Abstract
Alzheimers sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som påverkar den åldrande befolkningen. En viktig neuropatologiska särdrag hos sjukdomen är överproduktion av amyloid-beta och avsättningen av amyloid-beta-plack i hjärnregioner hos de drabbade individer. Genom åren har forskarna genererat många sjukdoms musmodeller Alzheimers som försöker replikera amyloid-beta-patologi. Tyvärr, bara musmodeller selektivt efterlikna de funktioner sjukdomstillstånd. Neuronal död, en framstående effekt i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom, är märkbart saknas i dessa möss. Därför har vi och andra anställda en metod för direkt infusion lösliga oligomera arter av amyloid-beta - former av amyloid-beta som har visat sig vara mest giftigt för nervceller - stereotaktiskt in i hjärnan. I denna rapport använder vi hankön C57BL / 6J-möss för att dokumentera denna kirurgiska teknik av ökande amyloid-beta-nivåer i en utvald hjärnregion. Deninfusions mål är dentate gyrus hos hippocampus eftersom denna hjärnans struktur, tillsammans med den basala framhjärnan som är ansluten med den kolinerga krets, utgör ett av de områden av degenerering i sjukdomen. Resultaten av upplyft amyloid-beta i gyrus dentatus via stereotaxisk infusions avslöjar ökningar i neuronförlust i gyrus dentatus inom en vecka, medan det finns en samtidig ökning av celldöd och kolinerg neuronförlust i den vertikala delen av den diagonala bandet av Broca av den basala framhjärnan. Dessa effekter observeras upp till 2 veckor. Våra data tyder på att den nuvarande amyloid-beta infusion modellen ger en alternativ musmodell för att ta itu med regionspecifika neurondöd på kort sikt. Fördelen med denna modell är att amyloid-beta kan vara förhöjda i en rumslig och temporal sätt.
Introduction
Amyloida plack inlåning, som består av amyloid-beta (Ap 1-42), är en viktig del av patologin för Alzheimers sjukdom (AD). Ett flertal studier har visat att höga eller giftiga halter av rekombinant oligomera Ap 1-42 framkalla neuronal död, synaptiska dystrofi, förlust och dysfunktion; samt inlärnings- och minnesbrister 1-4. Hjärn berörda regionerna omfattar hippocampus, cortex och subkortikala strukturer såsom den basala framhjärnan och amygdala 5,6. Hittills finns det flera modeller transgen mus som försöker simulera Ap 1-42 patologi AD. Beroende på stammen dessa djur visar sig vara användbar för att undersöka väljer patologiska funktioner i AD. Tyvärr, med undantag för två transgena linjer, APP23 och 5XFAD, dessa möss aldrig helt replikera neuronal förlust, en viktig aspekt av AD. Även med den neuronala förlusten observerats i APP23 och 5XFAD, den nervcellsdöd observed var subtil, åldersberoende och isolerad till ett fåtal utvalda områden 7,8.
Den direkt infusion av oligomert Ap 1-42 in i vildtyp mushjärna ger en utmärkt in vivo-modell som replikerar nervcellsdöd aspekten av amyloidopathy 1,9,10. Till skillnad från de vanligen används transgena musmodeller den oligomera Ap 1-42 infusionsmodell är perfekt för akut höja Ap 1-42 nivåer i en rumsliga och tidsmässiga sätt. Fördelen med att använda vildtyp möss för denna modell undviker potentiella ersättnings eller biverkningar från de mutationer som införts i transgen mus linjer. Tidigare studier har visat att infusion toxiska nivåer av Ap 1-42 i hippocampus framkallar neuron död i närheten av injektionsstället inom 1 vecka 1. Dessutom överensstämmer med observationen att Ap 1-42 är giftigt för kolinerga neuron 11 basalframhjärnankolinerga neuron (BFCN) befolkning som skjuter till hippocampus minskar 20-50% inom 7-14 dagar efter beta-amyloid infusion 1,10 hos möss, effektivt möjliggör undersökningar av isolerade neuronala kretsar i hjärnan. Sedan BFCN projektet ipsilateralt till gyrus gyrus hos hippocampus 12, för det mesta kontroll / fordonet och oligomera Ap 1-42 lösningar kan injiceras på båda sidor av hjärnan vilket gör jämförelser göras mellan vänster och höger halvkloten 1.
