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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52805
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, 2The Taub Institute for Research on Alzheimer's Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, 3Department of Neurology, Columbia University Medical Center

Abstract

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la población que envejece. Una característica clave neuropatológico de la enfermedad es la sobre-producción de beta-amiloide y la deposición de placas de amiloide-beta en regiones del cerebro de los individuos afectados. A lo largo de los años los científicos han generado numerosos modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer que intentan replicar la patología amiloide-beta. Por desgracia, los modelos de ratón solamente imitan selectivamente las características de la enfermedad. La muerte neuronal, un efecto prominente en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer, se carece notablemente en estos ratones. Por lo tanto, nosotros y otros han empleado un método de infundir directamente especies oligoméricas solubles de beta-amiloide - formas de beta-amiloide que se han demostrado para ser más tóxico para las neuronas - estereotáxicamente en el cerebro. En este informe utilizamos machos C57BL / 6J para documentar esta técnica quirúrgica de aumento de los niveles de amiloide-beta en una región del cerebro seleccione. Losobjetivo de infusión es el giro dentado del hipocampo, porque esta estructura cerebro, junto con el cerebro anterior basal que está conectada por el circuito colinérgica, representa una de las áreas de degeneración en la enfermedad. Los resultados de la elevación de la beta-amiloide en el giro dentado mediante infusión estereotáxico revelan aumentos en la pérdida de neuronas en el giro dentado dentro de 1 semana, mientras que hay un incremento concomitante en la muerte celular y la pérdida de neuronas colinérgicas en el miembro vertical de la banda diagonal de Broca del cerebro anterior basal. Estos efectos se observan hasta 2 semanas. Nuestros datos sugieren que el actual modelo de infusión de amiloide-beta ofrece un modelo de ratón alternativa para hacer frente a la muerte de neuronas región específica en una base a corto plazo. La ventaja de este modelo es que el amiloide-beta puede ser elevado en una forma espacial y temporal.

Introduction

Depósitos de placa amiloide, que se componen de beta-amiloide (Aß 1-42), son una característica clave de la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Numerosos estudios han demostrado que los niveles elevados o tóxicos de oligomérica recombinante Aß 1-42 suscitar la muerte neuronal, distrofia sináptica, la pérdida y disfunción; así como los déficit de aprendizaje y memoria 1-4. Las regiones del cerebro afectadas incluyen el hipocampo, la corteza y las estructuras subcorticales tales como el cerebro anterior basal y el 5,6 amígdala. Hasta la fecha, hay varios modelos de ratones transgénicos que intentan simular la Aß 1-42 patología de la EA. Dependiendo de la cepa estos animales demuestran ser útiles para examinar seleccione características patológicas de la AD. Desafortunadamente, con la excepción de 2 líneas transgénicas, APP23 y 5XFAD, estos ratones no replicar completamente la pérdida neuronal, un aspecto clave de la EA. Incluso con la pérdida neuronal observada en APP23 y 5XFAD, la obser muerte neuronalved era sutil, dependiente de la edad, y aislada a una pocas regiones selectas 7,8.

La infusión directa de oligómeros Aß 1-42 en el cerebro del ratón de tipo salvaje proporciona un excelente modelo in vivo que reproduce el aspecto de la muerte neuronal en amyloidopathy 1,9,10. A diferencia de los modelos de ratones transgénicos utilizados comúnmente el modelo de infusión de Aß 1-42 oligomérica es ideal para la elevación aguda Aß 1-42 niveles de una manera espacial y temporal. La ventaja de usar los ratones de tipo salvaje para este modelo evita potenciales de compensación o los efectos secundarios de las mutaciones introducidas en líneas de ratones transgénicos. Estudios anteriores han demostrado que la infusión de niveles tóxicos de 1-42 en el hipocampo provoca la muerte de neuronas en la vecindad del sitio de inyección dentro de 1 semana 1. Además, en consonancia con la observación de que Aß 1-42 es tóxico para las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal 11 lacolinérgicos neurona (BFCN) población que se proyecta en el hipocampo se reduce un 20-50% dentro de 7 a 14 días después de beta-amiloide infusión de 1,10 en ratones, lo que permite de manera efectiva para los exámenes de circuitos neuronales aisladas en el cerebro. Desde proyecto BFCN ipsilateralmente para el giro dentado del hipocampo 12, para el control de la parte / vehículo y oligómeros Aß 1-42 soluciones más se puede inyectar a cada lado del cerebro que permite realizar comparaciones entre los hemisferios derecho e izquierdo y 1.

