Abstract
Alzheimer hastalığı, yaşlanma nüfusu etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın önemli bir nöropatolojik özellik amiloid-beta aşırı üretim ve etkilenen bireylerin beyin bölgelerinde amiloid beta plakların birikmesidir. Yıllar boyunca bilim adamları, amiloid beta patolojiyi çoğaltmak girişiminde sayısız Alzheimer hastalığı fare modelleri yarattı. Ne yazık ki, fare modelleri, sadece seçici bir şekilde hastalık özelliklerini taklit eder. Nöronal ölüm, Alzheimer hastalığı olan hastaların beyinlerinde belirgin bir etki fark bu farelerde yoksundur. Nöronlar en zehirli olduğu kanıtlanmıştır amiloid-beta biçimleri - - Bu nedenle, biz ve diğerleri doğrudan amiloid-beta çözünür oligomerik türler beslerken bir yöntem istihdam var stereotaxically beyin içine. Bu yazıda seçkin bir beyin bölgesi amiloid beta seviyelerinin arttırılması, bu cerrahi teknik belgelemek için erkek C57BL / 6J fareler kullanmaktadır.Kolinerjik devre ile bağlıdır bazal ön ile birlikte bu beyin yapısı, hastalığın dejenerasyon alanlarından biri temsil ettiği infüzyon hedef hipokampusun dentat girus olduğunu. Broca diyagonal bant dikey bacak hücre ölümü ve kolinerjik nöron kaybı eşlik eden bir artış iken, stereotaksik infüzyon yoluyla dentat girus amiloid-beta yükseltilmesi sonucu, 1 hafta içinde, dentat girus nöron kaybına yükselerek Bazal önbeyin. Bu etkiler 2 haftaya kadar gözlenir. Elde ettiğimiz veriler mevcut amiloid beta infüzyon modeli, kısa vadede bölgeye özgü nöron ölümünü ele alternatif fare modeli sağladığını göstermektedir. Bu modelin avantajı amiloid-beta mekansal ve zamansal biçimde yüksek olmasıdır.
Introduction
Amiloid-beta (Aβ 1-42) oluşan amiloid lekesi yatakları, Alzheimer hastalığı (AD) patolojisinde önemli bir özelliğidir. Birçok çalışma nöron ölümünü, sinaptik distrofi, kayıp ve disfonksiyonu ortaya rekombinant oligomerik Aβ 1-42 o yüksek veya toksik seviyelere göstermiştir; yanı sıra, öğrenme ve hafıza açıkları 1-4 olarak. Etkilenen beyin bölgeleri hipokampus, korteks ve bazal ön beyin ve amigdala 5,6 gibi subkortikal yapılar yer alıyor. Bugüne kadar, AD Aβ 1-42 patoloji simüle girişiminde birden transgenik fare modelleri vardır. Zorlanma bağlı bu hayvanlar AD seçkin patolojik özelliklerini inceleyerek yararlı olduğunu kanıtlayabilir. Ne yazık ki, 2 transgenik kuşaklar, APP23 ve 5XFAD hariç olmak üzere, bu fareler, tam nöronal kayıp, MS önemli bir yönünü çoğaltma olmadı. Hatta APP23 ve 5XFAD gözlenen nöronal kayıp, nöronal ölüm glikozu ileved birkaç seçme bölgelere 7,8 kadar, ince yaşa bağımlı ve izole oldu.
vahşi tip fare beyin oligomerik Aβ 1-42 doğrudan infüzyon amyloidopathy 1,9,10 nöronal ölüm yönü çoğaltır in vivo modelinde mükemmel içerir. Yaygın olarak kullanılan transgenik fare modellerinin aksine oligomerik Aβ 1-42 infüzyon modeli akut bir mekansal ve zamansal bir şekilde Aβ 1-42 seviyesini yükseltmektir için idealdir. Bu model için, vahşi tip fareler kullanılarak avantajı transgenik fare hatları tanıtılan mutasyon potansiyel dengeleme ya da yan etkileri ortadan kaldırır. Son çalışmalar, hipokampusa Aβ 1-42 toksik düzeylerini beslerken 1 hafta 1 içinde enjeksiyon bölgesinde çok yakın nöron ölümünü ortaya çıkarır göstermiştir. Dahası, Aβ 1-42 kolinerjik nöronların 11 bazal ön beyin için toksik gözlem ile tutarlı olduğunuhipokampus için projeler kolinerjik nöron (BFCN) nüfus etkin bir beyinde izole nöronal devrenin sınavları için izin farelerde, beta-amiloid infüzyon 1,10 izleyen 7-14 gün içinde% 20-50 azalır. Çoğunlukla, kontrol / araç ve oligomerik Aβ 1-42 çözümler hipokampus 12 dentat girus için ipsilateral BFCN projesi yana karşılaştırmalar, sol ve sağ hemisfer 1 arasında yapılacak izin beynin her iki tarafında enjekte edilebilir.
