Abstract
Syntetiske materialer er kendt for at initiere kliniske komplikationer, såsom inflammation, stenose, og infektioner, når implanteres som vaskulære substitutter. Kollagen er blevet grundigt anvendes til en lang række biomedicinske anvendelser og betragtes som en gyldig alternativ til syntetiske materialer på grund af dets iboende biokompatibilitet (dvs. lav antigenicitet, inflammation og cytotoksiske responser). Imidlertid har de begrænsede mekaniske egenskaber og den relaterede lave hånd-evne kollagengeler hæmmet deres anvendelse som stillads materialer til karvæv engineering. Derfor rationalet bag dette arbejde var først at konstruere cellularized kollagengeler i en rørformet geometri og andet at styrke glatte muskelceller drevet reorganisering af kollagen matrix for at opnå væv stive nok til at blive håndteret.
Den her beskrevne strategi er baseret på den direkte montage af kollagen og glatte muskelceller (konstruktion) i en 3D cyndrical geometri med anvendelse af en støbeteknik. Denne proces kræver en modningsperiode, hvor konstruktionerne dyrkes i en bioreaktor under statiske forhold (uden anvendt eksterne dynamiske mekaniske begrænsninger) i 1 eller 2 uger. Den "statisk bioreaktor" giver et overvåget og kontrolleret sterilt miljø (pH, temperatur, gasudveksling, næringsstofforsyning og fjernelse af affald) til konstruktionerne. Under dyrkning periode blev tykkelsesmålinger udført for at vurdere celler-drevne ombygning af collagenmatrix og glucose forbrug og lactatproduktion blev målt til at overvåge cellerne metabolisk aktivitet. Endelig blev mekaniske og viskoelastiske egenskaber vurderes for de resulterende rørformede konstruktioner. Til dette formål, specifikke protokoller og en fokuseret knowhow (manipulation, gribende, der arbejder i hydreret miljø, og så videre), blev udviklet for at karakterisere de manipuleret væv.
Introduction
Karvæv engineering forestiller forskellige strategier rettet mod fremstilling af manipuleret fartøjer, herunder transplantater på basis af syntetiske stilladser, celle ark-baserede væv-manipuleret blodkar (TEBVs) og ekstracellulær matrix (ECM) komponenter-baserede TEBVs. Blandt disse fremgangsmåder, syntetiske polymerer udviser gode mekaniske egenskaber, men deler en fælles ulempe, da de mangler bioaktivitet 1. Cellelaget-baserede metode muliggør produktionen af konstruerede vaskulære erstatninger med høje mekaniske egenskaber, men den tid, der kræves for at fremstille sådanne transplantater er ca. 28 uger 2. Naturlige biopolymerer af ECM, såsom collagen, elastin, fibrin 3 eller en kombination deraf, forbliver guld faste materialer til væv engineering scaffolds. Dette er primært af den grund, at disse materialer har en generelt god biokompatibilitet samtidig være i stand til at inducere funktionelle cellulære reaktioner 4-5. Blandt disse biopolymers, type I collagen er en af de mest rigelige og fremherskende bærende protein af ECM i mange væv såsom hud, blodkar og sener. Omfattende arbejde er blevet udført på de mekaniske egenskaber af kollagen 6 - 8, men der har kun været et par undersøgelser om cellulære ombygning af kollagengeler under statisk modning. Cellular remodeling refererer til de strukturelle ændringer af kollagen matrix induceret af celler, der kan påvirke stabiliteten af kollagen fibriller netværk 9. Som en naturlig stillads, kan relativt store mængder af type I collagen isoleres, steriliseres og opbevares fra forskellige kilder såsom rotte-hale sener 10. Forståelse cellulære interaktioner med collagen og de tilhørende samlede mekaniske adfærd af de cellularized kollagen stilladser (konstruktioner) er et væsentligt skridt til opførelse af væv. Collagen-baserede TEBVs kan behandles ved direkte at blande celler med kollagenunder forberedelse gel og yderligere formes til bestemte former såsom rørformede og plane 11. Vaskulære celler inde i geler formere og remodel type I collagen 12. Således er denne metode omgår behovet for specifikke makroporøsitet, der repræsenterer en af de væsentlige spørgsmål i udviklingen af stilladser til vævsdyrkningsapplikationer. Men de store ulemper ved kollagengeler er deres lave mekaniske egenskaber sammenlignet med syntetiske materialer 13.
