Abstract
La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative qui affecte le vieillissement de la population. Une caractéristique clé neuropathologiques de la maladie est la sur-production de bêta-amyloïde et le dépôt de plaques amyloïdes bêta dans les régions du cerveau des personnes souffrantes. Tout au long des années, les scientifiques ont généré de nombreux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer qui tentent de reproduire la pathologie bêta-amyloïde. Malheureusement, les modèles de souris seulement imitent de manière sélective les caractéristiques de la maladie. La mort neuronale, un effet important dans le cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, est visiblement défaut dans ces souris. Par conséquent, nous et d'autres avons employé une méthode d'infuser directement espèces oligomères solubles de bêta-amyloïde - formes de bêta-amyloïde qui ont été prouvés pour être plus toxique pour les neurones - stéréotaxique dans le cerveau. Dans ce rapport, nous utilisons mâles C57BL / 6J pour documenter cette technique chirurgicale de l'augmentation des niveaux bêta-amyloïde dans une région du cerveau sélectionnez. Lecible de perfusion est le gyrus denté de l'hippocampe, car cette structure du cerveau, ainsi que le cerveau antérieur basai qui est connectée par le circuit cholinergique, représente l'un des domaines de dégénérescence dans la maladie. Les résultats de l'élévation de bêta-amyloïde dans le gyrus denté par l'intermédiaire d'infusion stéréotaxique révèlent une augmentation de la perte de neurones dans le gyrus denté pendant 1 semaine, alors qu'il ya une augmentation concomitante de la mort cellulaire et cholinergique perte de neurones dans la branche verticale de la bande diagonale de Broca du cerveau antérieur basal. Ces effets sont observés jusqu'à 2 semaines. Nos données suggèrent que le modèle actuel de perfusion bêta-amyloïde fournit un modèle de souris alternative à aborder la mort des neurones spécifiques de la région en une base à court terme. L'avantage de ce modèle est que les bêta-amyloïde peut être élevé d'une manière spatiale et temporelle.
Introduction
les dépôts amyloïdes de plaques, qui sont composés de bêta-amyloïde (Aß 1-42), sont un élément clé de la pathologie de la maladie d'Alzheimer (MA). De nombreuses études ont montré que des niveaux élevés ou toxiques d'oligomères Aß recombinant 1-42 susciter la mort neuronale, la dystrophie synaptique, la perte et la dysfonction; ainsi que l'apprentissage et la mémoire déficits 1-4. Les régions du cerveau touchées comprennent l'hippocampe, le cortex et des structures sous-corticales telles que le cerveau antérieur basal et 5,6 de l'amygdale. À ce jour, il existe des modèles de souris transgéniques multiples qui tentent de simuler l'Aß 1-42 pathologie de la MA. Selon la souche de ces animaux se révéler utile pour l'examen de sélection caractéristiques pathologiques de la MA. Malheureusement, à l'exception de deux lignées transgéniques, APP23 et 5XFAD, ces souris ne répliquent intégralement la perte neuronale, un aspect clé de la MA. Même avec la perte neuronale observée dans APP23 et 5XFAD, l'obser de mort neuronalecb était subtil, dépend de l'âge, et isolée à quelques régions de sélectionner 7,8.
La perfusion directe de oligomères Aß 1-42 dans le cerveau de souris de type sauvage fournit un excellent modèle in vivo, qui reproduit l'aspect de la mort neuronale de amyloidopathy 1,9,10. Contrairement aux modèles de souris transgéniques communément utilisées, la Aß 1-42 oligomère modèle de perfusion est idéal pour l'élévation aiguë Aß 1-42 niveaux de manière spatiale et temporelle. L'avantage d'utiliser les souris de type sauvage pour ce modèle évite les effets de compensation ou secondaires potentiels des mutations introduites dans les lignées de souris transgéniques. Des études antérieures ont montré que la perfusion des niveaux toxiques de Aß 1-42 dans l'hippocampe provoque la mort des neurones au voisinage du point d'injection pendant 1 semaine 1. En outre, cohérent avec l'observation que Aß 1-42 est toxique pour les neurones cholinergiques du cerveau antérieur du 11 basaleneurone cholinergique population (BFCN) qui fait saillie à l'hippocampe est diminuée de 20 à 50% dans un délai de sept à quatorze jours suivant la bêta-amyloïde chez la souris 1,10 infusion, ce qui permet effectivement aux examens de circuit neuronal isolé dans le cerveau. Depuis projet BFCN ipsilatéralement le gyrus denté de l'hippocampe 12, pour le contrôle de la partie / véhicule et oligomères Aß 1-42 solutions les plus peut être injecté sur chaque côté du cerveau permettant d'effectuer des comparaisons entre les hémisphères droit et gauche et 1.