Bu yazıda erişkin vahşi tip C57BL / 6J fareler için detaylı bir ameliyat ve enjeksiyon metodoloji sağlayacaktır. Bu fare suşu nedeniyle araştırma geniş kullanım seçilir. Teknik olarak, herhangi bir beyin bölgesi, ancak burada tekniği açıklamak için bir hedef olarak hipokampusun dentat girus kullanır, infüzyon için hedeflenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Tüm hayvan deneyleri için, kurumsal ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için ulusal kurallar takip edildi.
1. Cerrahi Cerrahi Aletler ve Çözümler hazırlayın
- Tüm paslanmaz çelik cerrahi aletleri otoklavlayın.
- Steril moleküler sınıf iyonu giderilmiş damıtma suyu ile 200 derece mutlak etanol seyrelterek% 70 etanol hazırlayın.
- Hamilton şırınga 29 G iğne takın. 1 dakika boyunca tekrar tekrar hazırlanması ve çıkarma nanopure su ile Hamilton şırınga ve iğne içini temizleyin. % 70 etanol ile bu işlemi tekrarlayın.
- Hamilton şırınga pistonu ve iğneyi çıkartın. Hava Laminer akış kaput O / N parçaları kurulayın.
- Kullanımdan önce, 30 dakika boyunca ultraviyole ışığıyla iğne ve şırınga ışın tedavisi.
- % 0.9 hacim konsantrasyonuna nihai ağırlığa moleküler sınıf suda NaCl çözülmesiyle tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Sterilizasyonu0.2 um gözenekli filtre içinden filtre edilerek çözelti ze.
2. oligomerik Aβ 1-42 hazırlayın
- Fa 've diğerleri 13 yayınında tarif edildiği gibi Monomerize tam olarak 5 mM DMSO içinde rekombinan insan Aβ 1-42 yeniden süspanse edin.
- Ameliyat öncesi gününde 100 mcM steril (1x) PBS ile 5 mM Aβ 1-42 sulandırmak.
- Ezilerek de çözüm karıştırın.
- 4 ˚ C de 12 saat Aβ 1-42 çözelti inkübe edin.
Not: Bu tür PBS DMSO seyreltilerek veya karıştırılmış olarak kontrol çözümleri / Aβ 1-42 peptid Aβ 1-42 ile aynı şekilde hazırlanmalıdır tersine çevirir.
Enjeksiyon Koordinatları belirlemek 3.
- Tam anterior-posterior (AP), medial-lateral (ML) belirlemek için yetişkin fare beyin atlası kullanın ve dorsal-ventral (DV) ilgi 14 beyin bölgesi için koordine eder.
Hayırte: Biz bregmadan aşağıdaki koordinatlarla hedef olarak hipokampusun dentat girus aldı tekniği göstermek için: AP, -2,00 mm; ML, 1.3 mm ±; DV, -2.2 mm. AP değeri önceki eksi işareti o bregma 2.00 mm arka olduğunu gösterir. ML değeri önceki ± işaret merkezinden sol ve sağ yönünü gösterir. Son olarak, DV önceki eksi işareti beynin ventral yüzeyinden hareket gösterir.
4. Stereotaksik Çerçevesi Ayarı
- Cerrahi yüz maskesi, temiz laboratuvar önlüğü ve steril cerrahi eldiven giyin.
- Stereotaksik alet ve% 70 etanol ile fare adaptörü silin.
- Tezgahın üzerine steril cerrahi örtü aşağı yatırın.
- Steril cerrahi asmak üstünde fare adaptörü ile stereotaksik aleti koyun.
- % 70 etanol ile fare ısıtma yastığı silin. Stereotaksik çerçeve yatağın üzerinde ısıtma yastığı yerleştirin. Genel amaçlı Labora kullanınFare adaptör yatağın üzerinde ısıtma pedi aşağı teybe edici etiketleme bant.
- Üreticinin talimatlarına göre ılık su sirkülasyon pompası ısıtma yastığı takın.