I denne undersøgelse blev et levedygtigt væv med homogen fordeling af celler manipuleret ved direkte blanding af collagen med celler i en et-trins proces. "Statiske bioreaktorer" blev anvendt til 1 eller 2 ugers statisk modning af cellularized kollagengeler (uden påsat ydre dynamiske mekaniske bindinger). Under dyrkningen, collagenmatrix remodeling forekom, hvilket giver strukturel styrkelse til konstruktionerne. Desuden er disse konstruktioner var ready at blive overført til en roterende-væg bioreaktor og en homogen endotel var opnået. Desuden i dette arbejde en mekanisk prøvningsprotokol foreslås også at tilvejebringe en passende ny tilgang i karakterisering af mekaniske egenskaber af rørformede bløde væv.
Sammenfattende er dette arbejde præsenterer en fremgangsmåde til in vitro hurtig fremstilling og modning af karvæv, der er stærke nok til at blive håndteret, ikke kun for biologiske og mekaniske karakteriseringer, men også for yderligere mekanisk konditionering i en dynamisk bioreaktor, der betragtes som en afgørende træde i regenerering af væv.
Protocol
1. Fabrikation og forsamling Static bioreaktor
- Fabrikation af reservoiret
- Forbered 50 ml centrifugerør som et dyrkningsmedium reservoir for bioreaktoren.
- Lav to porte ved at bore to 5 mm diametre huller ved 20 mm fra bunden og toppen af reservoiret, hhv. Sæt derefter to luer fittings i 5 mm længde silikone rør. Press-passer disse luerfittings gennem hullerne, og forsegle alle forbindelser med medicinsk silikone lim.
- Indsætte et 0,22 um filter ind i den øvre port af reservoiret (figur 1A).
- Indsæt en luer septum i den nedre åbning af reservoiret (figur 1A).
- Dorn-cap Assembly
- Bore et hul med en diameter på 4,5 mm i midten af det ventilerede hætte af reservoiret røret uden at beskadige filteret membran, der dækker beluftning huller.
- Forbered en omrører (diameter = 4,5 mm, længde = 100 mm) Som en dorn for konstruktionen.
- Forbered to silikone koniske propper (længde = 10 mm, midterste hul diameter = 4,5 mm).
- Saml dornen og hætten (dorn-cap-kompleks) som beskrevet i figur 1B.
- Prespasning dornen ind i hullet. Sæt de 2 propper over dornen, så hætten er monteret mellem dem. Justere placeringen af dornen, således at dets nyttige længde er 78 mm.
- Påfør en primer og derefter medicinsk silikone lim til overfladerne, der vil være i kontakt før tiltrædelsen af hætten og silikone koniske propper sammen. Fjern det overskydende lim på hætten.
- Lad det tørre ved stuetemperatur i 1-3 dage.
- Fabrikation af Gaze-greb
- Forbered 3 silikone rør (rør 1: indre diameter = 6,4 mm, længde = 5 mm, rør 2: diameter = 6,4 mm, længde = 10 mm, og rør 3: diameter = 3,1 mm, længde = 12 mm).
- Saml gaze-greb som beskriverd i figur 1C.
- Cut rør 1 på langs, og åbn det over røret 2. Hold dem sammen med silikone lim.
- Skær steril kirurgisk gaze til 5 cm x 7 cm plader, og rul derefter stramt gaze over røret 3 langs den længste side af gaze. Sæt røret 1-rør 2 komplekset over gaze.
- Tilføj silikone lim til at klæbe sammen gaze, røret 1-rør 2 komplekset og røret 3. Skær gaze med en længde på 8 mm.
- Montering og Sterilisation
- Saml dornen-cap-kompleks og gaze-greb som beskrevet i figur 2.
- Coat dornen med medicinsk kvalitet fedt (figur 2A). Placer gaze-greb over dornen (figur 2B). Afstand grebene til fast værdi på 35 mm fra hinanden.
- Forbered en rørformet støbeform ved at fjerne den nederste del af en 10 ml sprøjte med en tabel sav (endelige længde = 8 mm) (
- Sæt formen over gaze greb udstyrede dorn-lågkonstruktionen (bolig-skimmel kompleks), snap-montering mug på silikone prop (figur 2C).
- Autoklaver reservoiret og huset-formen kompleks.
Bemærk: Vær omhyggelig med at holde på silikone prop stramt, når du sætter formen for at undgå sin løsrivelse.
- Saml dornen-cap-kompleks og gaze-greb som beskrevet i figur 2.
2. Engineering glatte muskelceller Collagen Gel-baserede Konstruktioner og Static Modning
- Engineering konstruktioner
- Udvide porcine aorta glatmuskelceller (pSMCs) i 175 cm 2-dyrkningskolber fyldt med 20 ml komplet dyrkningsmedium bestående af Dulbeccos Modified Eagle Medium suppleret med 10% (v / v) porcint serum (PS), 10% (v / v ) føtalt bovint serum (FBS), 1% (v / v) penicillin-streptomycin (pen-strep).
