Abstract
Syntetiska material är kända för att initiera kliniska komplikationer såsom inflammation, stenos, och infektioner när de implanteras som vaskulära substitut. Kollagen har i stor utsträckning använts för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar och anses vara ett giltigt alternativ till syntetiska material på grund av dess inneboende biokompatibilitet (dvs., låg antigenicitet, inflammation och cytotoxiska svar). Men har de begränsade mekaniska egenskaper och tillhörande låga hand förmåga kollagengeler försvåras deras användning som ställningsmaterial för vaskulär vävnadsteknik. Därför logiken bakom detta arbete var först med att konstruera cellularized kollagengeler till en rörformade geometri och andra att förbättra glatta muskelceller driven omorganisation av kollagenmatris för att erhålla vävnader styva nog att hanteras.
Strategin som beskrivs här bygger på den direkta monteringen av kollagen och glatta muskelceller (konstruera) i en 3D cylinndrical geometri med användning av en formningsteknik. Denna process kräver en mognadsperiod, under vilken konstruktionerna odlas i en bioreaktor under statiska förhållanden (utan tillämpade externa dynamiska mekaniska begränsningar) för 1 eller 2 veckor. Den "statiska bioreaktor" ger en övervakad och kontrollerad steril miljö (pH, temperatur, gasutbyte, leverans av näringsämnen och sophämtning) till konstruktionerna. Under odlingsperioden gjordes tjockleksmätningar för att utvärdera celler driven remodellering av kollagenmatrisen, och glukoskonsumtion och laktat produktionshastigheter mättes för att övervaka cellerna metabolisk aktivitet. Slutligen, var mekaniska och viskoelastiska egenskaper bedömas för de resulterande rörformiga konstruktioner. För detta ändamål, specifika protokoll och en fokuserad kunnande (manipulering, gripande, som arbetar i hydratiserad miljö, och så vidare) utvecklades för att karakterisera de manipulerade vävnaderna.
Introduction
Kärl tissue engineering föreställer olika strategier som syftar till framställning av tekniska fartyg, inklusive transplantat baserade på syntetiska byggnadsställningar, cellblad baserade vävnadstekniska blodkärl (TEBVs), och extracellulära matrix (ECM) komponenter baserade TEBVs. Bland dessa metoder, syntetiska polymerer uppvisar goda mekaniska egenskaper, men har en gemensam nackdel eftersom de saknar bioaktivitet 1. Cellskiktet baserad metod medger framställning av konstruerade vaskulära substitut med höga mekaniska egenskaper, men den tid som krävs för att producera sådana transplantat är cirka 28 veckor 2. Naturliga biopolymerer av ECM, såsom kollagen, elastin, fibrin 3 eller en kombination därav, förblir guldstandardmaterial för vävnadstekniska byggnadsställningar. Detta är främst på grund av att dessa material har en generellt god biokompatibilitet samtidigt som de kan inducera funktionella cellulära responser 4-5. Bland dessa biopolymers, typ I-kollagen är ett av de mest rikligt förekommande och dominerande bärande proteinet av ECM i många vävnader, såsom hud, blodkärl och senor blod. Ett omfattande arbete har bedrivits på de mekaniska egenskaperna hos kollagen 6 - 8, men det har bara varit ett fåtal studier på cellulär ombyggnad av kollagengeler under statisk mognad. Cellular ombyggnad hänvisar till de strukturella ändringar av kollagenmatrisen som induceras av celler som kan påverka stabiliteten i kollagenfibriller nätverket 9. Som en naturlig byggnadsställning, kan relativt stora mängder av typ I-kollagen isoleras, steriliseras och lagras från olika källor, såsom råtta-svans senor 10. Förstå cellulära interaktioner med kollagen och tillhörande övergripande mekaniska beteenden hos de cellularized kollagen ställningar (konstruerar) är ett viktigt steg för att bygga vävnader. Kollagenbaserade TEBVs kan bearbetas av direkt blanda celler med kollagenunder gelpreparat och vidare formas till specifika former såsom rörformiga och plana 11. Kärl celler inuti gelerna föröka sig och ombyggnads typ I kollagen 12. Således, denna metod kringgår behovet av särskilda makroporositet som representerar en av de viktigaste frågorna i utvecklingen av byggnadsställningar för vävnadstekniska tillämpningar. Emellertid, de stora nackdelarna med kollagengeler är deras låga mekaniska egenskaper jämfört med syntetiska material 13.