- Sıcak su sirkülasyon pompası açın ve 37 ° C sıcaklığı ayarlamak ve sıcaklığına ulaşana kadar bekleyin.
- Üreticinin talimatlarına göre motorlu dikey enjeksiyon miline vidalanarak stereotaksik çerçeve üzerine 29 G iğne ile 50 ul Hamilton şırınga yapıştırın.
- Boncuk sterilizatör açın ve üreticinin önceden ayarlanmış sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin.
Not: Bu hayvanlar arasında paslanmaz çelik aletleri sterilize etmek için kullanılır. Bu enstrümanlar sterilizasyon boncuklar ile temas 20 saniye sürer. - Sıcak plaka açın ve 42 ° C olarak ayarlayın ve üstüne temiz bir boş kafes yerleştirin.
- Hamilton şırınga stereotaksik çerçeve üzerinde sabit iken motorlu stereotaksik i kullanınnjector Aβ 1-42 çözüm hazırlamak için.
Not: şırıngaya çözümün fazla 4 ul hazırlayın ve daha sonra enjekte seviyesini ayarlamak için stereotaksik enjektör kullanın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir enjektör.
5. Hayvan hazırlanması
- Ölçek tartmak kullanarak fare ağırlığını belirler.
- Periton boşluğu içine (ip) enjekte edilerek 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin ketamin / ksilazin kokteyli ile fare anestezisi. Ayak tutam refleks kaybı anestezi derinliği izleyin.
- Fare sedasyon sonra saç kesme almak ve kafatası üzerindeki deriyi açığa başını tıraş.
- Stereotaksik yatağın üstüne ısıtma yastığı üstüne fare yerleştirin.
- Diş görevlisi içeride kesici diş ağzı açık ve yerleştirmek için spatula kullanın. Fare yüzünde burun sabitleyin. Nazikçe ve çok sıkı değil aşağı kelepçe.
- Posikafa sabitlemek için kulak yolunun içine ikili kulak çubuklardan yon. Bu kafatası vurur kadar her enine hareket ettirin ve sonra kilitlemek için vidayı çevirin.
- Baş hafifçe kafasına aşağı itmek için parmağınızı kullanın güvenli olduğundan emin olmak için. Baş düzgün güvenli ise dışarı vermeyecektir veya basıldığında hareket ettirin.
- Nemli tutmak için gözlere göz kremi ya da göz damlası bir damla uygulayın. Gözleri cerrahi işlem boyunca nemli olduğundan emin olun.
- Cerrahi alan% 70 etanol ve ardından kafatası üzerinde cilt için betadin çözüm uygulamak için steril pamuklu çubuklarla kullanmak dezenfekte etmek için. Alternatif betadin ve 2 kez daha temizliği% 70 etanol gerçekleştirin.
6. Cerrahi ve İnfüzyon
- Kafa derisinin orta hatta bir 2-3 mm'lik kesi yapmak için bir neşter kullanın ve sonra kafatası, dönüm noktası sagital sütür, bregma ve lambda maruz 1.0-1.5 cm kesi hattı genişletmek için düz ince makas kullanınstereotaksik koordinatlar dayanmaktadır s. Ayrı cildi korumak için mikro kelepçeleri kullanın.
Not: Bregma ve lambda pozisyonları fare beyin atlası "Stereotaksik Koordinatlarda Fare Beyin" 14 açıklanmıştır. - Bir pamuklu çubukla atın steril tuzlu su içinde ıslatın ve kafatasını temizlemek için kullanabilirsiniz. Sonra, kafatası kurulamak için temiz, kuru bir pamuklu bir bez kullanın.
- Bregma üzerinde bir nokta işaretlemek için steril ince kalem kullanın. Iğne ucu sadece bregma üzerinde nokta değecek şekilde Hamilton şırınga konumlandırmak için stereotaksik mikromanipülatör kullanın.
- DV koordinat kaydedin.
- Kafatasının AP ekseni seviyesi iğne ucu lambda noktasını değecek şekilde posterior Hamilton şırınga taşımak olup olmadığını kontrol etmek için.
- DV konumunu kaydedin. 0.5 mm içindedir DV bregma ve lambda koordinatları emin olun.
Not: amaç bregma ve lambda arasındaki DV farkı en aza indirmektir.
- M kullanicromanipulator Bregma noktaya geri Hamilton şırınga iğne ucu dönün.
- Başlangıç AP pozisyonu kaydedin.