- Ved ≈90% konfluens, løsnes pSMCs (passage 2-4) ved at fjerne dyrkningsmediet frakolbe af pSMCs, tilsætning af 5 ml trypsin-opløsning (1x i phosphatbufret saltopløsning, PBS) og inkubering i 10 min (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed).
- Resuspendere pSMCs ved en koncentration på 4 x 10 6 celler / ml i komplet dyrkningsmedium.
- Forbered kollagen opløsning som tidligere beskrevet 10.
- Uddrag og indsamle kollagenbundter fra rotte-hale sener i en PBS-opløsning.
- Overfør kollagenfibrene derefter i acetone (5 min), isopropanol 70% (vol / vol) (5 min) og eddikesyre (0,02 N, 48 timer, 4 ° C) opløsninger.
- Blend den viskøse opløsning og fryse ved -20 ° C i 3 dage.
- Lyofilisere den frosne opløsning til opnåelse af collagen-svampe.
- Solubilisere collagensvampe i eddikesyre-opløsning (0,02 N) ved en koncentration på 4 g / l og der centrifugeres ved 29.581 g kraft i 45 minutter.
- Steriliser kollagenopløsningen gennem dialyse proces mod efterfølgende solutions eddikesyre (0,02 N, 1 time), chloroform 1% (v / v, 1 time) og eddikesyre (0,02 N, steril opløsning ændres hver 2 dage til 1 uge).
- Indsamle den sterile collagen-opløsning (4 g / l) i en steril cellekultur hætte.
- Forbered cellularized kollagengeler som vist i figur 3.
- Forbered 50 ml steril bufferopløsning ved blanding 35 ml DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml NaOH (1 N) i 8 ml sterilt deioniseret vand.
- Forbered celler og kollagen gel blanding i en beholder placeret i is ved at blande 50% (v / v) steril collagen-opløsning (4 g / l eddikesyre 0,02 N) med 25% (v / v), i pufferopløsning og 25% (v / v) af suspensionen af pSMCs i komplet dyrkningsmedium.
- Mål blandingens pH og sikre, at det er mellem 7,0 og 7,4.
- Hæld forsigtigt 9 ml celler-and-kollagen blandingen i ovennævnte boliger / skimmel kompleks (trin 1.4.3, figur 3A-B
- Lad det gelere ved stuetemperatur i 1 time under cellekulturen hætte (figur 3B).
- Modning i Static bioreaktor
- Fjerne formen (figur 3C) og overføres forsigtigt konstruktionen i reservoiret indeholdende 35 ml dyrkningsmedium (figur 3D).
- Inkubere konstruktet (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed) i lodret position for 1 eller 2 ugers statisk modning.
- Installere et web-kamera (forseglet for at sikre isolering) inde i inkubatoren foran konstruktionen.
- Ændre dyrkningsmediet hver 2 dage ved at suge den gamle medium fra luer septum port og re-påfyldning med en ækvivalent mængde af frisk dyrkningsmedium.
- Måling af tykkelse og metaboliske aktivitet af SMC'er-collagen Gel-baserede konstruktioner under statisk kultur
- Placer scanning laser interferometer i cellen culture hætte og vend det fra lodret til vandret position ved hjælp af et vaterpas.
- Overfør bioreaktoren i cellekultur hætte og fjerne konstruktionen fra reservoiret.
- Overfør konstruktet (stadig monteret på dornen) ind i forløbet for laserstrålen, og placere den strengt ortogonalt i forhold til stråleaksen (som vist i figur 4).
- Aflæs værdien vises på skærmen af scanning laser interferometer, der svarer til den udvendige diameter af konstruktionen.
- Beregn vægtykkelsen af konstruktionen baseret på dets ydre og indre diameter (dvs. dornen diameter).
Bemærk: Gentag trin 2.3.1 til 2.3.5 hver time for de første 12 timer og derefter hver 24 timer. - Anvende 1 ml af det gamle dyrkningsmedium (samplet ved udskiftning af dyrkningsmediet, trin 2.2.4) til måling af lactat og glukosekoncentrationer med blodet gasanalysatoren.
- Brug 1 ml affrisk dyrkningsmedium som en baseline niveau af glucose og lactat koncentrationer målinger 14.
Bemærk: Gentag trin 2.3.6 og 2.3.7 hver 2 dage efter dyrkningsmedium forandring.