I denna studie framställdes en livsduglig vävnad med homogen fördelning av celler manipulerade genom direkt blandning av kollagen med celler i en en-stegsprocess. "Statiska bioreaktorer" användes för 1 eller 2 veckor statisk mognaden av cellularized kollagengeler (utan påsatt externa dynamiska mekaniska begränsningar). Under kultur, inträffade kollagenmatris ombyggnad, vilket ger strukturell förstärkning till konstruktionerna. Dessutom är dessa konstruktioner var ready som skall överföras till en roterande-vägg bioreaktor och en homogen endotel uppnåddes. Dessutom, i detta arbete en viss mekanisk provning protokoll föreslås också att tillhandahålla en lämplig ny metod vid karakterisering de mekaniska egenskaperna hos rörformade mjuka vävnader.
Sammanfattningsvis visar detta arbete en metod för snabb tillverkning och mognad av vaskulära vävnader som är starka nog att kunna hanteras, inte bara för biologiska och mekaniska karakteriseringar, men också för ytterligare mekanisk konditionering i en dynamisk bioreaktor, som anses vara en avgörande vitro steg i förnyelsen av vävnader.
Protocol
1. Tillverkning och montering av statisk Bioreactor
- Tillverkning av Reservoir
- Bered 50 ml centrifugrör som odlingsmedium reservoar för bioreaktorn.
- Gör två portar genom att borra två 5 mm diameter hål vid 20 mm från botten och toppen av behållaren, respektive. Sätt sedan två Luer beslag i 5 mm längd silikontuber. Press-montera dessa Luer beslag genom hålen och täta alla anslutningar med medicinsk silikon lim.
- Sätt i ett 0,22 pm filter in i den övre öppningen av behållaren (figur 1A).
- Sätt en luer septum in i den nedre porten av reservoaren (Figur 1A).
- Dorn-cap Montering
- Borra ett hål 4,5 mm i diameter vid centrum av det ventilerade locket till förrådsröret utan att skada filtermembranet som täcker luftningshålen.
- Förbered en omrörare (diameter = 4,5 mm, längd = 100 mm) Såsom en dorn för konstruktionen.
- Bered två silikon koniska proppar (längd = 10 mm, mitt hål diameter = 4,5 mm).
- Montera dornen och kåpan (dorn-cap-komplex), såsom beskrivs i figur 1B.
- Tryck-passa dornen i hålet. Sätt de 2 proppar över kärnan så att locket monteras mellan dem. Justera positionen på dornen så att dess användbara längd är 78 mm.
- Applicera en primer och sedan medicinsk silikon lim för att de ytor som kommer i kontakt innan han började locket och silikon koniska proppar tillsammans. Ta bort överflödigt lim på locket.
- Låt torka vid rumstemperatur under 1-3 dagar.
- Tillverkning av de Gauze-grepp
- Förbered tre silikon-rör (tube 1: innerdiameter = 6,4 mm, längd = 5 mm, rör 2: diameter = 6,4 mm, längd = 10 mm, och röret 3: diameter = 3,1 mm, längd = 12 mm).
- Montera gasväv-grepp som beskriverd i figur 1C.
- Klipp röret 1 i längdriktningen, och öppna den över röret 2. Stick dem tillsammans med silikon lim.
- Skär steril kirurgisk gasbinda till 5 cm x 7 cm blad, och sedan rulla tätt gasväv över röret 3 längs den längsta sidan av gasväv. Sätt i röret 1-röret 2 komplexet över gasväv.
- Lägg silikon lim för att hålla ihop gasväv, röret 1-slang 2-komplexet och röret 3. Klipp gasväv vid en längd av 8 mm.