En este informe vamos a ofrecer una metodología quirúrgica e inyección detallada para adultos de tipo salvaje C57BL / 6J. Esta cepa de ratón se eligió debido a su amplio uso en la investigación. Técnicamente, cualquier región del cerebro puede ser dirigido para perfusión, sin embargo aquí usaremos el giro dentado del hipocampo como el objetivo de ilustrar la técnica.

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Protocol

Nota: Para todos los experimentos con animales, institucional y directrices nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos.

1. Preparar instrumentos quirúrgicos y soluciones para la cirugía

  1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable.
  2. Preparar etanol al 70% por dilución de 200 a prueba de etanol absoluto con el grado molecular de agua desionizada destilada estéril.
  3. Coloque la aguja G 29 a la jeringa Hamilton. Limpie el interior de Hamilton jeringa y la aguja mediante la elaboración y el agua nanopura expulsión repetidamente durante 1 min. Repita este procedimiento con etanol al 70%.
    1. Retire el émbolo y la aguja de la jeringa Hamilton. Secar las partes en una campana de flujo laminar S / N.
    2. Irradiar la aguja y jeringa con luz ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.
  4. Preparar la solución salina disolviendo NaCl en agua de calidad molecular hasta un peso final a la concentración de volumen de 0,9%. Esterilize la solución por filtración a través de filtro de 0,2 micras de poro.

2. Prepare Oligomeric Aß 1-42

  1. Monomerize y resuspender recombinante humana 1-42 en DMSO a 5 mM exactamente como se describe en la publicación de Fa 'y otras 13 personas.
  2. Diluir 5 mM 1-42 con (1x) PBS estéril a 100 mM en el día antes de la cirugía.
  3. Mezclar la solución bien por trituración.
  4. Incubar Aß 1-42 solución durante 12 horas a 4ºC.
    Nota: Las soluciones de control, tales como la dilución de DMSO en PBS o revueltos / inversa 1-42 péptido debe ser preparado de la misma manera como Aß 1-42.

3. Determinar Coordenadas Injection

  1. Utilice los adultos atlas del cerebro del ratón para determinar la exacta anterior-posterior (AP), medio-lateral (ML) y dorsal-ventral (DV) coordenadas de la región del cerebro de interés 14.
    Note: Para ilustrar la técnica que elegimos el giro dentado del hipocampo como el objetivo con las siguientes coordenadas del bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. El signo negativo que precede al valor AP indica que es 2,00 mm posterior del bregma. El signo ± anterior el valor ML indica la dirección izquierda y derecha del centro. Por último, el signo negativo que precede a la DV indica que se está moviendo desde la superficie ventral del cerebro.

4. Instalación de marco estereotáxica

  1. Use una máscara quirúrgica cara, bata de laboratorio limpia y guantes quirúrgicos estériles.
  2. Limpie instrumento estereotáxico y adaptador de ratón con etanol al 70%.
  3. Establecer paño quirúrgico estéril sobre el mostrador.
  4. Coloque el instrumento estereotáxica con el adaptador del ratón encima de la sábana quirúrgica estéril.
  5. Limpie la almohadilla del ratón con etanol al 70%. Coloque la almohadilla térmica sobre la cama marco estereotáxico. Utilice labora propósito generalcinta de etiquetado tory en cinta por la almohadilla térmica sobre la cama adaptador de ratón.
    1. Coloque la almohadilla eléctrica a la bomba de recirculación de agua caliente de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
    2. Encienda la bomba de recirculación de agua caliente y ajustar la temperatura a 37 ° C, y luego esperar hasta que alcance la temperatura.
  6. Fije la 50 l Hamilton jeringa con una aguja de 29 G en el marco estereotáxico atornillándolo en el eje vertical de inyección motorizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Encienda el esterilizador de cuentas y espere hasta que alcance la temperatura preestablecida por el fabricante.
    Nota: Esto se utiliza para la esterilización de instrumentos de acero inoxidable entre los animales. Se necesita instrumentos 20 seg de contacto con los granos para la esterilización.
  8. Encienda el plato caliente y ponerlo a 42 ° C y colocar una jaula vacía limpia cima.
  9. Mientras que la jeringa Hamilton se fija en el marco estereotáxico utilizar el i estereotáxico motorizadonjector elaborar la solución Aß 1-42.
    Nota: Elaborar más de 4 l de la solución en la jeringa y luego usar el inyector estereotáxica para establecer el volumen de inyección. Operar el inyector de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Preparación de los animales