- Konstruer Høst for yderligere mekanisk og biologisk Ccharacterizations
- Efter 1 eller 2 uger af statisk modningsperiode, overføre den statiske bioreaktor ind i cellekultur hætte.
- Overfør forsigtigt den modne konstrukt fra dens dorn (Supplemental Video 1) til en diameter på 100 mm petriskål indeholdende 40 ml frisk dyrkningsmedium (figur 5 og figur 7A).
3. Mekanisk karakterisering af konstruktionerne i den langsgående og rundtgående Rutevejledning
- Installere den eksperimentelle opstilling bestående af den mikromekaniske testeren er udstyret med en 5 eller 10 N vejecelle og et bad indeholdende PBS ved 37 ° C for at holde prøverne ent pseudo-fysiologiske betingelser (figur 6).
- Balance vejecellen og extensometerets.
Bemærk: Afbalancering er en funktion integreret i mikromekaniske testeren består i at nulstille den viste udvidelse værdi og den viste belastning værdi, mens ingen prøve er monteret på maskinen. Denne funktion gør det muligt at definere reference for begge målinger. - Montering de rørformede konstruktioner på den mekaniske apparater: længderetning.
Bemærk: Udfør langsgående træthed test direkte på hele rørformede konstruktioner. Bruge in-house-bygget gribeindretningerne at forbinde gaze greb af konstruktionerne til vejecellen og til basis af PBS bad.- Monter rørformede konstruere ind på gribende enheder (figur 7B), efter høst procedure (afsnit 2.4).
- Wrap gribeindretningerne og gaze greb sammen med Teflon tape for at forhindre enhver glidning af gaze greb under testen.Monter prøven på mikromekaniske testeren (Figur 7C).
- Montering af ringformede konstruktioner på mekanisk apparatur: omkredsretningen.
Bemærk: Udfør omkredsen træthed test på ringformede prøver sektioneret fra de rørformede konstruktioner. Brug to stålstænger rustfrie som greb til at holde prøver.- Monter rørformede konstruere på et plastrør som en støtte markeret med 5 mm huller (Figur 7B), efter høst (afsnit 2.4).
- Skær 10 mm ringe fra den rørformede konstruktion.
- Mål længden af prøven ved anvendelse af en skydelære til yderligere analyser.
- Monter ringformede eksemplar på stænger af rustfrit stål i den mikromekaniske testeren (Figur 7C). Sørg for at placere prøven i centrum af søjlerne.
Bemærk: plastrør i trin 3.4.1 og et skæresystem, som vist i figur 7B
- Træthed test på konstruktioner i den langsgående eller rundtgående retning.
- Stræk konstruktionen til sin oprindelige målelængde.
- Fastholde konstruktionen i denne stilling i 10 minutter i pseudo-fysiologisk miljø.
- Påfør 10% cyklisk belastning af den oprindelige målelængde (30 cyklusser) til konstruktionen ved 5% / sek tøjningshastighed.
- Gentag trin 3.5.3 ved inkrementelle trin på 10% cyklisk belastning indtil svigt af prøven.
Bemærk: Brugen af pseudo-fysiologiske miljø kræver under hensyn til opdrift og inerti gribe- system, påvirke målingen af den påførte belastning. - Optage baggrunden på følgende måde:
- Flyt lastbærende til den oprindelige målelængde.
- Gentag trin 3.5.3 og 3.5.4 uden prøve monteret, og holde gribende er tilsluttet vejecelle (kun 1 cyklus er vandskravenerød).
4. Luminal endothelialisering af konstruktioner
Bemærk: Efter efter høst protokol (afsnit 2.4), konstruktionerne modstå håndtering skal monteres i den roterende væg bioreaktor for den videre endothelisering.
- Roterende-wall Bioreactor Design
- Bore et hul med en diameter på 4,5 mm i midten af det ventilerede hætte af reservoiret røret uden at beskadige filteret membran, der dækker beluftning huller.
- Press-passe en dorn (diameter = 4,5 mm, længde = 40 mm) ind i hullet og fastgør dornen som beskrevet i trin 1.1.2.
- Forbered to C-formede silikone støtte til konstruktionen ydre diameter = 14 mm; indre diameter = 8 mm).
- Placer en roterende motor i den ene ende af den roterende væg bioreaktor og et leje på anden ende (figur 8B).
- Lumen endotelialisering
- Udvid menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC'er) i 25 cm 2-dyrkningskolber med 5 ml M199 dyrkningsmedium suppleret med 10% (v / v) PS, 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) pen-strep i petriskålen inde i en inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed) Til 90% konfluens.