- Koordinat başlayan AP'den 2.00 mm çıkarılarak biten AP konumunu hesaplayın.
- Koordinat son AP'ye Hamilton şırınga iğnesi yeniden konumlandırmak için mikromanipülatör kullanın.
- Geçerli ML koordinat kaydedin.
- Sol hesaplayın ve sağ ML biten ekleme veya koordinat ML başlatılmasını 1,3 mm çıkartarak koordine eder.
- Biten ML koordinat ya Hamilton şırınga iğne taşımak için mikromanipülatör kullanın.
- Her iki biten ML koordinatlara kafatası yüzeyine iğne ucu dokunun ve DV koordinatlarını kaydetmek ve değerler 0,5 mm içinde olduğundan emin olun.
Not: Gol ML koordinatları biten ikisi arasındaki farkı DV en aza indirmektir. - Bir bitiş kafatası üzerinde yukarı 0.5-1 cm iğne çekin koordinat iken. Th bir nokta işaretlemek için steril ince kalem alınKafatasının e yüzeyi. Kafatasının karşı tarafta için bu adımı yineleyin.
- Her iki biten ML koordinatlara kafatası yüzeyine iğne ucu dokunun ve DV koordinatlarını kaydetmek ve değerler 0,5 mm içinde olduğundan emin olun.
- Yolumdan net Hamilton şırınga Salıncak.
- Matkap 0,8 mm matkap kafasını takın. , Iki eliyle matkap atın istikrar için masanın yüzeyinde dirsek ayarlamak ve sol veya sağ ML ya koordinat şarpi nokta üzerinde biraz matkap kafasını yerleştirin. Kafatasında bir delik tanıtmak için kafatası yüzeye matkap ucu düşürmek, matkap etkinleştirin. Karşı tarafta için bu adımı yineleyin.
Not: Bazı kanama yeni tanıtılan deliklerden oluşabilir. Daha sonra kanama varsa kan kurulamak için temiz ve kuru pamuklu bir bez kullanın. - Yeni tanıtılan ML delik ya üzerinde geri pozisyona Hamilton şırınga taşıyın. Sadece kafatası geçmiş Hamilton iğne indirin. Bu noktada beyin delmek için dikkatli olun. Emin olmak için iğne sur kafatası işaret parmağınızı almak ve yavaşça yapmak için kafatası karşı iğne itin geçtie İğne deliği çıkmak değildir.
- Başlangıç DV koordinat kaydedin.
- Biten DV başlangıç DV koordinat 2.2 mm çıkartarak koordinat hesaplayın.
- Koordinat aşağı biten DV iğneyi indirin.
- 0.5 ul / dk'lık bir oranda dentat girus içinde Aβ 1-42 4 ul pompalamak için stereotaksik enjektör pompası devreye sokun.
- Infüzyon tamamlandıktan sonra, iğne enjeksiyon üzerinden çözeltinin geri akışını en aza indirmek için ilave 1 dakika boyunca yerinde kalması sağlar.
- Beynin diğer tarafına iğne taşımak ve 6,13-6,18 adımları tekrarlayın.
7. Hayvan Kaldırma ve Ameliyat Sonrası Bakım
- Kulak çubukları ve yüz / burun nöbet sökün. Cihazdan fareyi çıkarın.
- Kafa derisi kapatın çekin ve daha sonra sütür ile yara mühür bir öğrenci, standart model forseps kullanın.
- Hidrasyon için IP üzerinden fare içine steril serum fizyolojik 1 ml enjekte edilir.
- IçindeJECT buprenorfin (0.1 mg / kg) deri altından ağrıyı gidermek için.
- O uyanana kadar 42 ° C sıcak plaka üstüne set temiz boş bir kafes içinde fare koruyun, sonra bol gıda ve su ile konut kafesine geri.
- Deri altı enjeksiyon yoluyla ağrı kesici 3 gün boyunca her 12 saat buprenorfin yönetme.
8. Dikiş Kaldırma
- IP tarafından 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg xlyazine ketamin / xylazine kokteyl ile fare anestezisi. Not: Bu, 7-10 gün ameliyat sonra yapılır.
- Dikiş kaldırmak için bir öğrenci, standart model forseps ve düz ince makas kullanın.
- Hidrasyon için IP üzerinden fare içine steril serum fizyolojik 1 ml enjekte edilir.