I denna rapport kommer vi att ge en detaljerad kirurgisk och injektion metod för vuxna vildtyp C57BL / 6J möss. Denna musstam är vald på grund av dess omfattande användning i forskning. Tekniskt kan varje hjärnregion riktas för infusion, men här kommer vi att använda gyrus dentatus i hippocampus som mål att illustrera tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: För alla djurförsök, var institutionella och nationella riktlinjer för vård och användning av försöksdjur följde.
1. Förbered kirurgiska instrument och lösningar för kirurgi
- Autoklav alla rostfria kirurgiska instrument.
- Förbered 70% etanol genom att späda 200 proof absolut etanol med steril molekylärbiologisk kvalitet avjoniserat destillerat vatten.
- Fäst 29 G nål till Hamilton sprutan. Rengör insidan av Hamilton spruta och kanyl genom att utarbeta och utstötande nanorent vatten upprepade gånger under 1 minut. Upprepa denna procedur med 70% etanol.
- Ta bort kolven och nålen från Hamilton sprutan. Lufttorka delarna i en huv med laminärt flöde O / N.
- Bestråla nålen och sprutan med ultraviolett ljus under 30 minuter före användning.
- Bered saltlösning genom upplösning NaCl i molekylärbiologisk kvalitet vatten till en slutlig vikt till volymkoncentration av 0,9%. SteriliZe lösningen genom att filtrera den genom 0,2 ^ m porstorlek filter.
2. Förbered Oligomer Ap 1-42
- Monomerize och resuspendera rekombinant human Ap 1-42 i DMSO till 5 mM precis som beskrivs i publikationen av Fa "och andra 13.
- Späd 5 mM Ap 1-42 med steril (1x) PBS till 100 | iM på dagen före operation.
- Blanda lösningen väl genom rivning.
- Inkubera Ap 1-42 lösning under 12 timmar vid 4 ° C.
Obs: Kontroll lösningar såsom späda DMSO i PBS eller förvrängd / bakåt Ap 1-42 peptid bör förberedas på samma sätt som A-beta 1-42.
3. Bestäm Injektions Koordinater
- Använd de vuxna mushjärna atlas för att bestämma den exakta anterior-posterior (AP), medial-laterala (ML), och dorsal-ventrala (DV) koordinaterna för hjärnan regionen av intresse 14.
Nejte: För att illustrera tekniken vi plockade gyrus gyrus i hippocampus som mål med följande koordinater från bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. Det negativa tecknet föregår AP värde indikerar att den är 2,00 mm posteriort om bregma. Den ± tecknet föregår ML värdet anger vänster och höger riktning från centrum. Slutligen, det negativa tecknet föregår DV indikerar den rör sig ventralt från hjärnans yta.
4. stereotaktisk ram Setup
- Använd en kirurgisk ansiktsmask, ren labbrock och sterila kirurghandskar.
- Torka stereotaxic instrument och musadapter med 70% etanol.
- Fastställa sterila operationslakan på disken.
- Placera stereotaxic instrument med musadapter ovanpå den sterila operationslakanet.
- Torka av musen värmedyna med 70% etanol. Placera värmedyna under stereotaktisk ram sängen. Använd allmänt ändamål laboratory märkband till band ner värmedyna över musadapter sängen.
- Fäst värmedynan till varmvatten recirculator pump enligt tillverkarens anvisningar.
- Slå på det varma vattnet recirculator pumpen och ställ in temperaturen till 37 ° C, och sedan vänta tills den når temperaturen.
- Anbringa 50 | il Hamilton-spruta med en 29 G nål på stereotaxic ramen genom att skruva på den på den motoriserade vertikala injektions axel enligt tillverkarens anvisningar.
- Slå på pärla autoklav och vänta tills den når tillverkarens förinställda temperaturen.
Obs! Detta används för att sterilisera instrument av rostfritt stål mellan djur. Det tar instrument 20 sek kontakt med pärlorna för sterilisering. - Slå på värmeplatta och ställ in den till 42 ° C och placera en ren tom bur ovanpå.
- Medan Hamilton sprutan fästs på stereotaxic ram använda motoriserade stereotaxic injector utarbeta Ap 1-42 lösning.
Obs: Dra upp mer än 4 il av lösningen i sprutan och sedan använda stereotaxic injektorn att ställa in injektionsvolymen. Manövrera injektor enligt tillverkarens instruktioner.