- Udarbejde 1.5 ml af proteinet coatingopløsning pr konstrukt kræves for optimal celleadhæsion ved fortynding af koncentratet proteinblandingen til 10,5 ng / ml i serumfrit endotelcelle dyrkningsmedium.
- Mål længden af konstruktionen ved hjælp af en skydelære.
- Beregn den luminale volumen V og den luminale arealet A af konstruktionen som: V = D i 2 L / 4 og A = D i L henholdsvis (hvor D i er den indre diameter svarende til dornens diameter, og L er længden af konstruktionen).
- Placer konstruktionen i midten af reservoiret efter høst procedure (afsnit 2.4).Brug C-formet silikone støtte til at fastgøre konstruktionen ved begge ender til reservoiret (figur 8A).
- Fyld beholderen med 35 ml dyrkningsmedium.
- Fyld 75% af det beregnede luminale volumen af konstruktionen (V) med proteinet coatingopløsning fremstillet i trin 4.2.2. Luk begge enderne af konstruktionen for at undgå udsivning af proteinet belægningsopløsning (figur 8A).
- Saml den roterende væg bioreaktor-systemet inde i cellekultur hætte.
- Placer bioreaktoren i en 37 ° C inkubator og starte rotationen af bioreaktoren ved 4,02 x 10 -5 g kraft i 1 time for at tillade den luminale belægning som vist i figur 8B.
- Åbne øvre ekstremitet af konstruktionen og opsug protein belægningsopløsningen fra hulrummet.
- Frigør HUVEC'er (passage 2-3) ved at fjerne dyrkningsmediet fra kolben af HUVEC'er og tilsætte 3 ml af trypsin-opløsning (1x i PBS). Jegncubate i 5 min (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed).
- Resuspendere HUVEC'er ved en koncentration på 4 x 10 6 celler / ml i suppleret M199 dyrkningsmedium.
- Inde i cellekultur hætte, frø HUVEC'er i lumen af konstruktionen med en densitet på 1.000 celler / cm2 15. Luk de øvre ekstremiteter konstruktionen at undgå lækage af HUVEC'er opløsning.
- Inkubere konstruktionerne (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed) vært i det roterende væg bioreaktor (figur 8B) og kultur i 2 dage ved en konstant rotation af 4,02 x 10 -5 g kraft.
- Høst konstruktionen efter 2 dages dyrkning i sterile forhold og forberede det til yderligere biologisk karakterisering som beskrevet i afsnit 2.4.
Representative Results
Dette arbejde beskriver fremstillingen af manipuleret rørformede collagen-baserede konstruktioner indeholdende vaskulære celler. Allerede efter 1 time af tidlig gelering, blev cellerne-og-collagen blanding direkte samles i en 3D rørformet geometri, med udvendig diameter lig med diameteren af den tilsvarende form (ca. 14 mm). Alle langs statisk modning, målinger afslørede hurtig reduktion af den ydre diameter af de rørformede cellularized strukturer, som vist i tabel 1. Diameteren af cellularized kollagengeler krympet på ca. 60% af den oprindelige værdi efter 1 dags statisk kultur, og på næsten 85% inden for 7 dage (Supplemental Video 2). SMC'er inden for konstruktioner er ansvarlige for den observerede faldende og relaterede mekaniske forstærkning, da dette fænomen ikke forekommer i ikke-cellularized kollagen stilladser. Bemærk, at ingen gradient af enhver type (termisk, biokemisk, mekanisk eller andre) blev anvendt. Den celler-driven komprimering resulterede i et materiale med større densitet kollagen, som kunne håndteres og dæmpet til mekaniske opfordringer (supplerende videoer 3 og 4).
At relatere celler-drevne remodeling til de overordnede mekaniske og viskoelastiske egenskaber, var træthed tests udført på konstruktioner (supplerende Videoer 5 og 6). Disse tests bestod i cykling konstruktionerne (30 gange) ved forskellige konstante stammer (10%, 20% og 30% af de oprindelige målelængde) og registrere den stress som reaktion konstruktionerne til den mekaniske opfordring over tid. De repræsentative resultater for én konstruktion er vist i figur 9. Konstruktionen modstod højere belastninger i længderetningen (75 kPa) end i rundtgående retning (16 kPa), når de underkastes den samme stamme interval (30% stamme). I mellemtiden, ved hver cyklus, nået til ta stress spidsværdirgeted maksimal belastning faldet over tid. Denne adfærd er typisk for de høje viskoelastiske egenskaber udvises af disse collagen-baserede konstruktioner.