- O uyanana kadar 42 ° C sıcak plaka üstüne ayarlanmış bir temiz boş bir kafes içinde fare koruyun ve ardından bol gıda ve su ile konut kafesine geri.
9. Hayvan Kurban ve Doku İşleme
- Fare ve p uyutmak% 4 paraformaldehid 15 ile erfuse beyin kaldırmak ve 16 cryosectioning için işlemek.
Not: hayvan kurban zamanlaması deneyci bağlıdır. Ancak, bizim çalışmalar için biz 7 ve 14 gün ameliyat sonrası seçti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan yeniden birleştirici oligomerik Aβ 1-42 hazırlanması için, bu yöntem, monomerlerin, dimerler, trimerler ve tetramerler (Şekil 1A) 'den oluşan çözünebilir oligomerik türler elde edilir. Bu düşük molekül ağırlıklı Aβ 1-42 türlerin değil, fibriller ve plaklar, nöronlar 1,4,9,17-19 en toksik olduğu çeşitli ortamlarda gösterilmiştir. Oligomerik Aβ 1-42 fare beyninde Aβ 1-42 nöron ölümünü indükleyen olup olmadığını belirlemek için (100 uM stok solüsyonu 4 ul) 9 aylık vahşi tip C57BL bir yarıküre hipokampusun DG infüze edildi / 6J fareleri. C57BL / 6J için hipokampus ağırlığı civarında 0.018 gr olduğu tahmin ve dolayısıyla Aβ 1-42 teslim yaklaşık 100 ug / g edilir. Aβ 1- eritilmesi kullanılan DMSO'nun eşit hacimde oluşuyordu - aynı fare beyin karşı DG bir kontrol / araç solüsyonu ile aşılanmış olan42 (1x), PBS içinde seyreltilmiş - Karşılaştırma için. Daha önce de belirtildiği şifreli ya da Aβ ters olarak daha önce hipokampal nöronlar 1 üzerinde bir etkisi bulunan yana 1-42 peptid karşılaştırma için bir kontrol olarak kullanılabilmektedir. Beyne iğne giriş lokal doku hasarı (Şekil 1B) oluşturur ve biz post-enjeksiyon gerçekleştirmek için tercih nihai DG çöküşü neden olur doku hala bozulmamış enjeksiyon yolu bitişik analiz eder. Aβ 1-42 enjeksiyon 1 hafta içinde DG molekül tabakası ve enjeksiyon bölgesinde (Şekil 2A) çok yakın bir polimorfik hücre katmanında yükseltilmiş Aβ 1-42 seviyeleri sergiledi. Aβ 1-42 (Şekil 2B) nörodejeneratif etkileri doğrulanmaktadır, 7 ve 14 gün sonra Aβ 1-42 TÜNEL pozitif boyanma artış ortaya çıkardı ve DG kalınlığı azalır.
BF kolinerjik nöronları DG proje ÇünküDG nöron kaybı BF dejenerasyonu tetikler hipokampus önümüzdeki belirlendi. Bu çalışma için bir retrograd tracer Fluorogold (% 2 süspansiyon) co-enjekte DG içine Aβ 1-42 ile birlikte oldu. Enjeksiyon Fluorogold Aşağıdaki 7 gün kolinerjik nöronların ile etiketin geriye doğru aktarıma öne BF (Şekil 2C) 'de tespit edilmiştir. Bu nöronal terminaller dg içinde Aβ 1-42 maruz belirtir nedenle, BF ölçümü amacıyla biz Fluorogold-pozitif nöronlar seçti. DG Aβ 1-42 infüzyonu takiben hem 1. ve 2. haftada, çapraz bant çekirdeği - kolinerjik nöronlar DG proje BF bir alt bölge - Aβ 1-42 -injected siteye ipsilateral TUNEL boyama artışlar sergiledi kolinerjik nöronların (Şekil 2D) azalır. BF gözlenen nöron kaybı yıkıcı bağlayan geçmiş çalışmaları doğruladıBF-hipokampal yol 1.10 için Aβ 1-42 etkileri. Kontrol / taşıt bir çözüm, TÜNEL lekelemesi de artar ve DG enjekte edilmiştir çapraz bandın çekirdeğin yan 1 hafta zaman noktasında 2 haftalık bir zaman noktası karşılaştırmadan dikkat etmek de önemlidir kolinerjik nöronların (Şekil 2D, tablo) olarak azalır. Bu sonuçlar iğne nedeniyle fiziksel travma katkıda bulunduğunu ima, 2 sonrası enjeksiyon süresi noktaları arasında karşılaştırma araç enjekte tarafın DG TUNEL pozitif etiketleme (Şekil 2B, tablo) önemli GCL kalınlığında azalma ve artışlarını yansıtmak zamanla dejenerasyon. Hatta iğne bu istenmeyen yan etki ile, Aβ 1-42 nörodejeneratif etkileri hala kontrol / araç solüsyonu (Şekil 2D) göre anlamlı fazladır. Birlikte ele alındığında, mevcut enfüzyon modeli effectively kısa vadeli Aβ 1-42 uyarımı incelemek için bu cazip bir model yapma 7 gün içinde fare beyninde Aβ 1-42 toksik etkilerini üretir.