  1. Determinar el peso del ratón utilizando la escala de pesaje.
  2. Anestesiar ratón con cóctel de ketamina / xilazina a 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina mediante la inyección por vía intraperitoneal (IP). Monitorear la profundidad de la anestesia por la pérdida del reflejo pizca dedo del pie.
  3. Una vez sedado el ratón tome la cortadora de cabello y afeitarse la cabeza para exponer la piel sobre el cráneo.
  4. Coloca el ratón encima de la almohadilla térmica en la parte superior de la cama estereotáxica.
  5. Utilice la espátula para abrir la boca y colocar los dientes incisivos dentro de la guardia de los dientes. Asegure el revólver sobre la cara del ratón. Sujete suavemente hacia abajo y no demasiado apretado.
  6. Posición los travesaños del oído bilaterales en meato auditivo para asegurar la cabeza. Mueva cada travesaño hasta que golpea el cráneo, y luego gire el tornillo para fijarlo.
    1. Para asegurarse de que la cabeza está asegurado utilice su dedo índice para empujar suavemente hacia abajo en la cabeza. Si la cabeza está bien asegurado no va a dar o mover cuando se presiona.
  7. Aplique una gota de crema para los ojos o colirio para los ojos para mantenerlos húmedos. Asegúrese de que los ojos están húmedos durante todo el procedimiento quirúrgico.
  8. Para desinfectar el sitio quirúrgico usar hisopos de algodón estériles para aplicar solución de betadine a la piel sobre el cráneo, seguido por etanol al 70%. Realice el betadine alterna y etanol 70% limpieza 2 veces más.

6. La cirugía y la Infusión

  1. Utilice un bisturí para realizar una incisión de 2-3 mm de la línea media del cuero cabelludo, y luego usar una escalera tijeras finas para extender la línea de incisión para 1,0 a 1,5 cm para exponer la sutura sagital, bregma y lambda del cráneo, señals que las coordenadas estereotáxicas se basan en. Utilice micro abrazaderas para mantener la piel a pedazos.
    Nota: Las posiciones bregma y lambda se explican en el atlas del cerebro de ratones "el cerebro del ratón en estereotáxica Coordenadas" 14.
  2. Tome un bastoncillo de algodón, sumergirlo en una solución salina estéril, y lo utilizan para limpiar el cráneo. A continuación, utilice un hisopo de algodón limpio y seco para secar el cráneo.
  3. Utilice una punta fina pluma estéril para marcar un punto en el bregma. Utilice el micromanipulador estereotáxico para colocar la jeringa Hamilton de modo que la punta de la aguja apenas toca el punto en el bregma.
    1. Graba el DV coordenadas.
    2. Para comprobar si el eje AP del cráneo es de nivel se mueve la jeringa Hamilton posteriormente para que la punta de la aguja toca el punto lambda.
    3. Anote la posición DV. Asegúrese de que el DV coordenadas de bregma y lambda están a 0,5 mm.
      Nota: El objetivo es reducir al mínimo la diferencia entre DV bregma y lambda.
  4. Úsalos a ellosicromanipulator para volver la punta de la aguja de la jeringa Hamilton de nuevo al punto bregma.
  5. Anote la posición inicial AP.
  6. Calcular la posición final AP restando 2,00 mm desde la AP a partir de coordenadas.
  7. Utilice el micromanipulador para reposicionar la aguja de la jeringa Hamilton a la final AP coordenadas.
  8. Graba la corriente ML coordenadas.
  9. Calcular la izquierda y derecha que termina ML coordina mediante la adición o sustracción de 1,3 mm a partir de la ML de coordenadas.
  10. Utilice el micromanipulador para mover la aguja de la jeringa Hamilton ya sea a la ML terminando de coordenadas.
    1. Toque la punta de la aguja a la superficie del cráneo en ambos terminan coordenadas ML y registrar las coordenadas DV y asegurarse de que los valores están dentro de 0,5 mm.
      Nota: El objetivo es reducir al mínimo la diferencia entre los dos DV terminando ML coordenadas.
    2. Mientras que en un final coordinar tirar de la aguja hasta 0,5-1 cm por encima del cráneo. Tome una punta fina pluma estéril para marcar un punto en el the superficie del cráneo. Repita este paso para el lado contralateral del cráneo.
  11. Gire la jeringa Hamilton clara fuera del camino.
  12. Adjuntar 0,8 mm cabeza de perforación a la perforación. Tome el taladro con ambas manos, ajuste los codos sobre la superficie de la mesa para la estabilidad, y la posición de la cabeza de perforación ligeramente por encima del punto sharpie en la izquierda o la derecha ML coordinan. Activar el taladro, bajar la punta de la broca sobre la superficie del cráneo para introducir un agujero en el cráneo. Repita este paso para el lado contralateral.
    Nota: Algunos sangrado puede ocurrir a partir de los orificios de reciente introducción. Si hay sangrado luego usar un hisopo de algodón limpio y seco para secarse la sangre.
  13. Mueva la jeringa Hamilton de nuevo en su posición sobre cualquiera de los agujeros de LD de reciente introducción. Baje la aguja Hamilton justo después del cráneo. En este punto, tenga cuidado de no perforar el cerebro. Para asegurarse de que la aguja ha pasado el cráneo tome su dedo índice y empuje suavemente la aguja contra el cráneo para hacer sure la aguja no salir del agujero.
  14. Graba el DV a partir de coordenadas.
  15. Calcular el DV terminando coordinar restando 2,2 mm de la DV comenzando coordenadas.
  16. Baje la aguja hasta el DV terminando de coordenadas.
  17. Activar la bomba de inyección estereotáxica para bombear 4 l de 1-42 en la circunvolución dentada a una velocidad de 0,5 l / min.
  18. Cuando la infusión se ha completado dejar que la aguja permanezca en su lugar por un adicional de 1 min para minimizar el reflujo de la solución fuera de la zona de inyección.
  19. Mover la aguja al otro lado del cerebro y repita los pasos 6.13 a 6.18.

