidligere har vi eksperimenteret på mus, der var 16 måneder gammel, og andre har brugt mus, der var to måneder gammel 9,10. Kun hanmus bør anvendes i undersøgelser som hunmus udstille Estrogen niveau udsving og østrogen er kendt for at have neurobeskyttende virkninger 20. Selv om mange forskningsinteresser centrum omkring de patologiske virkninger af Ap 1-42 er der også tegn på, at der kræves lave eller fysiologiske Ap 1-42 niveauer for normale funktioner for indlæring og hukommelse 21,22. I disse undersøgelser undersøgere sænkede koncentrationen af Ap 1-42 injiceret og infunderes det i hippocampus 22,23, effektivt afslører endnu et eksempel på den dynamiske karakter af anvendeligheden af dette paradigme. Andre forbindelser, som er blevet infunderet med succes stereotaxisk indbefatter lægemidler, vira, siRNA, antistoffer og peptider 1,22-26 at undersøge forskellige effekter lige fra celledød / overlevelse til dyrs adfærd. Der er således mange ansøgninger om at ansætte denne infusion paradigme.
Den beskrevne metode infusion, medens de udviser forskellige potentialer i vivo studerer ved hjælp af denne teknik, også kommer med iboende begrænsninger. Først denne model kun forsøger at reproducere virkningerne af AB 1-42 i en isoleret område af hjernen. Sekund, injektionsstedet beskadiget fra indførelsen af en nål ind i hjernen. Dette bidrager til yderligere celledød og gliose. Derfor analyse skal udføres væk fra injektionsstedet tarmkanalen. Med passende køretøj kontrol på den kontralaterale side af samme hjerne dette ikke bør være et problem som det injicerede køretøj og Ap 1-42 løsninger spredes til omkringliggende væv. Tredje fordi BF cholinerge neuroner rager til hippocampus, den fysiske beskadigelse af hippocampus som tydeligt ved sammenbruddet af GD af nålen (figur 1B), kan uforvarende dræbe nogle BFCNs. Heldigvis undersøger den neuronale kredsløb på kort sigt - inden for 1 uge af en enkelt-shot infusion - ikke udgør et problem, da vores data tyder på, at den øgedecholinerge død i den basale forhjerne er resultatet af Ap 1-42 og ikke fra traumet af nålen; kontrolinjektioner tilvejebringe den passende analyse. Data tyder på, at degeneration af GD er også nødvendigt for tabet af BF cholinerge neuroner, da disse neuroner mister deres synaptiske mål (Figur 2B). Desværre, for dyr, der overlever op til 2 uger køretøjet injicerede side viser signifikant forhøjelse af BFCN død over 1 uge efter køretøj injicerede dyr, der synes at skyldes til dels degeneration og udtynding af gyrus dentatus følge af fysisk traume af nål. Selv på dette tidspunkt data tyder Men der er betydeligt mere død i BF ipsilateralt til Ap 1-42 -injiceret site. For det fjerde kan identificere subtile anatomiske grænser være vanskeligt at opnå. For eksempel blev grænsen mellem den mediale septum og den diagonale bånd bestemt baseret på placeringen af den forrestecommissure, en teknik, der var tidligere beskrevet 27. På grund af den ipsilaterale BF cholinerge neuronal projektion - hovedsageligt fra det mediale septum og den lodrette led af det diagonale bånd (MS / DB) - til gyrus dentatus i hippocampus 12,28,29 besluttede vi at injicere en halvkugle med Ap 1-42 og bruge den modsatte halvkugle som kontrol til sammenligning. Det er tænkeligt, at en bekymring for dette paradigme ville være den korrekte identifikation af grænsen adskille venstre og højre MS / DB. Mens MS er i midterlinjen region, DBS er mere lateral. Til denne aktuelle arbejde og vores seneste publikation 1 kunne vi mageligt skelne venstre og højre DB. Vores kvantificering afslører ChAT (+) neuroner falde med ca. 25% i BF i Ap 1-42 -injiceret side. Men havde vi ikke afsløre eventuelle væsentlige ændringer i chatten (+) neuroner i MS 1. På grund af den laterale location af DBs og ændringerne observerede vi følte, at vi var berettiget at ansætte køretøj og Ap 1-42 injektioner inden for samme dyr. Endvidere prøvning 2 forskellige eksperimentelle betingelser inden for samme dyr ikke blot maksimerer anvendelsen af dyret, men også reducerer potentiel fra dyr til dyr variabilitet. Mens vores eksperimentelle design giver os mulighed for at sammenligne venstre og højre hjernehalvdel er det tænkeligt denne sammenligning teknik kan ikke lade sig gøre i fremtidige undersøgelser, dvs, hvis det mediale septum er det vigtigste fokus i undersøgelsen. I så fald vil hvert dyr skal tjene som en eksperimentel betingelse. Derfor er brugen af dyr er på foranledning af eksperimentatorer. For det femte kan den nuværende injektion model anvendes til andre udlæsninger såsom adfærd? Vores formål med at ansætte den nuværende Ap 1-42 injektion model var at vurdere de neuropatologiske virkninger af AB 1-42 in vivo og sammenligne det med in vitro resultater 1 (figur 1B og 2B), når vi målretter kanylen ind i eller i nærheden af GD efter 7 dage ødelæggelsen af GD kan give anledning til utilsigtede adfærdsmæssige abnormiteter. Derfor, hvis en undersøgelse kræver undersøge effekten af Ap 1-42 på hippocampale-afhængige adfærd, så målet injektion kan have omplaceres nær hippocampus stedet for direkte ind i den og lade Ap 1-42 at diffundere ind i hippocampus. Det er sagt, brug af den nuværende injektion paradigme for opførsel test er mulig, men kræver mere testing og karakterisering, og den endelige eksperimentelle strategi vil blive bestemt af slutbrugeren. Interessant nok har der været tidligere gnaver adfærdsstudier der involverer ekstern levering af Ap 1-42 direkte ind i hjernen. 22,30 Tilsammen skal overvejes ved udformning in vivo undersøgelser under anvendelse af mus denne model disse begrænsninger.
Da ingen enkelt musemodel eksisteret indfanger de fulde patologiske virkninger af AD stereotaktisk Ap 1-42 infusion teknik giver eksperimentatorer med et alternativ in vivo Ap 1-42 musemodel. Når der udføres af en veluddannet person denne model er bedst egnet til korttidsundersøgelser med fokus på effekterne af AB 1-42 på en bestemt område af hjernen eller kredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Neurologiske og Stroke give NS081333 (til CMT), Alzheimers Association tilskud NIRG-10-171721 og National Institute of Mental Health tilskud MH096702 (til UH), og National Institute on Aging-finansierede Alzheimers sygdom Research Center på Columbia University pilot tilskud AG008702 (til YYJ og JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