Şekil 1. oligomerik Aβ 1-42 hazırlanması ve fare beyin enjeksiyon yolu görselleştirme. (A), 2 uM oligomerik Aβ 1-42% 10-20 trişin jeli üzerinde ayrıldı ve nitroselüloz zar üzerine transfer edilmiştir. Membran Aβ 1-42 antikoru 6E10 (: 1,000: 1) ile lekelenmiştir. (B) Aβ 1-42 ya da kontrol / araç (100 uM çözeltisi 4 ul), 9 ay C57BL / 6J fareler, sırasıyla, hipokampus sol ve sağ GM'ler infüze edildi. Fareler 7 gün boyunca hayatta edildi. Brain seri Bölüm başına 20 mikron olarak kesitler alındı. Hipokampal bölümler DAPI için boyandı. Hash işaretleri tasvirEnjeksiyon yolu. Oklar DG çöktü göstermektedir. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. oligomerik Aβ 1-42 DG ve BF nöron ölümünü indükler. Kontrol / veya araç AΒ 1-42 (100 uM çözeltisi 4 ul), 9, sırası ile, hipokampus sol ve sağ GM'ler infüze edildi aylık C57BL / 6J fareleri. Fareler, ya 7 ya da 14 gün boyunca hayatta edildi. Brain seri Bölüm başına 20 mikron olarak kesitler alındı. (A), 7 gün (: 2000 1, NU4 antikor) Aβ 1-42 lekeli enjeksiyon hipokampal kesitlere. ML, molekül tabakası; GCL, ganglion hücre tabakası; PCL, polimorfik hücre tabakası. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. (B (C), araç ya da Aβ 1-42 Fluorogold (% 2 çözelti) ile birlikte enjekte edilir. Fluorogold markalama BF 7 gün sonra enjeksiyon olarak tespit edilmiştir. BF içeren slaytlar rastgele seçildi. Fluorogold markalama ilgili bölgeyi belirlemek için kullanılmıştır. Ilgi bölgesi belirlendi sonra bitişik beyin kesitleri ilgi işaretleri için leke için kullanılmıştır. ilaveler, (D) Çıkan seçilmiş olan bölgelerdir. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder. (: 100, keçi poliklonal 1) veya TUNEL (D) 7 veya 14 gün ChAT'nin lekeli enjeksiyon BF bölümleri sonrası. *** P <0.001 1 haftaya göre. * P <0.05 araçla karşılaştırıldığında. Niceleme tüm bölge üzerinde yapıldıilgi. medial septum ve diagonal bandı arasındaki sınır ön komissür yere göre tarif edilir. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. (N = 5 fare). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1) aseptik teknik kullanır;: deneyci veya cerrah olmalıdır başarılı Aβ 1-42 enjeksiyon elde etmek için 2) doğru doğru koordinatlar ile çıkar beyin bölgesini belirlemek; 3) düzgün AP ve ML ekseninde tesviye beyni stereotaksik çerçeve fare sabitlemek mümkün; 4) hassas mikromanipülatör çalıştırmak için yeteneği var; 5) Uygun post-operatif bakım sağlamak. Bu önemli adımlar takip edilirse, fare gözlemlenebilir enfeksiyonu ile ameliyat hayatta gerekir.