5. Animal Förberedelse
- Fastställa vikten av musen genom att använda vågen.
- Söva mus med ketamin / xylazin cocktail på 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin genom injicering intraperitonealt (IP). Övervaka djup anestesi genom förlusten av tå nypa reflex.
- Efter musen nedsövd ta hårklipparen och raka sitt huvud för att exponera huden över skallen.
- Placera musen på toppen av värmedyna ovanpå stereotaxic bädden.
- Använd spateln för att öppna munnen och placera framtänder inuti tänderna vakt. Säkra revolvern över ansiktet av musen. Spänn det försiktigt och inte för hårt.
- PosiTion de bilaterala örontvärstag i hörselgången för att säkra huvudet. Flytta varje ribban tills den träffar skallen, och vrid sedan skruven för att låsa den.
- För att se till att huvudet är säkrad använda pekfingret för att försiktigt trycka ner på huvudet. Om huvudet sitter fast ordentligt kommer det inte att ge ut eller flytta när du trycker på.
- Applicera en droppe ögonkräm eller ögondroppar för ögonen för att hålla dem fuktiga. Se till ögonen är fuktiga under hela det kirurgiska förfarandet.
- För att desinficera den kirurgiska platsen använda sterila bomullstoppar för att tillämpa betadinlösning på huden över skallen, följt av 70% etanol. Utför omväxlande Betadine och 70% etanol städning 2 gånger.
6. Kirurgi och Infusion
- Använd en skalpell för att göra en 2-3 mm snitt i mittlinjen i hårbotten, och sedan använda en rak fin sax för att förlänga snittet linjen till 1,0-1,5 cm för att exponera sagittalis sutur, bregma och lambda av skallen, landmärkes som stereotaktiska koordinater baserar sig på. Använd mikro klämmor för att hålla huden isär.
Obs: bregma och lambda positioner förklaras i mus hjärnan atlas "mushjärna i Stereotaxic Koordinater" 14. - Ta en bomullstuss, blöt den i steril saltlösning, och använda den för att rengöra skallen. Använd sedan en ren och torr bomullspinne för att torka skallen.
- Använd en steril fin spets penna för att markera en punkt på bregma. Använd stereotaxic mikromanipulator att placera Hamilton sprutan så att spetsen på nålen berör bara pricken på bregma.
- Spela in DV samordna.
- För att kontrollera om AP-axeln av skallen är nivån flytta Hamilton sprutan posteriort så att spetsen på nålen berör lambda punkten.
- Spela in DV läge. Kontrollera att DV-koordinater för bregma och lambda ligger inom 0,5 mm.
Obs: Målet är att minimera DV skillnaden mellan bregma och lambda.
- Använd micromanipulator att returnera Hamilton-spruta nålspetsen tillbaka till bregma prick.
- Spela start AP läge.
- Beräkna slutar AP ställning genom att subtrahera 2,00 mm från utgångs AP samordna.
- Använd mikromanipulator att flytta Hamilton sprutnålen till den slutliga AP samordna.
- Anteckna nuvarande ML samordna.
- Beräkna de vänstra och högra slutar ML koordinater genom att addera eller subtrahera 1,3 mm från utgångs ML koordinat.
- Använd mikromanipulator att flytta Hamilton sprutnålen till antingen slutar ML samordna.
- Tryck på nålspetsen till ytan av skallen på båda slutar ML koordinater och registrera DV koordinaterna och se till att värdena ligger inom 0,5 mm.
Obs: Målet är att minimera DV skillnaden mellan de två slutar ML koordinater. - Även på ett slut samordna dra nålen upp 0,5-1 cm över skallen. Ta en steril fin spets penna för att markera en punkt på the ytan av skallen. Upprepa detta steg för den kontralaterala sidan av skallen.
- Tryck på nålspetsen till ytan av skallen på båda slutar ML koordinater och registrera DV koordinaterna och se till att värdena ligger inom 0,5 mm.
- Sväng Hamilton sprutan klar ur vägen.
- Fäst 0,8 mm borrhuvud till borr. Ta borren med båda händerna, sätta armbågarna på ytan av tabellen för stabilitet, och placera borrhuvudet strax ovanför sharpie prick på antingen vänster eller höger ML samordna. Aktivera borren, sänka borrspetsen på skallytan för att införa ett hål i skallen. Upprepa detta steg för den kontralaterala sidan.