- Montering och sterilisering
- Montera dornen-cap komplexet och gasväv-grepp, såsom beskrivs i figur 2.
- Täck spindeln med medicinsk fettkvalitet (Figur 2A). Placera gasväv-grepp över dornen (Figur 2B). Avstånd grepp på fast värde av 35 mm från varandra.
- Bered en rörformig form genom att ta bort den nedre delen av en 10 ml spruta genom att använda en tabell såg (slutlig längd = 8 mm) (
- Sätt formen över gasbinda grepp utrustade spindel-cap enheten (bostadsform komplex), snap-montering av mögel på silikon propp (Figur 2C).
- Autoklavera reservoaren och höljet formkomplexet.
Obs: Var noga med att hålla på silikonproppen ordentligt när du sätter formen för att undvika att lossnar.
- Montera dornen-cap komplexet och gasväv-grepp, såsom beskrivs i figur 2.
2. Engineering glatta muskelceller kollagen gel-baserade konstruktioner och Static Mognad
- Engineering Konstruktioner
- Expand grisaorta glatta muskelceller (pSMCs) i 175 cm 2 odlingskolvar fyllda med 20 ml av komplett odlingsmedium bestående av Dulbeccos modifierade Eagle-medium kompletterat med 10% (vol / vol) porcint serum (PS), 10% (volym / volym ) fetalt bovint serum (FBS), 1% (volym / volym) penicillin-streptomycin (pen-strep).
- Vid ≈90% sammanflödet, lossa pSMCs (passage 2-4) genom att avlägsna odlingsmediet frånkolv av pSMCs, lägga 5 ml trypsinlösning (1x i fosfatbuffrad saltlösning, PBS) och inkubering under 10 minuter (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet).
- Resuspendera pSMCs vid en koncentration av 4 x 10 6 celler / ml i fullständigt odlingsmedium.
- Bered kollagenlösning som tidigare beskrivits 10.
- Utdrag och samla kollagenknippen från råttsvans senor i en PBS-lösning.
- Överför kollagenfibrerna därefter i aceton (5 min), isopropanol 70% (volym / volym) (5 min) och ättiksyra (0,02 N, 48 h, 4 ° C) lösningar.
- Blanda den viskösa lösningen och frys vid -20 ° C under 3 dagar.
- Lyofilisera den frysta lösningen för att erhålla kollagensvampar.
- Solubilisera de kollagensvampar i ättiksyralösning (0,02 N) vid en koncentration av 4 g / I och centrifugera vid 29.581 g kraft under 45 min.
- Sterilisera kollagenlösningen genom dialys process mot efterföljande solutions ättiksyra (0,02 N, 1 timme), kloroform 1% (volym / volym, 1 timme) och ättiksyra (0,02 N, steril lösning byts var 2 dagar för en vecka).
- Samla den sterila kollagenlösningen (4 g / I) i en steril cellodlings huva.
- Förbered cellularized kollagengeler såsom visas i fig 3.
- Bered 50 ml steril buffertlösning genom att blanda 35 ml av DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml av NaOH (1 N) i 8 ml sterilt avjoniserat vatten.
- Förbered celler och kollagengel blandning i en behållare placerad i is genom att blanda 50% (volym / volym) steril kollagenlösning (4 g / L ättiksyra 0,02 N) med 25% (volym / volym) av buffertlösning och 25% (volym / volym) av suspensionen av pSMCs i fullständigt odlingsmedium.
- Mät pH hos blandningen och se till att det är mellan 7,0 och 7,4.
- Häll försiktigt 9 ml celler-och-kollagen blandningen i ovan nämnda huset / mögel komplex (steg 1.4.3, figur 3A-B
- Låt det gela vid rumstemperatur under 1 h under cellodlings huven (figur 3B).
- Mognad i Statisk Bioreactor
- Avlägsna formen (figur 3C) och överför noggrant konstruktet in i reservoaren, innehållande 35 ml odlingsmedium (figur 3D).