Dans ce rapport, nous allons fournir une méthodologie chirurgicale et l'injection détaillé pour C57BL / 6J de type sauvage adultes. Cette souche de souris est choisi en raison de sa large utilisation dans la recherche. Techniquement, une région du cerveau peut être ciblé pour perfusion, mais ici, nous allons utiliser le gyrus denté de l'hippocampe comme cible pour illustrer la technique.
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Protocol
Remarque: Pour toute expérimentation animale, institutionnel et des lignes directrices nationales pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.
1. Préparer Instruments chirurgicaux et solutions pour la chirurgie
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable.
- Préparer éthanol à 70% en diluant 200 preuve éthanol absolu avec d'eau déminéralisée stérile pour biologie moléculaire distillée.
- Fixez l'aiguille 29 G à la seringue Hamilton. Nettoyez l'intérieur de Hamilton seringue et l'aiguille par l'élaboration et l'eau éjection nanopure plusieurs reprises pendant 1 min. Répétez cette procédure avec 70% d'éthanol.
- Retirer le piston et l'aiguille de la seringue Hamilton. Sécher à l'air les pièces dans une hotte O à flux laminaire / N.
- Irradier l'aiguille et la seringue avec de la lumière ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation.
- Préparer une solution saline de NaCl par dissolution dans de l'eau de qualité moléculaire à un poids final de concentration volumique de 0,9%. Sterilize la solution par filtration à travers le filtre de 0,2 um pores.
2. Préparer oligomères Aß 1-42
- Monomerize et remettre en suspension humaine recombinante Aß 1-42 dans le DMSO à 5 mm exactement comme décrit dans la publication de la Loi »et d'autres 13.
- Diluer 5 mM de peptide Aß 1-42 avec stérile (1x) PBS à 100 pM, le jour avant la chirurgie.
- Bien mélanger la solution par trituration.
- Incuber Aß 1-42 solution pendant 12 heures à 4 ° C.
Note: solutions de contrôle telles que la dilution DMSO dans du PBS ou brouillés / inverser Aß 1-42 peptide doit être préparé de la même manière que Aß 1-42.
3. déterminer les coordonnées d'injection
- Les adultes atlas du cerveau de la souris pour déterminer l'exact antérieure-postérieure (AP), médial-latéral (ML), et dorso-ventral (DV) Coordonnées de la région du cerveau 14 d'intérêt.
Nonte: Pour illustrer cette technique, nous avons choisi le gyrus denté de l'hippocampe comme la cible avec les coordonnées suivantes dans le bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. Le signe négatif de la valeur AP indique qu'il est de 2,00 mm postérieure du bregma. Le signe ± précédant la valeur ML indique la direction à gauche et à droite du centre. Enfin, le signe négatif précédant la DV indique qu'il se déplace sur le ventre de la surface du cerveau.
4. Réglage cadre stéréotaxique
- Porter un masque chirurgical du visage, blouse de laboratoire propre, et des gants chirurgicaux stériles.
- Essuyez instrument stéréotaxique et l'adaptateur de souris avec 70% d'éthanol.
- Lay down champ opératoire stérile sur le comptoir.
- Placer l'instrument stéréotaxique avec adaptateur de la souris sur le dessus du drap chirurgical stérile.
- Essuyez le tampon de chauffage de la souris avec 70% d'éthanol. Placez le coussin chauffant sur le lit de cadre stéréotaxique. Utilisez but labora généralebande d'étiquetage tory à bande vers le bas le coussin chauffant sur le lit de l'adaptateur de la souris.
- Fixez le coussin chauffant à la pompe de recirculation d'eau chaude selon les instructions du fabricant.