7. La eliminación de animales y Cuidado Postoperatorio

  1. Desatornille las barras de oído y protección para la cara / nariz. Retire el ratón del aparato.
  2. Utilice un estudiante fórceps patrón estándar para tirar de cerrar el cuero cabelludo y luego sellar la herida con sutura.
  3. Inyectar 1 ml de solución salina estéril en el ratón a través de IP para la hidratación.
  4. Enbuprenorfina yecto (0,1 mg / kg) por vía subcutánea a aliviar el dolor.
  5. Mantener el ratón en la jaula vacía limpio situado en la parte superior de 42 ° C placa caliente hasta que se despierta, y luego devolverlo a su jaula de la vivienda con mucha comida y agua.
  6. Administrar buprenorfina por vía subcutánea cada 12 horas durante 3 días para el alivio del dolor.

Remoción 8. Sutura

  1. Anestesiar el ratón con cóctel de ketamina / xilazina a 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg xlyazine por IP. Nota: Esto se hace 7-10 días después de la cirugía.
  2. Utilice un estudiante fórceps patrón estándar y tijeras finas rectas para eliminar la sutura.
  3. Inyectar 1 ml de solución salina estéril en el ratón a través de IP para la hidratación.
  4. Mantener el ratón en una jaula vacía limpio situado en la parte superior de 42 ° C placa caliente hasta que se despierta, y luego devolverlo a su jaula de la vivienda con mucha comida y agua.

Sacrificio y Tejidos Procesamiento 9. Animal

  1. Anestesiar el ratón y el perfuse con paraformaldehído al 4% 15, retire el cerebro, y procesarlo para cryosectioning 16.
    Nota: El momento del sacrificio de los animales depende del experimentador. Sin embargo, para nuestros estudios hemos elegido los 7 y 14 días después de la cirugía.

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Representative Results

El presente método de preparación humana recombinante oligomérica 1-42 produce especies oligoméricas solubles que consiste en monómeros, dímeros, trímeros, y tetrámeros (Figura 1A). Estos especies de bajo peso molecular 1-42, pero no las fibrillas y placas, se ha demostrado en numerosos entornos para ser más tóxico para las neuronas 1,4,9,17-19. Para determinar si es o no oligómeros Aß 1-42 induce la muerte de las neuronas en el cerebro del ratón Aß 1-42 (4 l de 100 mM solución madre) se infunden en la Dirección General del hipocampo en un hemisferio, de 9 meses de edad de tipo salvaje C57BL / 6J. El peso de un hipocampo de ratones C57BL / 6J se estima en alrededor de 0.018 g y por lo tanto la entrega de 1-42 fue de aproximadamente 100 g / g. La DG contralateral del mismo cerebro de ratón se infundió con una solución de control / vehículo - que consistía en un volumen igual de DMSO utilizado en la disolución de Aß 1-42 diluido en (1x) PBS - para la comparación. Como se mencionó anteriormente revueltos o revertir 1-42 péptido puede ser utilizado como control para la comparación ya que previamente encontramos ningún efecto sobre las neuronas del hipocampo 1. A medida que la introducción de la aguja en el cerebro crea el daño tisular local (Figura 1B) y causa eventual colapso DG optamos por realizar después de la inyección analiza junto a las vías de inyección en el tejido sigue intacta. Dentro de 1 semana de 1-42 inyección de la DG exhibió elevadas 1-42 niveles en la capa molecular y la capa de células polimórfica en la vecindad del sitio de inyección (Figura 2A). A los 7 y 14 días Aß 1-42 provocó aumentos en la tinción de TUNEL-positivas y disminuye en la Dirección General de espesor, lo que confirma los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 (Figura 2B).