Obs! Vissa blödning kan uppstå från de nyligen införda hålen. Om det blöder sedan använda en ren och torr bomullspinne för att badda blodet. - Flytta Hamilton sprutan tillbaka i position över någon av de nyligen införda ML hål. Sänk Hamilton nålen bara förbi skallen. Vid det här laget vara noga med att inte punktera hjärnan. För att se till att nålen har passerat skallen tar pekfingret och tryck försiktigt nålen mot skallen för att göra sure nålen inte avsluta hålet.
- Spela start DV samordna.
- Beräkna slutar DV samordna genom att subtrahera 2,2 mm från utgångs DV samordna.
- Sänk ner nålen till slut DV samordna.
- Aktivera stereotaxic insprutningspumpen att pumpa 4 pl av Ap 1-42 in i gyrus dentatus med en hastighet av 0,5 | j, l / min.
- När infusionen är fullständig låt nålen kvar på plats under ytterligare 1 min för att minimera återflöde av lösning ut från injektionsstället.
- Flytta nålen till den andra sidan av hjärnan och upprepa steg från 6,13 till 6,18.
7. Djur Borttagning och postoperativ vård
- Skruva örat barer och ansikte / näsa vakt. Ta bort musen från apparaten.
- Använd en student standardmönster pincett för att dra stänga hårbotten och sedan försegla såret med sutur.
- Injicera 1 ml steril saltlösning i musen via IP för fukt.
- Iprojektet buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant för att lindra smärta.
- Behåll musen i ren tom bur ligger på toppen av 42 ° C värmeplatta tills den vaknar, sedan tillbaka till sitt hus bur med gott om mat och vatten.
- Administrera buprenorfin via subkutan injektion var 12 h under 3 dagar för smärtlindring.
8. Sutur Borttagande
- Söva musen med ketamin / xylazin cocktail på 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xlyazine av IP. Obs! Detta görs 7-10 dagar efter operationen.
- Använd en student standardmönster pincett och raka fina sax för att avlägsna suturen.
- Injicera 1 ml steril saltlösning i musen via IP för fukt.
- Behåll musen i en ren tom bur ligger på toppen av 42 ° C värmeplatta tills den vaknar, och sedan tillbaka till sitt hus bur med gott om mat och vatten.
9. djuroffer och Tissue Processing
- Bedöva musen och perfuse den med 4% paraformaldehyd 15, ta bort hjärnan och bearbeta det för cryosectioning 16.
Obs: Tidpunkten för djuroffer beror på försöks. Men för våra studier valde vi 7 och 14 dagar efter kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Föreliggande förfarande för framställning av human rekombinant oligomera Ap 1-42 ger lösliga oligomera ämnen bestående av monomerer, dimerer, trimerer och tetramerer (Figur 1A). Dessa lågmolekylära Ap 1-42 arter, men inte fibriller och plaketter, har visats i många inställningar för att vara mest giftigt för nervceller 1,4,9,17-19. För att avgöra om eller inte oligomera Ap 1-42 inducerar neurondöd i mushjärna Ap 1-42 (4 pl 100 iM stamlösning) infunderades i GD hippocampus i en hjärn 9 månader gammal vildtyp C57BL / 6J-möss. Vikten av en hippocampus för C57BL / 6J uppskattas till omkring 0,018 g och därför var leveransen av Ap 1-42 ungefär 100 mikrogram / g. Den kontra GD av samma mushjärna infunderades med en styr / vehikellösning - som bestod av lika stor volym av DMSO som användes i upplösning av Ap 1-42 utspädd i (1x) PBS - för jämförelse. Såsom tidigare nämnts oordning eller omvänd Ap 1-42-peptiden kan användas som kontroll för jämförelse, eftersom vi tidigare funnit någon effekt på hippocampala neuroner 1. Eftersom införandet av nålen in i hjärnan skapar lokal vävnadsskada (Figur 1B) och orsakar slutligen GD kollaps vi valt för att utföra efter injektion analyser vid injektionskanalen där vävnaden är fortfarande intakt. Inom 1 vecka av Ap 1-42 injektion GD uppvisade förhöjda Ap 1-42 nivåer i molekylskiktet och det polymorfa cellskiktet i närheten av injektionsstället (Figur 2A). Vid 7 och 14 dagar Ap 1-42 framkallade ökningar av TUNEL-positiv färgning och minskar i GD tjocklek, bekräftar neurodegenerativa effekterna av Ap 1-42 (Figur 2B).