- Tournez sur la pompe de recirculation d'eau chaude et de régler la température à 37 ° C, puis attendre jusqu'à ce qu'il atteigne la température.
- Fixez le 50 ul Hamilton seringue avec une aiguille 29 G sur le cadre stéréotaxique par vissage sur l'arbre d'injection vertical motorisé selon les instructions du fabricant.
- Allumez le stérilisateur de perles et d'attendre jusqu'à ce qu'il atteigne la température préréglée du fabricant.
Note: Ceci est utilisé pour la stérilisation des instruments en acier inoxydable entre les animaux. Il faut 20 secondes instruments de contact avec les billes de stérilisation. - Tournez sur la plaque chaude et mettez-le à 42 ° C et placer une cage vide propre sommet.
- Alors que la seringue Hamilton est fixé sur le cadre stéréotaxique utiliser le stéréotaxique motorisé injector de dresser la solution 1-42 Aß.
Remarque: Dresser plus de 4 pi de la solution dans la seringue, puis utiliser l'injecteur stéréotaxique pour régler le volume d'injection. Actionner l'injecteur selon les instructions du fabricant.
5. Préparation des animaux
- Déterminer le poids de la souris en utilisant la balance.
- Anesthésier la souris avec de la kétamine / xylazine cocktail à 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg par injection intrapéritonéale xylazine (IP). Surveiller la profondeur de l'anesthésie par la perte de pincement de l'orteil réflexe.
- Après la souris est sous sédatif prendre la tondeuse à cheveux et de se raser la tête pour exposer la peau sur le crâne.
- Placez la souris au-dessus du coussin chauffant au-dessus du lit stéréotaxique.
- Utilisez la spatule pour ouvrir la bouche et placez les incisives à l'intérieur de la garde de dents. Fixer le nez sur le visage de la souris. Serrer doucement et pas trop serré.
- PosiTion les traverses de l'oreille bilatéraux dans conduit auditif pour fixer la tête. Déplacez chaque barre transversale jusqu'à ce qu'il frappe le crâne, puis tourner la vis pour le verrouiller.
- Pour vous assurer que la tête est fixée utiliser votre index pour pousser doucement sur la tête. Si la tête est bien fixé, il ne donnera pas à déplacer ou lorsqu'il est pressé.
- Appliquez une goutte de crème pour les yeux ou collyre pour les yeux pour les garder humides. Assurez-vous que les yeux sont humides tout au long de la procédure chirurgicale.
- Pour désinfecter le site chirurgical utiliser des cotons-tiges stériles pour appliquer la solution de bétadine à la peau sur le crâne, suivie par 70% d'éthanol. Effectuez la bétadine alternatif et 70% d'éthanol nettoyage 2 fois plus.
6. Chirurgie et Infusion
- Utiliser un scalpel pour faire une incision de 2-3 mm sur la ligne médiane du cuir chevelu, puis utiliser une paire de ciseaux fines droites de prolonger la ligne d'incision à 1,0-1,5 cm pour exposer la suture sagittale, bregma et lambda du crâne, monuments dont les coordonnées stéréotaxiques sont basées sur. Utilisez micro pinces pour garder la peau de l'autre.
Remarque: Les positions de Bregma et lambda sont expliqués dans les atlas du cerveau de souris "le cerveau de la souris dans stéréotaxique Coordonnées" 14. - Prenez un coton-tige, la tremper dans une solution saline stérile, et l'utiliser pour nettoyer le crâne. Ensuite, utilisez un coton-tige propre et sec pour sécher le crâne.
- Utilisez un stylo à pointe fine stérile pour marquer un point sur le bregma. Utilisez le micromanipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue Hamilton de sorte que la pointe de l'aiguille touche juste le point sur le bregma.
- Enregistrez le DV coordonner.
- Pour vérifier si l'axe AP du crâne est de niveau déplacer la seringue Hamilton arrière de sorte que la pointe de l'aiguille touche le point de lambda.
- Notez la position de DV. Assurez-vous que coordonne le DV pour bregma et lambda sont à moins de 0,5 mm.
Remarque: L'objectif est de minimiser la différence DV entre bregma et lambda.