In vitro uyum içinde çalışmaları, biz ve diğerleri Aβ 1-42 doğrudan hipokampus infüze AD temel özelliklerinden biri tasvir, nöron ölümü 1,4,9,10 ortaya çıkarır olduğunu göstermiştir. dejenerasyon 1 belirteçleri artışlar ile tamamlanmaktadır dentat girusun hacminde azalma ile gösterildiği gibi, bir dejenerasyonu enjeksiyon yakın açık bir şekilde ortadadır. Bundan başka, tO kolinerjik etiketleme azalma ve BF 1,10 TUNEL pozitif boyanma bir artış gösterildiği gibi hipokampus için proje nöronlar retrograd olarak ölür kolinerjik. Bu nedenle, bu in vivo modeli yerel Aβ 1-42 yarı akut etkilerini araştırmak için mükemmel bir model olarak hizmet vermektedir. Bu enjeksiyon modelinin önemli avantajı dinamik doğasıdır: herhangi bir beyin bölgesi hedeflenmiş olabilir ve farklı yaş hayvanlar kullanılıyor olabilir. 9 aylık erkek fareler daha iyi eski farelerde Aβ 1-42 düzeyleri artan inanıyorum çünkü bizim deneylerde seçilmiş yaşlı insanlarda meydana hastalığı taklit edildi. Dahası, aynı yaştaki farelerin kullanarak tutarlı deneyler tutmayı hedefliyoruz. Bununla birlikte, herhangi bir yaştaki fareler enjeksiyon için kullanılabilir. Geçmişte biz 16 aylık olan fareler üzerinde deneyler ve diğerleri 9,10 yaşlı 2 ay vardı fareleri kullandık. Sadece erkek fareler dişi fareler sergi östrojenler olarak çalışmalarda kullanılması gerektiğinigen düzeyinde dalgalanmalar ve östrojen nöroprotektif etkileri 20 olduğu bilinmektedir. Aβ 1-42 patolojik etkileri etrafında birçok araştırma alanları merkezi olmasına rağmen, aynı zamanda düşük ya da fizyolojik Aβ 1-42 seviyeleri öğrenme ve bellek 21,22 normal fonksiyonları için gerekli olduğunu orada kanıtlar olduğunu. Bu çalışmalarda araştırmacılar Aβ 1-42 konsantrasyonu enjekte düşürdü ve etkili bu paradigmanın programı dinamik yapısı henüz başka bir örnek ortaya hipokampus 22,23 içine aşılamıştır. Başarılı bir şekilde stereotaksik infüze edilen diğer bileşikler, hücre ölümü / hayatta kalma hayvan davranışının kadar çeşitli etkilerini araştırmak için ilaçlar, virüs, siRNA, antikorlar ve peptitler 1,22-26 bulunmaktadır. Böylece, bu infüzyon paradigmasını istihdam için çok sayıda uygulamalar vardır.
tarif edilen infüzyon yöntemi, v çeşitli potansiyelleri sergilerkenivo, bu tekniği kullanarak çalışmalar da doğal sınırlamalar ile birlikte gelir. İlk olarak, bu model bir izole edilmiş beyin bölgesinde Aβ 1-42 etkilerini üretmek için çalışır. İkincisi, enjeksiyon yeri beyne bir iğne tanıtımından zarar görmüştür. Bu ek hücre ölümü ve gliozis katkıda bulunur. Bu nedenle, analiz, enjeksiyon yolu uzak yapılmalıdır. Aynı beynin karşı tarafta uygun araç kontrolü ile bu dokuyu çevreleyen enjekte araç ve Aβ 1-42 çözüm yayılması gibi bir sorun olmamalı. BF kolinerjik nöronlar hipokampus için proje çünkü Üçüncüsü, iğne (Şekil 1B) tarafından DG çökmesiyle belirgin olarak hipokampusun fiziksel hasar yanlışlıkla bazı BFCNs öldürebilir. Neyse ki, kısa vadede nöronal devreyi inceleyerek - Tek-shot infüzyon 1 hafta içinde - bizim veri arttığını göstermektedir çünkü bir sorun teşkil etmezbazal ön beyinde kolinerjik ölüm Aβ 1-42 sonucu olup iğne travma; Kontrol enjeksiyonları uygun analiz sağlamak. veriler, bu nöronların sinaptik hedefler (Şekil 2B) kaybettikçe DG dejenerasyonu da BF kolinerjik nöronların kaybı için gerekli olduğunu göstermektedir. Ne yazık ki, 2 haftaya kadar hayatta kalan hayvanlar için araç enjekte yan fiziksel travmadan kaynaklanan dentat girusun dejenerasyon ve incelme kısmen bağlı olduğu görülmektedir 1 hafta sonra, araç enjekte hayvanlar üzerinde BFCN ölüm önemli