Eftersom BF kolinerga neuroner skjuter till GDav hippocampus bestämde vi nästa om neuron förlust i GD utlöser BF degeneration. För denna studie var co-injiceras tillsammans med AP 1-42 i GD ett bakåtsträvande spårfluor (2% suspension). 7 dagar efter injektion fluorguld detekterades i BF (fig 2C), vilket tyder retrograd transport av etiketten via kolinerga neuroner. Därför för att kvantifiering i BF vi valde fluor-positiva neuroner eftersom det tyder på att de neuronala terminalerna utsattes för Ap 1-42 i GD. Vid både 1 och 2 veckor efter GD Ap 1-42 infusion, kärnan i den diagonala bandet - en delregion i BF där kolinerga neuronerna skjuter till GD - ipsilateralt Ap 1-42 -inmatade plats uppvisade ökningar av TUNEL-färgning och minskningar av kolinerga neuroner (Figur 2D). Den observerade neuronförlust i BF bekräftar tidigare studier som anknyter den destruktivaeffekterna av Ap 1-42 till BF-hippocampus vägen 1,10. Det är också viktigt att notera att från jämförelsen mellan 2 veckor tidpunkt till 1 vecka tidpunkt på sidan av kärnan i den diagonala band där kontrollen / vehikellösning injicerades i GD fanns ytterligare ökningar i Tunel färgning och minskningar av kolinerga neuroner (fig 2D, tabell). Dessa resultat återspeglar betydande minskningar i GCL tjocklek och ökar i TUNEL-positiv märkning (Figur 2B, tabell) i GD fordonets injicerade sida jämförelse mellan de två efter injektion tidpunkter, vilket innebär att den fysiska skador orsakade av nålen bidrar till degenerering över tiden. Även med denna oönskade bieffekt av nålen, de neurodegenerativa effekter av Ap 1-42 är fortfarande signifikant högre än de hos kontroll / vehikel-lösning (figur 2D). Sammantaget, det aktuella infusionsmodellen effectively återger de toxiska effekterna av Ap 1-42 i mushjärna inom 7 dagar att göra detta till en attraktiv modell för att studera kortsiktiga A-beta 1-42 stimulans.
Figur 1. Oligomer Ap 1-42 förberedelse och mushjärna injektionskanalen visualisering. (A) 2 iM Oligomer Ap 1-42 separerades på 10-20% tricingel och överfördes till nitrocellulosamembran. Membranet blottades med Ap 1-42 antikropp 6E10 (1: 1000). (B) Ap 1-42 (4 | j, l av 100 ^ M lösning) eller kontroll / vehikel infunderades i det vänstra och högra GD av hippocampus, respektive, av nio månader gamla C57BL / 6J-möss. Mössen överlevde under 7 dagar. Hjärnorna seriellt sektion vid 20 um per avsnitt. Hippocampus sektioner färgades för DAPI. Hash märken skildrainsprutningskanalen. Pilar visar kollapsade GD. Skalan stapel representerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Oligomer Ap 1-42 inducerar neurondöd i GD och BF. Kontroll / fordon eller Ap 1-42 (4 pl 100 iM lösning) infunderades i vänster och höger generaldirektorat av hippocampus, respektive 9 månader gamla C57BL / 6J-möss. Mössen överlevde under antingen 7 eller 14 dagar. Hjärnorna seriellt sektion vid 20 um per avsnitt. (A) 7 dagar efter injektion hippocampus sektioner färgade för Ap 1-42 (NU4 antikropp, 1: 2000). ML, molekylärt skikt; GCL, ganglion cellager; PCL, polymorf cellskikt. Skalstrecket representerar 50 pm. (B (C) vehikel eller Ap 1-42 sam-injicerades med fluorguld (2% lösning). Fluor märkning bestämdes i BF 7 dagar efter injektion. Bilder som innehåller BF var slumpmässigt valda. Fluor märkning användes för att bestämma regionen av intresse. När regionen av intresse identifierades intilliggande hjärnan skivor användes för att färga för markörer av intresse. De inläggningar är regioner där bilder i (D) väljs. Skalan stapel representerar 200 nm. (D) 7 eller 14 dagar efter injektion BF sektioner färgade för chat (1: 100, get polyklonal) eller TUNEL. *** P <0,001 jämfört med en vecka. * P <0,05 jämfört med vehikel. Kvantifiering gjordes på hela regionenav intresse. Gränsen mellan den mediala septum och det diagonala bandet avgränsas baserat på platsen av den främre kommissuren. Skalan stapel representerar 100 nm. (N = 5 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att uppnå en framgångsrik Ap 1-42 injektion försöks eller kirurgen måste: 1) Använd aseptisk teknik; 2) korrekt identifiera hjärnan regionen av intresse med exakta koordinater; 3) kunna korrekt säkra musen i stereotaxic ram med hjärnan planat i AP och ML axel; 4) har förmågan att driva mikromanipulator med precision; 5) säkerställa korrekt postoperativ vård. Om dessa viktiga steg följs musen ska överleva operationen utan observerbar infektion.