- Utilise lesicromanipulator pour retourner la pointe de l'aiguille de la seringue Hamilton de retour à la dot de bregma.
- Notez la position de départ AP.
- Calculer la position AP se terminant en soustrayant 2,00 mm de l'AP à partir de coordonnées.
- Utilisez le micromanipulateur pour repositionner l'aiguille de seringue Hamilton à la finale AP coordonner.
- Enregistrez le courant ML coordonner.
- Calculer la gauche et la droite se terminant ML coordonne en ajoutant ou soustrayant 1,3 mm à partir de la ML de coordonnées.
- Utilisez le micromanipulateur pour déplacer l'aiguille de la seringue Hamilton soit le ML se terminant coordonner.
- Touchez la pointe de l'aiguille à la surface du crâne sur les deux coordonnées terminant ML et d'enregistrer les coordonnées de DV et assurez-vous que les valeurs sont à moins de 0,5 mm.
Remarque: L'objectif est de minimiser la différence DV entre les deux coordonnées se terminant ML. - Alors que lors d'une fin de coordonner tirer l'aiguille jusqu'à 0,5-1 cm sur le crâne. Prenez un stylo à pointe fine stérile pour marquer un point sur ee surface du crâne. Répétez cette étape pour le côté opposé du crâne.
- Touchez la pointe de l'aiguille à la surface du crâne sur les deux coordonnées terminant ML et d'enregistrer les coordonnées de DV et assurez-vous que les valeurs sont à moins de 0,5 mm.
- Balancez la seringue Hamilton clair sur le chemin.
- Fixez 0,8 mm tête de forage à la perceuse. Prendre la perceuse à deux mains, mettre les coudes sur la surface de la table pour la stabilité, et la position de la tête de forage légèrement au-dessus du point de sharpie sur le côté gauche ou droit ML coordonnent. Activer la perceuse, abaisser la pointe du foret sur la surface du crâne d'introduire un trou dans le crâne. Répétez cette étape pour le côté controlatéral.
Remarque: Certains saignements peut se produire des trous nouvellement introduites. Si il ya un saignement puis utilisez un coton-tige sec et propre pour tamponner le sang. - Déplacez la seringue Hamilton de retour en position sur l'un des trous ML nouvellement introduites. Abaissez l'aiguille Hamilton juste après le crâne. À ce stade, veillez à ne pas perforer le cerveau. Pour vous assurer que l'aiguille a passé le crâne prendre votre index et poussez doucement l'aiguille contre le crâne à faire sure l'aiguille ne quitte pas le trou.
- Enregistrez le DV à partir de coordonnées.
- Calculer le DV se terminant coordonner en soustrayant 2,2 mm de la DV à partir de coordonnées.
- Abaissez l'aiguille vers le DV se terminant coordonner.
- Activer la pompe d'injection stéréotaxique pour pomper 4 pi de Aß 1-42 dans le gyrus denté à un taux de 0,5 pl / min.
- Lorsque la perfusion est terminée laisser l'aiguille reste en place pour une 1 min supplémentaire pour minimiser le reflux de la solution sur le site d'injection.
- Déplacer l'aiguille de l'autre côté du cerveau et répétez les étapes 6.13 à 6.18.
7. Retrait des animaux et Soins postopératoires
- Dévissez les barres d'oreilles et garde le visage / nez. Retirer la souris de l'appareil.
- Utilisez une pince étudiants de modèle standard pour tirer fermer le cuir chevelu, puis sceller la plaie avec de suture.
- Injecter 1 ml de solution saline stérile dans la souris via IP pour l'hydratation.
- Dansprojet buprénorphine (0,1 mg / kg) sous-cutanée pour soulager la douleur.
- Maintenir la souris dans la cage vide et propre mis sur le dessus de 42 ° C la plaque chaude jusqu'à ce qu'il se réveille, puis retourner dans sa cage de boîtier avec suffisamment de nourriture et d'eau.
- Administrer la buprénorphine par injection sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours pour soulager la douleur.
8. Suture Enlèvement
- Anesthésier la souris avec de la kétamine / xylazine cocktail à 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg xlyazine par IP. Note: Ceci est fait 7-10 jours après la chirurgie.