Den biologiske aktivitet af de cellularized konstruktioner blev vurderet under statisk modning. Derfor blev metaboliske aktivitet af SMC'er vurderet ved måling af glucose forbrug og lactatproduktion den under statisk kultur. Dyrkningsmediet blev udtaget prøver hver 2 dage og glucose og lactat blev målt under anvendelse af en blodgas analysatoren. Den konstante stigning i glukose forbrug og laktat produktion kombineret med den vigtige indskrænkning af de konstruktioner, attestere SMC'er aktivitet langs statisk kultur (figur 10).
Den forøgede mekaniske stabilitet på grund af celle-drevne remodeling tillod manipulation af konstruktionerne og den efterfølgende endothelialisering processen. Massons trichromfarvning udført på de endothelialized konstruktionerviste en særdeles homogen endotel. SMC'er udviste en spindel-lignende formet morfologi og optrådte homogent dispergeret gennem væggen, mens HUVEC'er optrådte godt spredt i den luminale side (figur 11).
Figur 1:. Komponenter i den statiske bioreaktor Den statiske bioreaktor bestod af en modificeret 50 ml centrifugeglas (A) og en dorn udstyret låg (B). Røret tjente som medium reservoir, og var udstyret med en port til et 0,22 um filter, til gasudveksling, og et septum, på mellemlang prøveudtagning og forandring. En dorn til stede i den ventilerede hætte tillod fremstilling af konstruktioner i rørformet form. De gaze-greb (C) blev konstrueret og fremstillet til at understøtte gelering af konstruktionerne over domen. Desuden er dissegreb tillod konstruktionerne skal håndteres efter den statiske modning og at blive fastgjort til den mekanisk apparatur. Den ydre diameter af dornen var 4,7 mm.
Figur 2: Samling af den statiske bioreaktor Montering faser af bioreaktoren før sterilisering.. De gaze-greb blev monteret på dornen (A) i en fast afstand. En form blev indsat (B) og stramt fastgjort til silikone prop (C). Den ydre diameter af dornen var 4,7 mm.
Figur 3:. Fremstilling af konstruktionerne i sterile betingelser The celler og collagen blev hældt i huset-formen kompleks (A), og lad gel i 1 time ved stuetemperatur (B). Bagefter blev formen fjernet (C) blev den statiske bioreaktor samlet (D) og overføres inden et reservoir for den statiske modning af konstruktionen i inkubatoren (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed). Den ydre diameter af dornen var 4,7 mm.
Figur 4:. Måling af tykkelsen / ydre diameter af konstruktionerne A laserscanning interferometer blev anvendt til at udføre målingen af de ydre diametre af konstruktionerne. Konstruktionen blev anbragt i vejen af laserstrålen og genererede en skygge. Bredden af skyggen, der svarer til den udvendige diameter af konstruktionen, blev derefter målt og vises på skærmen.
Figur 5:. Morfologisk udseende af den høstede konstrukt (A) Lige efter gelering og (B) efter cellerne drevet remodellering under statisk modning i 2 uger.
Figur 6: Eksperimentel opstilling til mekaniske karakteriseringer Det bestod af den mikromekaniske testeren er udstyret med en 5 eller 10 N vejecelle og et bad indeholdende PBS ved 37 ° C for at holde prøverne i pseudo-fysiologiske betingelser..
Figur 7: Eksempel på forberedelse f eller mekaniske karakteriseringer. Prøve høst (A) og forberedelse (B) til træthed test udført i længderetningen, og de perifere retninger (C). Den ydre diameter af dornen var 4,7 mm.
Figur 8: Roterende væg bioreaktor (A) De rørformede konstruktioner blev samlet i midten af reservoiret ved hjælp af c-formet silikone support.. Begge yderpunkterne af konstruktionen blev lukket for at undgå enhver lækage af HUVEC'er opløsning. (B) Konstruktionerne blev dyrket i inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed) i rotation ved 4,02 x 10 -5 g kraft i 2 dage.
2 / 52812fig9highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 9:.. Mekaniske karakteriseringer Resultater af træthed udført på konstruktioner i længderetningen (A) og omkredsen (B) retninger efter celle-drevne remodeling Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10:. Metaboliske aktivitet af SMC'er inden for kollagengeler Målinger af glucoseforbrugshastighed og lactat produktionshastighed blev udført med blodet gasanalysatoren hver 2 dage, efter dyrkningsmediet skiftende. Frisk dyrkningsmedium blev anvendt som en basislinje niveau for af glucose og lactat koncentrationer målinger.