I enlighet med in vitro-studier, vi och andra har visat att A-beta 1-42 direkt infunderas i hippocampus framkallar neurondöd 1,4,9,10, som skildrar en av de viktigaste funktionerna i AD. Den degeneration är tydligt i närheten av injektionsstället, såsom visas med en minskad i volymen av gyrus gyrus som kompletteras av ökningar i markörer för degeneration 1. Vidare than kolinerga neuroner som skjuter till hippocampus dö i en bakåtsträvande sätt som visas av en minskning i kolinerg märkning och en ökning av TUNEL-positiv färgning i BF 1,10. Därför tjänar denna in vivo-modell som en utmärkt modell för att undersöka de halv akuta effekter av Ap 1-42 lokalt. Den främsta fördelen med denna injektion modellen är dess dynamiska karaktär: alla hjärnregion kan riktas och olika äldre djur kan användas. 9 månader gamla hanmöss valdes i våra experiment, eftersom vi tror att öka Ap 1-42 nivåer hos äldre möss bättre simulerar sjukdom som förekommer hos äldre personer. Dessutom strävar vi efter att hålla experimenten konsekvent med möss i samma ålder. Emellertid möss i alla åldrar skulle kunna användas för injektion. I det förflutna har vi experimenterat på möss som var 16 månader gammal och andra har använt möss som var 2 månader gamla 9,10. Endast hanmöss bör användas i studier som honmöss uppvisar ESTROGen nivå fluktuationer och östrogen är känt för att ha neuroprotektiva effekter 20. Även om många forskningsintressen kretsar kring de patologiska effekterna av Ap 1-42, är det också bevis för att låga eller fysiologiska Ap 1-42 nivåer krävs för normala funktioner för inlärning och minne 21,22. I dessa studier sänkte utredare koncentrationen av AP 1-42 injiceras och infunderas det i hippocampus 22,23, effektivt avslöjar ännu ett exempel på den dynamiska karaktären av nyttan av detta paradigm. Andra föreningar som har framgångsrikt infunderas stereotaxiskt inkluderar läkemedel, virus, siRNA, antikroppar och peptider 1,22-26 att undersöka olika effekter som sträcker sig från celldöd / överlevnad djurens beteende. Således finns det många tillämpningar för att använda denna infusionsparadigm.