- Utilisez une pince étudiants de modèle standard et de ciseaux fins droites pour éliminer la suture.
- Injecter 1 ml de solution saline stérile dans la souris via IP pour l'hydratation.
- Maintenir la souris dans une cage vide et propre mis sur le dessus de 42 ° C la plaque chaude jusqu'à ce qu'il se réveille, puis retourner dans sa cage de boîtier avec suffisamment de nourriture et d'eau.
Sacrifice et le traitement des tissus 9. animale
- Anesthésier la souris et le perfuse avec 4% de paraformaldehyde 15, retirez le cerveau, et de les traiter pour cryosectioning 16.
Remarque: Le calendrier de sacrifice animal dépend de l'expérimentateur. Cependant, pour nos études, nous avons choisi 7 et 14 jours après la chirurgie.
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Representative Results
Le présent procédé de préparation d'oligomères Aß humaine recombinante 1-42 donne espèces oligomères solubles, comprenant des monomères, des dimères, des trimères et des tétramères (figure 1A). Ce faible poids moléculaire espèces Aß 1-42, mais pas les fibrilles et les plaques, ont été présentés dans de nombreux réglages pour être plus toxique pour les neurones 1,4,9,17-19. Pour déterminer si oui ou non oligomères Aß 1-42 induit la mort des neurones dans le cerveau de la souris Aß 1-42 (4 pi de 100 um solution stock) a été perfusé dans la DG de l'hippocampe dans un hémisphère de neuf mois de type sauvage vieille C57BL / 6J. Le poids d'un hippocampe de souris C57BL / 6J est estimée à environ 0,018 g et par conséquent la fourniture de Aß 1-42 était d'environ 100 ug / g. Le DG controlatéral du même cerveau de souris a été perfusé avec une solution de contrôle / de véhicule - qui consistait à volume égal de DMSO utilisé pour dissoudre Aß 1-42 dilué dans (1x) PBS - à titre de comparaison. Comme mentionné précédemment brouillés ou inverser Aß 1-42 peptide peut être utilisé comme témoin de comparaison puisque nous avons trouvé aucun effet sur les neurones hippocampiques 1 précédemment. Comme l'introduction de l'aiguille dans le cerveau crée des dommages aux tissus local (figure 1B) et provoque l'effondrement éventuel DG nous avons opté pour effectuer des analyses post-injection adjacente à l'appareil d'injection où le tissu est encore intacte. Moins de 1 semaine de Aß 1-42 injection le DG présentait des niveaux élevés d'Aß 1-42 dans la couche moléculaire et la couche de cellules polymorphes dans le voisinage du site d'injection (Figure 2A). A 7 et 14 jours Aß 1-42 a entraîné une augmentation de la coloration TUNEL positif et diminue la DG épaisseur, confirmant les effets neurodégénératifs de Aß 1-42 (figure 2B).
Parce que les neurones cholinergiques BF projet à la DGde l'hippocampe, nous avons déterminé si la prochaine perte de neurones dans le DG déclenche la dégénérescence de BF. Pour cette étude, un traceur FluoroGold rétrograde (2% de la suspension) a été co-injectée avec Aß 1-42 dans la DG. 7 jours après FluoroGold d'injection a été détectée dans le BF (figure 2C) suggérant un transport rétrograde de l'étiquette par l'intermédiaire des neurones cholinergiques. Par conséquent, aux fins de quantification dans le BF nous avons choisi FluoroGold neurones positifs car cela signifie que les terminaux neuronales ont été exposées à Aß 1-42 dans la DG. Dans les deux 1 et 2 semaines suivantes DG Aß 1-42 perfusion, le noyau de la bande diagonale - une sous-région de la BF où les neurones cholinergiques projet à la DG - ipsilatérale au site -injected Aß 1-42 augmentations de coloration TUNEL exposé et diminue dans les neurones cholinergiques (figure 2D). La perte neuronale observée dans le BF confirme les études antérieures reliant le destructeureffets de Aß 1-42 à la voie de 1,10 BF-hippocampique. Il est également important de noter que de la comparaison du point de temps de 2 semaines à 1 semaine point de temps sur le côté du noyau de la bande diagonale où la solution de contrôle / véhicule a été injecté dans la DG, il y avait de nouvelles augmentations de la coloration TUNEL et diminue dans les neurones cholinergiques (figure 2D, table). Ces résultats reflètent des diminutions significatives dans l'épaisseur GCL et les augmentations de marquage TUNEL positif (figure 2B, table) de la DG du véhicule injecté côté comparant entre les points de temps d'injection 2 de poste, ce qui implique que le traumatisme physique causée par l'aiguille contribue à la dégénérescence au fil du temps. Même avec cet effet secondaire indésirable de l'aiguille, les effets neurodégénératifs de Aß 1-42 sont encore nettement supérieurs à ceux de la solution / véhicule témoin (figure 2D). Pris dans leur ensemble, le courant modèle de perfusion effectively reproduit les effets toxiques de Aß 1-42 dans le cerveau de la souris dans les 7 jours ce qui en fait un modèle intéressant pour étudier court terme Aß 1-42 stimulation.