Debido a que las neuronas colinérgicas BF proyectan a la DGdel hipocampo se determinó a continuación si la pérdida de neuronas en el DG provoca degeneración BF. Para este estudio un trazador Fluorogold retrógrada (2% suspensión) fue co-inyectados junto con 1-42 en el DG. 7 días siguientes Fluorogold inyección se detectó en el BF (Figura 2C), sugiriendo transporte retrógrado de la etiqueta a través de las neuronas colinérgicas. Por lo tanto, con el propósito de cuantificación en el BF elegimos neuronas Fluorogold-positivas porque esto indica que los terminales neuronales fueron expuestos a 1-42 en la DG. En ambos 1 y 2 semanas después de la DG de Aß 1-42 de infusión, el núcleo de la banda diagonal - una subregión de la BF, donde las neuronas colinérgicas proyectan a la DG - ipsilateral al sitio inyectadas Aß 1-42 aumentos en la tinción de TUNEL exhibió y disminuye en las neuronas colinérgicas (Figura 2D). La pérdida de neuronas observada en el BF confirma estudios anteriores que vinculan el destructorefectos de 1-42 a la vía de 1,10-BF del hipocampo. También es crucial tener en cuenta que a partir de la comparación de el punto de tiempo de 2 semanas a 1 semana punto de tiempo en el lado del núcleo de la banda diagonal donde la solución de control / vehículo se inyectó en la DG hubo incrementos adicionales en la tinción de TUNEL y la disminución de las neuronas colinérgicas (Figura 2D, mesa). Estos resultados reflejan disminuciones significativas en el espesor GCL y aumentos en el etiquetado TUNEL positivas (Figura 2B, tabla) en la DG de el lado del vehículo inyectado comparando entre los puntos de tiempo de inyección 2 de correos, lo que implica que el trauma físico causado por la aguja contribuye a degeneración en el tiempo. Incluso con este efecto secundario indeseable de la aguja, los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 son todavía significativamente mayores que los de la solución de control / vehículo (Figura 2D). En conjunto, la actual modelo de infusión effectively reproduce los efectos tóxicos de Aß 1-42 en el cerebro del ratón dentro de 7 días haciendo de este un modelo atractivo para estudiar a corto plazo Aß 1-42 estimulación.