Figur 11: Lumen endotelialisering Histologiske billeder af de radiale tværsnit af rørformede konstruktioner.. Massons trichome farvning af rørformede konstruktioner dyrket statisk i 1 uge (A) og 2 uger (B). H & E-farvning af en rørformet konstruktion (C).
| Tid | Tykkelse (mm) | Komprimering (%) |
| 0 timer | 4,83 ± 0,02 | 0 ± 0 |
| 2 timer | 4,26 ± 0,02 | 12 ± 0 |
| 4 timer | 4,21 ± 0,03 | 13 ± 1 |
| 6 timer | 4,06 ± 0,10 | 16 ± 2 |
| 12 timerr | 3,16 ± 0,07 | 35 ± 1 |
| En dag | 2,08 ± 0,11 | 57 ± 2 |
| En uge | 0,68 ± 0,07 | 86 ± 1 |
| 2 uger | 0,36 ± 0,00 | 93 ± 0 |
Tabel 1: Hurtig komprimering af konstrukt diameter under den statiske modning Vægtykkelse af konstruktionerne og komprimering som funktion af tid af statisk kultur.. Komprimering blev målt ved at bestemme den udvendige diameter af de rørformede konstruktioner med en scanning laser interferometer (Serie 183b, LaserMike 136). Efter 24 timer, konstruktionerne komprimeres til 57% ± 2% af deres støbte dimensioner. Data er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 3). Tilstedeværelsen og aktiviteten af levende glatte muskelceller var den eneste ansvarlige for sådanne store ændringer.
Supplemental Video 1:. Høst af de ikke-ombygget rørformet kollagengeler Klik her for at se denne video.
Supplerende Video 2:. Celler-drevet komprimering af rørformede kollagengeler Klik her for at se denne video.
Supplerende Video 3:. Manipulation af de ikke-ombygget rørformet kollagengeler Klik her for at se denne video.
Supplerende Video 4:. Manipulation af cellerne-remodeled rørformet kollagengeler Klik her for at se ther video.
Supplerende Video 5:. Longitudinal træthed test (ved 30%) på celler-remodeled rørformet kollagengeler Klik her for at se denne video.
Supplerende Video 6:. Omkredsen træthed test (ved 30%) på celler-remodeled rørformet kollagengeler Klik her for at se denne video.
Discussion
Blandt samfundet af vaskulære væv ingeniører, har enorm indsats blevet gjort for at gengive tunica media lag er ansvarlig for den mekaniske stabilitet af blodkar 16. Da pionerarbejde Weinberg og Bell 17, er kollagen været meget anvendt som et stillads for karvæv engineering grund af dens biokompatibilitet, ikke-immunogene egenskaber og tilgængelighed. Men brugen af kollagen udgør en stor udfordring for forskere, da dette materiale er ikke let at håndtere på grund af den iboende mangel på mekanisk stivhed. Manipulationer under stillads forberedelse kan beskadige stilladser, kompromittere dem til videre brug.
Teknikken beskrevet i dette arbejde tillader: i) at konstruere cellularized kollagengeler i en rørformet geometri, ii) at konstruere biologiske væv stærke nok til at blive håndteret efter en kort statisk modningsperiode (1 eller 2 uger), iii) til somSess mekaniske og viskoelastiske egenskaber ved sådanne rørformet biologiske væv i 2 retninger. Celler i gelen spiller en central rolle i collagenmatrix remodeling. Under modningsperioden, kontraktile SMC'er førte til komprimering af gelerne, hvilket giver en konstruktion med højere mekanisk stabilitet, som kunne vurderes i de langsgående og rundtgående retninger. Bagefter HUVEC'er udsået i den luminale side af konstruktionerne genereres et homogent og levedygtig endotel, hvilket viser egnetheden af kollagen geler til vaskulære vævsdyrkningsapplikationer.
Bioreaktoren præsenteres i dette arbejde er specielt designet til at give et optimalt miljø for cellevækst under statisk modning. Desuden blev indretningerne er udviklet til karakterisering af de mekaniske og viskoelastiske egenskaber af konstruktionerne udformet med det formål at reducere potentielle skader uløseligt forbundet med manipulation afsådanne sarte materialer. Derfor blev den statiske bioreaktor udstyret med en 0,22 um filter og et filter membran på hætten (trin 1.1.2, figur 1A og B), tilladt gasudveksling mellem dyrkningsmedium i beholderen og inkubatoren, samtidig med at et sterilt miljø kultur. Luer septum nederst blev anvendt som en port til dyrkningsmedium prøveudtagning og skiftes i statisk kultur. Nogle kritiske skridt skal overvejes under konstruktion fabrikation og karakterisering. Alle manipulationer (udført i trin 2.1.1 og i de efterfølgende trin), der kan ændre systemets sterilitet blev udført i et sterilt biologisk hætte. Celler og kollagen gelblanding præparat blev håndteret på is for at forsinke geleringsprocessen (trin 2.1.4 til 2.1.7). Ved trin 2.1.7, eventuelle luftbobler indesluttet i blandingen før gelering er potentielle stress koncentration områder, der kan kompromittere srentabilitet af konstruktionerne. Derfor kræver fjernelse af sådanne luftbobler ryster lidt samlingen eller ved hjælp af medicinsk vakuum i 3 min for udluftningsindretning under sterile forhold. Endelig blev grebene specielt designet til at opretholde aksen af dornen centralt i den rørformede støbeformen under gelering og som giver mulighed delikate manipulation af konstruktionerne ved høst (fjernelse af dornen, afsnit 2.4), for endotelisering, og for at lette montering på det mekaniske system (langsgående prøver).