Figure 1. oligomères Aß 1-42 préparation et le cerveau de la souris tube d'injection visualisation. (A) 2 uM de peptide Aß 1-42 oligomère a été séparé sur un gel de tricine à 10-20% et transféré sur membrane de nitrocellulose. La membrane a été effacé avec le peptide Aß 1-42 anticorps 6E10 (1: 1000). (B) Aß 1-42 (4 pi de 100 um solution) ou de contrôle / véhicule a été perfusé dans la gauche et la droite DG de l'hippocampe, respectivement, de 9 mois vieux C57BL / 6J. Les souris ont été survécu pendant 7 jours. Les cerveaux ont été sectionnés en série à 20 um par section. Sections de l'hippocampe ont été colorées pour DAPI. Les marques de hachage représententle tube d'injection. Les flèches indiquent effondrés DG. La barre d'échelle représente 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. oligomères Aß 1-42 induit la mort des neurones dans le DG et le BF. Contrôle / véhicule ou Aß 1-42 (4 pi de solution 100 uM) a été perfusé dans la gauche et la droite DG de l'hippocampe, respectivement, de 9 mois vieux C57BL / 6J. Les souris ont été survécu pendant 7 ou 14 jours. Les cerveaux ont été sectionnés en série à 20 um par section. (A) 7 jours après sections d'injection hippocampique colorées pour Aß 1-42 (anticorps NU4, 1: 2000). ML, couche moléculaire; GCL, couche de cellules ganglionnaires; PCL, couche cellulaire polymorphe. La barre d'échelle représente 50 um. (B (C) du véhicule ou Aß 1-42 co-injectés avec FluoroGold (solution à 2%). Étiquetage Fluorogold déterminé dans le BF 7 jours après l'injection. Les diapositives contenant du BF ont été choisis au hasard. Étiquetage Fluorogold a été utilisé pour déterminer la région d'intérêt. Une fois que la région d'intérêt a été identifié tranches de cerveau adjacentes ont été utilisés pour colorer les marqueurs d'intérêt. Les encarts sont des régions où les images à (D) sont choisis. La barre d'échelle représente 200 um. (D) 7 ou 14 jours après sections BF d'injection souillé pour le chat (1: 100, polyclonaux de chèvre) ou TUNEL. *** P <0,001 par rapport à 1 semaine. * P <0,05 par rapport au véhicule. La quantification a été réalisée sur l'ensemble de la régiond'intérêt. La limite entre la cloison interne et la bande diagonale est délimitée sur la base de l'emplacement de la commissure antérieure. La barre d'échelle représente 100 um. (N = 5 souris). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Pour parvenir à une injection Aß 1-42 succès l'expérimentateur ou le chirurgien doit: 1) utiliser une technique aseptique; 2) identifier correctement la région du cerveau d'intérêt avec des coordonnées précises; 3) être en mesure de sécuriser convenablement la souris dans le cadre stéréotaxique avec le cerveau nivelé dans l'axe AP et ML; 4) ont la capacité de faire fonctionner le micromanipulateur avec précision; 5) assurer des soins post-opératoire appropriée. Si ces étapes clés sont suivies, la souris doit survivre à la chirurgie sans infection observable.