Figura 1
Figura 1. oligoméricas 1-42 preparación y cerebro de ratón tracto inyección de visualización. (A) 2 M oligoméricas 1-42 se separó en 10-20% de gel de tricina y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se secó con Aß 1-42 6E10 anticuerpos (1: 1000). (B) 1-42 (4 l de 100 mM de solución) o de control / vehículo se infundió en la izquierda y derecha DG del hipocampo, respectivamente, de 9 meses de edad C57BL / 6J. Los ratones fueron sobrevivieron durante 7 días. Los cerebros se seccionaron en serie a 20 micras por sección. Secciones del hipocampo se tiñeron para DAPI. Marcas de control representanel tracto inyección. Las flechas muestran colapsaron DG. La barra de escala representa 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Oligomeric Aß 1-42 induce la muerte de las neuronas en la Dirección General y el BF. Control / vehículo o Aß 1-42 (4 l de 100 mM solución) se infunde en la izquierda y la derecha DG del hipocampo, respectivamente, de 9 meses de edad C57BL / 6J. Los ratones fueron sobrevivieron durante 7 ó 14 días. Los cerebros se seccionaron en serie a 20 micras por sección. (A) 7 días después de las secciones del hipocampo inyección teñidas para Aß 1-42 (anticuerpo NU4, 1: 2000). ML, capa molecular; GCL, capa de células ganglionares; PCL, capa de células polimórfico. La barra de escala representa 50 micras. (B (C) Vehículo o Aß 1-42 co-inyectados con Fluorogold (solución al 2%). Etiquetado Fluorogold determina en el BF 7 días después de la inyección. Las diapositivas que contienen el BF fueron escogidos al azar. Etiquetado Fluorogold se utilizó para determinar la región de interés. Una vez se identificó la región de interés se utilizaron cortes de cerebro adyacentes a la mancha para los marcadores de interés. Las inserciones son regiones en las que se eligen imágenes en (D). La barra de escala representa 200 micras. (: 100, policlonal de cabra 1) o TUNEL (D) 7 o 14 días secciones BF inyección teñidas para chatear publican. *** P <0,001 frente a 1 semana. * P <0,05 en comparación con vehículo. La cuantificación se realiza en toda la regiónde interés. El límite entre el tabique medial y la banda diagonal está delineado basado en la ubicación de la comisura anterior. La barra de escala representa 100 micras. (N = 5 ratones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Para lograr un éxito Aß 1-42 inyección experimentador o cirujano debe: 1) utilizar una técnica aséptica; 2) identificar correctamente la región del cerebro de intereses con coordenadas precisas; 3) ser capaz de asegurar adecuadamente el ratón en el marco estereotáxico con el cerebro nivelado en el eje AP y ML; 4) tener la capacidad de operar el micromanipulador con precisión; 5) garantizar la atención postoperatoria adecuada. Si se siguen estos pasos clave del ratón debe sobrevivir a la cirugía sin infección observable.

De acuerdo con los estudios in vitro, nosotros y otros han demostrado que Aß 1-42 infundido directamente en el hipocampo provoca la muerte de las neuronas 1,4,9,10, que representa una de las principales características de la EA. La degeneración es claramente evidente en las proximidades de la zona de inyección como se muestra por una disminución en el volumen de la circunvolución dentada que se complementa por el aumento de los marcadores de la degeneración 1. Además, tél colinérgicos neuronas que se proyectan hacia el hipocampo mueren de una manera retrógrada como se muestra por una disminución en el etiquetado colinérgico y un aumento en la tinción de TUNEL-positivas en el BF 1,10. Por lo tanto, este modelo in vivo sirve como un excelente modelo para investigar los efectos semi-agudos de Aß 1-42 localmente. La principal ventaja de este modelo de inyección es su naturaleza dinámica: ninguna región del cerebro puede ser objetivo y los diferentes animales de edad avanzada puede ser utilizado. 9 meses de edad ratones machos fueron elegidos en nuestros experimentos, porque creemos que el aumento de los niveles de Aß 1-42 en ratones más viejos mejores simula la enfermedad que se produce en las personas mayores. Por otra parte, nuestro objetivo es mantener los experimentos consistentes con los ratones de la misma edad. Sin embargo, los ratones de cualquier edad podrían utilizarse para la inyección. En el pasado hemos experimentado con ratones que fueron 16 meses de edad y otros han utilizado ratones que fueron 2 meses de edad 9,10. Sólo los ratones machos deben utilizarse en los estudios como ratones hembra exhibición estrofluctuaciones del nivel de generación y el estrógeno se sabe que tienen efectos neuroprotectores 20. Aunque muchos intereses de investigación se centran en los efectos patológicos de Aß 1-42, hay también evidencia que se requieren bajos o fisiológicas Aß 1-42 niveles para las funciones normales para el aprendizaje y la memoria 21,22. En estos estudios los investigadores redujeron la concentración de Aß 1-42 inyecta y se infunden en el hipocampo 22,23, revelando efectivamente otro ejemplo de la naturaleza dinámica de la utilidad de este paradigma. Otros compuestos que han sido infundidos con éxito estereotáxicamente incluyen fármacos, virus, siRNA, anticuerpos y péptidos 1,22-26 para investigar diversos efectos que van desde la celda de la muerte / supervivencia al comportamiento animal. Por lo tanto, existen numerosas aplicaciones para el empleo de este paradigma de infusión.