bir artış olduğunu gösterir İğne. Ancak, hatta bu aşamada veri Aβ 1-42 -injected siteye BF ipsilateral anlamlı olarak daha ölüm olduğunu göstermektedir. Dördüncü olarak, ince anatomik sınırlarını tanımlayan elde etmek zor olabilir. Örneğin, medial septum ve çapraz şerit arasındaki sınır tespit ön yere göre olancommissure, bir teknik, daha önce tarif edilen 27. Ayrıca, ipsilateral BF kolinerjik nöronal projeksiyon - çünkü özellikle medial septum ve diagonal bandında (MS / DB) dikey kolundan - hipokampus 12,28,29 dentat girus biz Aβ ile tek yarımkürede enjekte karar 1-42 ve karşılaştırma için kontrol olarak ters yarımküre kullanın. Bu örnek için bir endişe, sol ve sağ MS / DB ayırma sınır uygun bir şekilde tanımlanması olacağı düşünülebilir. MS orta hat bölgesinde iken, DBs daha lateral vardır. Bu şu anki iş ve en son yayına 1 için biz rahat sol ve sağ DB ayırt başardık. Bizim ölçümü ChAT (+) nöronlar Aβ 1-42 -injected tarafında DB yaklaşık% 25 oranında azalır ortaya koymaktadır. Ancak, biz MS 1 arasında anlamlı ChAT değişiklik (+) nöronlar tespit etmedi. Çünkü yanal locveritabanları ve tirme ve değişikliklerin biz aynı hayvan içinde araç ve Aβ 1-42 enjeksiyonları istihdam haklı olduğunu düşünmüş gözlendi. Ayrıca, aynı hayvan içinde 2 farklı deneysel koşullar test hayvanın kullanımını en üst düzeye kalmayıp potansiyel hayvan to-hayvana değişkenliği azaltır. Bizim deneysel tasarım bize bu düşünülebilir sol ve sağ hemisfer karşılaştırmanızı sağlar iken medial septum çalışmanın ana odak noktası ise bu karşılaştırma tekniği, yani gelecekteki çalışmalarda, uygulanabilir olmayabilir. Bu durumda, her bir hayvan, bir deney koşulu olarak hizmet etmek gerekir. Bu nedenle, hayvanların kullanımı deneycilerden takdirine bağlıdır. Beşinci olarak, mevcut enjeksiyon modeli gibi davranış gibi diğer okuma-çıkışları için kullanılabilir? Geçerli Aβ 1-42 enjeksiyon modeli istihdam amacımız in vivo Aβ 1-42 nöropatolojik etkilerini değerlendirmek ve in vitro bulgular 1 ile mukayese oldu (Şekil 1B ve 2B) gözlenen beri Örneğin, DG imha istenmeyen davranış anormalliklerine yol açabilir. Bir çalışmada, hipokampusa bağlı davranışına Aβ 1-42 etkisini inceleyen gerektiriyorsa Bu nedenle, daha sonra püskürtme hedefi hipokampus yakınında konumlandırılabilir yerine doğrudan bunun içine girecek ve hipokampus içine yayılmaya Aβ 1-42 izin gerekebilir. Bu davranış testleri için mevcut enjeksiyon paradigması kullanılması mümkün olduğunu söyledi ama daha testini gerektiriring ve karakterizasyonu, ve son deneysel strateji, son kullanıcı tarafından belirlenecektir. İlginçtir ki, doğrudan beyne Aβ 1-42 harici teslim içeren önceki kemirgen davranış çalışmaları olmuştur. 22,30 Birlikte ele alındığında, bu sınırlamalar bu modeli kullanarak vivo fare çalışmalarında tasarlanırken dikkate alınması gerekir.
Varlığı tek fare modeli AD tam patolojik etkilerini yakalar beri stereotaksik Aβ 1-42 infüzyon tekniği in vivo Aβ 1-42 fare modelinde bir alternatif deneycilerin sağlar. Iyi eğitilmiş birey tarafından yapıldığında bu model, belirli bir beyin bölgesi veya devrelere üzerinde Aβ 1-42 etkilerine odaklanan kısa vadeli çalışmalar için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü tarafından desteklenen ve İnme Alzheimer Hastalığı Araştırma finanse Yaşlanma üzerine (CMT kadar) NS081333, Alzheimer Derneği hibe NIRG-10-171721 ve (UH kadar) Ruh Sağlığı Hibe MH096702 Ulusal Enstitüsü ve Ulusal Enstitüsü hibe edildi (YYJ ve JB) Columbia Üniversitesi, pilot hibe AG008702 de merkezi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