En accord avec des études in vitro, nous et d'autres ont montré que Aß 1-42 directement infusé dans l'hippocampe provoque la mort des neurones 1,4,9,10, représentant l'une des principales caractéristiques de la MA. La dégénérescence est évident au voisinage du point d'injection, comme indiqué par une diminution du volume du gyrus denté qui est complétée par des augmentations des marqueurs pour une dégénérescence. En outre, til cholinergiques neurones qui se projettent sur l'hippocampe meurent de façon rétrograde, comme indiqué par une diminution de l'étiquetage cholinergique et une augmentation de la coloration TUNEL-positives dans le BF 1,10. Ainsi, ce modèle in vivo sert comme un excellent modèle pour étudier les effets aigus de semi-Aß 1-42 localement. Le principal avantage de ce modèle d'injection est sa nature dynamique: toute région du cerveau peut être ciblée et différents animaux âgés peut être utilisé. Vieilles souris mâles 9 mois ont été choisis dans nos expériences parce que nous croyons que l'augmentation Aß 1-42 niveaux chez les souris âgées simule mieux la maladie qui se produit chez les personnes âgées. En outre, nous nous efforçons de garder les expériences cohérente en utilisant des souris du même âge. Cependant, les souris de tout âge pourraient être utilisés pour l'injection. Dans le passé, nous avons expérimenté sur des souris qui étaient 16 mois et d'autres ont utilisé des souris qui étaient âgés de 2 mois 9,10. Seulement souris mâles devraient être utilisés dans les études que les souris femelles présentent estrogen fluctuations du niveau et l'oestrogène est connu pour avoir des effets neuroprotecteurs 20. Bien que de nombreux intérêts de recherche tournent autour des effets pathologiques de Aß 1-42, il est également prouvé que Aß 1-42 niveaux faibles ou physiologiques sont nécessaires pour les fonctions normales de l'apprentissage et de la mémoire 21,22. Dans ces études, les enquêteurs abaissé la concentration de Aß 1-42 injecté et infusés dans l'hippocampe 22,23, révélant efficacement encore un autre exemple de la nature dynamique de l'utilité de ce paradigme. D'autres composés qui ont été infusés avec succès stéréotaxique comprennent les médicaments, les virus, les siARN, des anticorps, des peptides et 1,22-26 pour enquêter sur divers effets allant de la mort cellulaire / survie au comportement animal. Ainsi, il existe de nombreuses applications pour l'utilisation de cette perfusion paradigme.
La méthodologie de perfusion décrit, tout en présentant différents potentiels dans vIvo études utilisant cette technique, est également livré avec des limites inhérentes. Tout d'abord, ce modèle ne tente de reproduire les effets du peptide Aß 1-42 dans une région du cerveau isolé. Deuxièmement, le site d'injection est endommagé à partir de l'introduction d'une aiguille dans le cerveau. Ceci contribue à la mort cellulaire supplémentaire et une gliose. Par conséquent, l'analyse doit être effectuée à une distance à partir du tube d'injection. Avec un contrôle de véhicule approprié sur le côté controlatéral du même cerveau cela ne devrait pas être un problème car le véhicule injecté et Aß 1-42 solutions propagation aux tissus environnants. Troisièmement, parce que les neurones cholinergiques BF projettent à l'hippocampe, les dommages physiques de l'hippocampe comme en témoigne l'effondrement de la DG par l'aiguille (figure 1B) peut tuer par inadvertance certains BFCNs. Heureusement, l'examen de la circuits neuronaux dans le court terme - moins de 1 semaine d'une perfusion unique-shot - ne pose pas un problème car nos données indiquent que l'augmentationmort cholinergique dans le cerveau antérieur basal est le résultat de Aß 1-42 et non du traumatisme de l'aiguille; injections de contrôle fournissent une analyse appropriée. Les données suggèrent que la dégénérescence de la direction générale est également nécessaire que la perte de neurones cholinergiques comme BF ces neurones perdent leurs cibles synaptiques (figure 2B). Malheureusement, pour les animaux survivants jusqu'à 2 semaines du côté injecté du véhicule montre une élévation significative de BFCN mort sur 1 semaine post-véhicules animaux injectés qui semble être due en partie à la dégénérescence et l'amincissement de la gyrus dentelé résultant du traumatisme physique