La metodología de infusión descrito, mientras que exhiben diferentes potenciales en vivo estudia el uso de esta técnica, también viene con limitaciones inherentes. En primer lugar, este modelo sólo se trata de reproducir los efectos de Aß 1-42 en una región del cerebro aislado. En segundo lugar, el sitio de inyección está dañado de la introducción de una aguja en el cerebro. Esto contribuye a la muerte celular adicional y gliosis. Por lo tanto, el análisis se tiene que realizar de distancia desde el tracto inyección. Con el control de vehículo apropiado en el lado contralateral del mismo cerebro esto no debería ser un problema ya que el vehículo inyectado y Aß 1-42 soluciones de propagación a los tejidos circundantes. En tercer lugar, porque las neuronas colinérgicas BF proyectan al hipocampo, el daño físico del hipocampo como es evidente por el colapso de la Dirección General de la aguja (Figura 1B) puede matar inadvertidamente algunos BFCNs. Afortunadamente, el examen de los circuitos neuronales en el corto plazo - el plazo de 1 semana de una infusión de un solo tiro - no suponer un problema, ya que nuestros datos sugieren que el aumento demuerte colinérgica en el cerebro anterior basal es el resultado de 1-42 y no desde el trauma de la aguja; inyecciones de control proporcionan el análisis apropiado. Los datos sugieren que la degeneración de la DG es también necesario para la pérdida de neuronas colinérgicas BF como estas neuronas pierden sus objetivos sinápticas (Figura 2B). Desafortunadamente, para animales supervivientes hasta 2 semanas el lado inyectado vehículo muestra una elevación significativa de la muerte BFCN más de 1 semana post-vehículo animales inyectados que parece ser debido en parte a la degeneración y adelgazamiento de la circunvolución dentada resultante del trauma físico de la aguja. Sin embargo, incluso en esta etapa los datos sugieren que hay mucho más la muerte en el mismo lado BF al sitio inyectadas Aß 1-42. En cuarto lugar, puede ser difícil de lograr la identificación de límites anatómicos sutiles. Por ejemplo, el límite entre el tabique medial y la banda diagonal se determinó basándose en la ubicación de la anteriorcomisura, una técnica que fue descrito previamente 27. Además, debido a la ipsilateral BF proyección neuronal colinérgica - principalmente desde el tabique medial y el miembro vertical de la banda diagonal (MS / DB) - para el giro dentado del hipocampo 12,28,29 decidimos inyectar un hemisferio con Aß 1-42 y utilice el hemisferio opuesto como control para la comparación. Es concebible que una preocupación para este paradigma sería la correcta identificación de la frontera que separa izquierda y derecha MS / DB. Mientras que la MS está en la región de la línea media, los DBs son más lateral. Para este trabajo actual y nuestra más reciente publicación 1 pudimos distinguir cómodamente DB izquierda y derecha. Nuestra cuantificación revela Chat (+) neuronas disminuyen en aproximadamente un 25% en el PP en el lado inyectadas Aß 1-42. Sin embargo, no detectamos ningún cambio significativo en el chat (+) las neuronas en el MS 1. Debido a la loc lateralación de la DB y los cambios observados nos sentimos que estábamos justificados emplear vehículo y Aß 1-42 inyecciones dentro del mismo animal. Por otra parte, las pruebas de 2 condiciones experimentales diferentes dentro del mismo animal no sólo maximiza el uso de los animales sino que también reduce la variabilidad potencial de animal a animal. Mientras que nuestro diseño experimental nos permite comparar los hemisferios izquierdo y derecho es concebible esta técnica comparación puede no ser factible en estudios futuros, es decir, si el tabique medial es el foco principal del estudio. En tal caso, cada animal tendrá que servir como una condición experimental. Por lo tanto, el uso de animales es a discreción de los experimentadores. En quinto lugar, ¿puede el modelo de inyección de corriente usarse para otros de lectura-outs como el comportamiento? Nuestro propósito al emplear el modelo actual de inyección Aß 1-42 fue evaluar los efectos neuropatológicos de Aß 1-42 in vivo y compararlo con los resultados in vitro 1 (Figura 1B y 2B) cuando nos dirigimos a la aguja de la inyección en o cerca de la DG a los 7 días de la destrucción de la Dirección General puede dar lugar a anomalías de comportamiento no deseados. Por lo tanto, si un estudio requiere examinar el efecto de 1-42 en el comportamiento dependiente del hipocampo, entonces el objetivo de la inyección puede tener que ser colocado de nuevo cerca del hipocampo en lugar de directamente en él y permitir Aß 1-42 a difundirse en el hipocampo. Dicho esto, el uso del paradigma actual de inyección para las pruebas de comportamiento es posible, pero requiere más pruebasla estrategia experimental final de ING y caracterización, y serán determinados por el usuario final. Curiosamente, se han realizado estudios de comportamiento de roedores previas que involucran la entrega externa de Aß 1-42 directamente en el cerebro. 22,30 En conjunto, estas limitaciones deben ser considerados en el diseño de los estudios del ratón in vivo que emplean este modelo en.