Den beskrivna infusions metoden, medan de uppvisar olika potentialer i vivo studerar med hjälp av denna teknik, också kommer med inneboende begränsningar. Först, bara denna modell försöker att imitera effekterna av Ap 1-42 i en isolerad hjärnregion. För det andra, är injektionsstället skadas från införandet av en nål in i hjärnan. Detta bidrar till ytterligare celldöd och glios. Därför har analyser som skall utföras bort från injektionskanalen. Med lämplig kontroll över fordonet på den kontralaterala sidan av samma hjärnan detta bör inte vara ett problem eftersom det injicerade fordon och Ap 1-42 lösningar sprids till omgivande vävnad. För det tredje, eftersom BF kolinerga neuroner skjuter till hippocampus, den fysiska skador på hippocampus som framgår av kollapsen av GD av nålen (Figur 1B) kan oavsiktligt döda några BFCNs. Lyckligtvis undersöka neuronala kretsarna på kort sikt - inom 1 vecka av en single-shot infusion - inte utgör ett problem eftersom våra data tyder på att den ökadekolinerga död i den basala framhjärnan är resultatet av Ap 1-42 och inte från traumat av nålen; kontroll injektioner ger relevant analys. Uppgifterna tyder på att degeneration av GD är också nödvändigt för förlusten av BF kolinerga neuron eftersom dessa nervceller förlora sina synaptiska mål (Figur 2B). Tyvärr, för djur som överlevde fram till två veckor fordonet injicerade sidan visar signifikant förhöjning av BFCN död över en vecka efter fordons injicerade djur som förefaller bero delvis på degenerering och förtunning av gyrus dentatus följd av fysiskt trauma på nål. Men även i detta skede data tyder på att det är betydligt mer död i BF ipsilateralt Ap 1-42 -inmatade webbplats. För det fjärde kan identifiera subtila anatomiska gränser vara svårt att uppnå. Till exempel var gränsen mellan den mediala septum och det diagonala bandet bestäms baserat på platsen av den främrecommissure, en teknik som tidigare beskrivits 27. Vidare, på grund av den ipsilaterala BFs kolinerga neuronala projektion - huvudsakligen från mediala septum och vertikala extremiteten av det diagonala bandet (MS / DB) - till gyrus dentatus av hippocampus 12,28,29 beslutade vi att injicera en hemisfär med Ap 1-42 och använd den andra halvklotet som kontroll för jämförelse. Det är tänkbart att en angelägenhet för detta paradigm skulle vara korrekt identifiering av gränsen separera vänster och höger MS / DB. Medan MS ligger i mittlinjen regionen DBS är mer i sidled. För detta pågående arbete och vår senaste publikation 1 kunde vi bekvämt skilja vänster och höger DB. Vår kvantifiering avslöjar Chat (+) nervceller minskar med cirka 25% i budgetförslaget i Ap 1-42 -inmatade sida. Men vi inte upptäcka några betydande förändringar i chatten (+) neuroner i MS 1. På grund av den laterala loction av DBS och de förändringar observerade vi kände att vi var berättigat att använda fordon och Ap 1-42 injektioner i samma djur. Dessutom testar två olika experimentella förhållanden inom samma djur inte bara maximerar användningen av djuret utan också minskar potentiella djur till djur variabilitet. Medan våra experimentell design tillåter oss att jämföra vänster och höger halvkloten är det tänkbart denna jämförelse teknik kan inte vara möjligt i framtida studier, det vill säga, om den mediala septum är i fokus för studien. I sådana fall får varje djur kommer att tjäna som en experimentell tillstånd. Därför är användningen av djur vid bedömning av praktiker. För det femte kan ströminducering modellen användas för andra läs-outs såsom beteende? Vårt syfte med att använda den nuvarande A-beta 1-42 injektion modell var att bedöma de neuropatologiska effekterna av Ap 1-42 in vivo och jämför den med in vitro resultaten 1 (Figur 1B och 2B) när vi riktar injektionsnålen i eller i närheten av GD på 7 dagar förstörelsen av generaldirektoratet kan ge upphov till oönskade beteendeavvikelser. Följaktligen, om en studie kräver att undersöka effekten av Ap 1-42 på hippocampus-beroende beteende, då injektionsmålet kan behöva omplaceras nära hippocampus snarare än direkt in i den och låta Ap 1-42 att diffundera in hippocampus. Som sagt, användningen av ströminducering paradigm för beteendet testning är möjlig men kräver mer testerING och karakterisering, och den slutliga experimentella strategin kommer att bestämmas av slutanvändaren. Intressant nog har det funnits tidigare studier gnagare beteende som innebär extern leverans av Ap 1-42 direkt in i hjärnan. 22,30 Sammantaget dessa begränsningar måste beaktas när man utformar in vivo mus studier som använder denna modell.
Eftersom ingen enskild musmodell som finns fångar hela patologiska effekterna av AD stereotaxic Ap 1-42 infusions teknik ger praktiker med ett alternativ in vivo Ap 1-42 musmodell. När utförs av en välutbildad individ denna modell är bäst lämpad för korttidsstudier med fokus på effekterna av Ap 1-42 på en specifik hjärnregion eller kretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of neurologiska sjukdomar och Stroke bevilja NS081333 (till CMT), Alzheimers Association bidrag NIRG-10-171.721 och National Institute of Mental Health bidrag MH096702 (till UH) och National Institute on Aging finansierade Alzheimers Disease Research Center vid Columbia University pilotbidrag AG008702 (till YYJ och JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