Den nuværende protokol foreslår en original nem at processen alternativ tilgang af armering af kollagengeler konstruktioner baseret på naturlige iboende kontraktile potentiale SMC'er. Almindelige teknikker til collagenmatricer forstærkning indebærer brug af fysiske og kemiske tværbindingsmidler, der kan have skadelige virkninger på celler-matrix interaktioner 18-20. Den fremstillingsteknik præsenteret idette arbejde tillader lede dette celler-drevne remodeling proces at give en væv-manipuleret konstruktion med målrettede mekaniske egenskaber uden nogen fysisk eller kemisk behandling.
Karakterisering af mekaniske og viskoelastiske egenskaber af hydrerede kollagengeler er en stor udfordring. I dette perspektiv er den foreliggende protokol beskriver en original enkel og effektiv metode til at vurdere de mekaniske egenskaber af rørformede bløde væv. Denne karakteristik kan udføres ikke blot i omkredsretningen, men også i længderetningen, direkte på hele rørformede struktur. Under mekanisk karakterisering, temperatur, vandigt miljø, pH og ionstyrke er nogle af de miljømæssige faktorer, der vides at drastisk påvirke den mekaniske opførsel af biologisk væv 21. Derfor er den foreliggende arbejde tyder en original opsætning og protokol for den mekaniske karakterisering af biologiske væv i en megetreproducerbar pseudo-fysiologisk miljø (saltopløsning ved 37 ° C og pH 7,4). Så vidt vi ved, har denne form for karakterisering aldrig blevet rapporteret andetsteds.
Det konkluderes, at teknik foreslås i dette arbejde viser det store potentiale af direkte blanding af celler med kollagen til vaskulære vævsdyrkningsapplikationer. Denne metode sammen med den mekaniske karakterisering og endotelialisering proces udgør høje polyvalente protokoller. Derfor gennem mindre ændringer af set-ups og protokoller samtidig holde den samme begrundelse, vigtigste krav til teknik vaskulære væv ækvivalenter kan løses, såsom hurtig og ukompliceret behandling, herunder endotelialisering, og muligheden for at overføres til en bred vifte af blød væv med forskellige længder og diametre. Endvidere kan forskellige vedhæftende celletyper, ECM-proteiner og formede geometrier undersøges for en række målrettede applications, såsom teknik sener, hudtransplantationer, hjerte-patches, nerver, blandt andre. Selvom de mekaniske egenskaber af konstruktionerne er opmuntrende, er de stadig lavere end for native væv. I denne sammenhæng er vi overbevist om, at en meget kort statisk modningsperiode er et afgørende skridt i retning af den dynamiske stimulering i en bioreaktor, hvilket fører til en højere strukturel integritet og mekanisk stabilitet. Men muligheden hurtigt producere væv-manipuleret cellularized collagen-baserede konstruktioner egnet til mekanisk og histologiske analyser gør den statiske bioreaktor beskrevet heri et nyttigt og lovende redskab til at give indsigt i samspillet mellem celler og ECM under vækst og ombygninger, eller endda til anvendes som model for terapier og lægemiddelafgivelsessystemer.
Disclosures
Ingen midler blev modtaget fra organisationer eller organer med potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Natural Science and Engineering Research Council of Canada, den canadiske Institut for Sundhedsforskning og CHU de Québec Research Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | - | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | - | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%) | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | - | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 ml | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI - 500 ml | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial | BD Biosciences - Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | - | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | - | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | - | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | - | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | - | HUVECs were isolated in the laboratory |
References
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
- Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Lee, C., Singla, A., Lee, Y.
- Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
- Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
- Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
- Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004 (2012).
- Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
- Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
- Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
- Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B (2007).
- Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D.
- Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
- Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
- Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
- Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290 (2012).