de la aiguille. Toutefois, même à ce stade que les données suggèrent qu'il ya beaucoup plus de décès dans le BF ipsilatérale au site -injected Aß 1-42. Quatrièmement, l'identification des limites anatomiques subtiles peut être difficile à atteindre. Par exemple, la limite entre la cloison interne et la bande diagonale a été déterminée sur la base de l'emplacement de la partie antérieurecommissure, une technique qui a été décrit précédemment 27. En outre, en raison de la projection BF neuronale cholinergique ipsilatéral - principalement de la cloison interne et la branche verticale de la bande diagonale (MS / DB) - au gyrus denté de l'hippocampe 12,28,29 nous avons décidé d'injecter une hémisphère avec le peptide Aß 1-42 et utiliser l'hémisphère opposé comme témoin de comparaison. Il est concevable que le souci de ce paradigme serait l'identification correcte de la frontière qui sépare gauche et à droite MS / DB. Alors que la station mobile se trouve dans la région de la ligne médiane, les blocs de données sont plus latérale. Pour ce travail actuel et notre plus récente publication 1 nous étions en mesure de distinguer confortablement DB gauche et à droite. Notre quantification révèle Chat (+) neurones diminuent d'environ 25% dans la DB dans le côté -injected Aß 1-42. Cependant, nous ne détectons pas de changements significatifs dans le chat (+) neurones dans le MS 1. En raison de la loc latéraleation de la DB et les changements observés, nous sentions que nous étions justifié d'employer véhicule et Aß 1-42 injections dans le même animal. En outre, l'essai 2 conditions expérimentales différentes au sein du même animal non seulement maximise l'utilisation de l'animal mais aussi de réduire la variabilité potentielle d'animal à animal. Bien que notre conception expérimentale nous permet de comparer hémisphères gauche et droit, il est concevable cette technique de comparaison peut ne pas être réalisable dans les études futures, à savoir, si le septum médian est l'objectif principal de l'étude. Dans ce cas, chaque animal devra servir de condition expérimentale. Par conséquent, l'utilisation des animaux est à la discrétion des expérimentateurs. Cinquièmement, le modèle peut d'injection de courant être utilisé pour d'autres lectures-out tels que le comportement? Notre but, en utilisant le modèle actuel d'injection Aß 1-42 était d'évaluer les effets neuropathologiques de Aß 1-42 in vivo et de la comparer aux résultats in vitro 1 (figure 1B et 2B) lorsque nous ciblons l'aiguille d'injection dans ou près de la DG à 7 jours, la destruction de la DG peut donner lieu à des anomalies comportementales involontaires. Par conséquent, si une étude nécessite l'examen de l'effet du peptide Aß 1-42 sur le comportement de l'hippocampe-dépendante, puis la cible d'injection peut être repositionné près de l'hippocampe, plutôt que directement en elle et Aß 1-42 permettre de diffuser dans l'hippocampe. Cela dit, l'utilisation du paradigme de l'injection de courant pour les tests de comportement est possible mais nécessite plus de testsING et la caractérisation et la stratégie expérimentale final sera déterminé par l'utilisateur final. Fait intéressant, il ya eu des études sur le comportement des rongeurs antérieures qui impliquent la prestation externe de Aß 1-42 directement dans le cerveau. 22,30 Pris ensemble, ces limitations doivent être considérés lors de la conception des études de souris in vivo employant ce modèle.
Depuis pas de modèle unique de la souris dans l'existence saisit les effets pathologiques de la CN Aß 1-42 technique stéréotaxique de perfusion fournit des expérimentateurs une alternative vivo Aß 1-42 modèle chez la souris. Quand elle est réalisée par un individu bien formé ce modèle est le mieux adapté pour les études à court terme portant sur les effets de Aß 1-42 sur une région spécifique du cerveau ou les circuits.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies accorder NS081333 (à CMT), subvention Association des NIRG-10-171721 d'Alzheimer et de l'Institut national de santé mentale subvention MH096702 (UH), et l'Institut national sur le vieillissement, la recherche financée par la maladie d'Alzheimer Centre à l'Université Columbia subvention pilote AG008702 (à YYJ et JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