Desde un modelo único ratón en existencia captura los efectos patológicos completos de AD la técnica de infusión de Aß 1-42 estereotáxica ofrece experimentadores con una alternativa vivo Aß 1-42 modelo de ratón. Cuando se realiza por un individuo bien entrenado este modelo es el más adecuado para los estudios a corto plazo se centran en los efectos de Aß 1-42 en una región específica del cerebro o los circuitos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares conceder NS081333 (a CMT), Asociación de Alzheimer subvención NIRG-10-171721 y el Instituto Nacional de Salud Mental de subvención MH096702 (a UH), y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento financiados Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Centro de la Universidad de Columbia subvención piloto AG008702 (a YYJ y JB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine HCl (100 mg/ml) Henry Schein Medical 1049007 100 mg ketamine per 1 kg animal
Xylazine (20 mg/ml) Henry Schein Medical not available 10 mg xylazine per 1 kg animal
Buprenex (0.3 mg/ml) Henry Schein Medical 1217793 0.1 mg buprenex per 1 kg animal
Aβ1-42 David Teplow/UCLA not available 100 μM; This amyloid was used in the paper
Aβ1-42 Bachem H-1368 Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Aβ1-42 American Peptide 62-0-80B Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Scrambled Aβ1-42 American Peptide 62-0-46B Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) Gift from William Klein/Northwestern U. not available 1:2,000 dilution
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody  (Polyclonal Rabbit) EMD Millipore AB9234 May be used in place of Nu4; needs to  be tested by the end user
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) Biolegend sig-39320 1:1,000 dilution
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) Millipore AB144P 1:100 dilution
DeadEnd Fluorometric TUNEL system Promega G3250 Follow manufacturer's directions for use
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P36935 Use when coverslipping slides
Fluorogold Fluorochrome, LLC not available 2% solution
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-4 For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting
Novex 10-20% Tricine gel Life Technologies EC6625BOX For separating Aβ1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Life Technologies LC1675 For running 10-20% Tricine gels
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Life Technologies LC3675 For transferring 10-20% Tricine gels
SuperSignal Western Blot Enhancer Thermo Scientific 46640 For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm GE Healthcare Life Sciences 10402088 For transferring 10-20% Tricine gels
Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001 Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels
GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores
 
Name Company Catalog Number Comments
Refresh Optive Lubricant Eye Drops Allergan not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal
Betadine Stoelting 50998 For sanitizing and disinfecting
Round/Tapered Spatula  VWR 82027-490 For opening animal mouth
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) Fine Science Tools 18050-28 Optional; For keeping scalp skin apart during injection
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 14060-11 For cutting scalp
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Surgical Blade Fine Science Tools 10011-00 For making scalp incision
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 91100-12 For holding scalp closed during suturing
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201 For shaving hair
T/Pump Warm Water Recirculator  Kent Scientific  TP-700 For warming animal during surgery
Resusable Warmining Pad (5" x 10") Kent Scientific  TPZ-0510FEA For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery
Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor Stoelting 51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument Stoelting 51730 Can use this in place of Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotaxic Injector Stoelting 53311
Dry Glass Bead Sterilizer Stoelting 50287 For sterilizing stainless steel instruments
Sterile Surgical Drape (18" x 26") Stoelting 50981
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL Hamilton Company 7637-01 For brain injection; use different syringes for different solutions
29 G Needle, Small Hub RN NDL Hamilton Company 7803-06 For attaching to the Hamilton syringe for brain injection
1 ml BD Tuberculin Syringes VWR BD309659 For administering anesthesia and saline
30 G Needle (0.5") VWR BD305106 For administering anesthesia and saline
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) VWR 65500-202 For weighing animals to determine anesthesia dose
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) VWR 47751-148 For warming animals post-surgery
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm Covidien S1173 For closing wound
Vetbond Tissue Adhesive (3M) Santa Cruz Biotechnology sc-361931 Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators Fisher scientific 22-029-488 For cleaning and drying surgical wound
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific  12-550-15 For collecting brain sections
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm VWR 48393241 For mounting microscope slides
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm Fisher Scientific 194-2520 For sterilizing saline solution
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical Medline VIS1422SRL91 For marking coordinates on the skull

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References

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Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, … More

Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, M., Hengst, U., Troy, C. M. Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (100), e52805, doi:10.3791/52805 (2015).

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