- Inkubera konstruktet (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) i vertikalt läge för en eller två veckor av statisk mognad.
- Installera en web-kamera (förseglad för att säkerställa isolering) inuti inkubatorn framför konstruktet.
- Ändra odlingsmediet var 2 dagar genom att aspirera den gamla mediet från luer septum sporten och åter fylla behållaren med en ekvivalent mängd av färskt odlingsmedium.
- Mätning av tjocklek och metabolisk aktivitet hos SMC-kollagen Gel-baserade konstruktioner Under statisk kultur
- Placera avsöknings laserinterferometern i cellen Culture huva och vända det från vertikalt till horisontellt läge med hjälp av ett vattenpass.
- Överför bioreaktorn i cellkultur huva och avlägsna konstruktionen från reservoaren.
- Överför konstruktet (fortfarande monterad på dornen) in i banan för laserstrålen, och placera den strikt ortogonalt i förhållande till strålens axel (såsom visas i fig 4).
- Läs det värde som visas på skärmen hos avsöknings laserinterferometern, som motsvarar den yttre diametern av konstruktionen.
- Beräkna väggtjockleken av konstruktionen baserat på dess yttre och inre diameter (dvs dornen diametern).
Obs! Upprepa steg 2.3.1 till 2.3.5 varje timme för de första 12 timmar och sedan varje 24 timmar. - Använd 1 ml av den gamla odlingsmedium (samplas vid byte av odlingsmedium, steg 2.2.4) för mätning av laktat och glukoskoncentrationer med blodgas analysatorn.
- Använd 1 ml avfärskt odlingsmedium som en baslinjenivå för glukos och laktatkoncentrationer mätningar 14.
Obs! Upprepa steg 2.3.6 och 2.3.7 var 2 dagar efter odlingsmedium förändras.
- Konstruera Skörd för ytterligare mekanisk och biologiska Ccharacterizations
- Efter 1 eller 2 veckor av statisk mognadsperiod, överföra den statiska bioreaktorn i cellkultur huva.
- Överför försiktigt mogna konstruktionen från dess kärna (Supplemental Video 1) till en diameter på 100 mm petriskål innehållande 40 ml färskt odlingsmedium (Figur 5 och figur 7A).
3. Mekanisk Karakterisering av konstruktionerna i längs- och tvär Avstånd
- Installera den experimentella uppställningen som består av den mikromekaniska testare utrustad med en 5 eller 10 N belastningscell och ett bad innehållande PBS vid 37 ° C för att hålla proven ent pseudo-fysiologiska förhållanden (Figur 6).
- Balansera lastcellen och extenso.
Obs: Balansering är en funktion integrerad i mikromekanisk testanordning som består i att återställa det visade förlängningsvärdet och det visade belastningsvärdet medan inget prov är monterad på maskinen. Denna funktion gör det möjligt att definiera referens för båda mätningarna. - Montering av rörformiga konstruktioner på mekanisk utrustning: längdriktning.
Obs: Utför längsgående utmattningsprov direkt på hela rörformiga konstruktioner. Användning i-hus inbyggd gripanordningar för att förbinda de gasväv klorna på konstruktionerna till lastcellen och till basen av PBS badet.- Montera rörformiga bygga på grip enheter (Figur 7B), efter skördeförfarandet (avsnitt 2.4).
- Wrap gripanordningarna och gasbinda grepp tillsammans med teflontejp för att förhindra glidning av de gasväv griper under testet.Montera provet på den mikromekaniska tester (figur 7C).
- Montering av ringformade konstruktioner på mekanisk utrustning: omkretsriktning.
Obs: Utför periferiutmattningsprov på ringformade prover sektionerade från de rörformade konstruktioner. Använd två stänger av rostfritt stål som grepp för att hålla proverna.- Montera rörformiga bygga på ett plaströr som ett stöd märkt med 5 mm gap (Figur 7B), efter skörd (avsnitt 2.4).
- Skär 10 mm ringar från den rörformiga konstruktionen.
- Mät längden av provet med hjälp av ett skjutmått för ytterligare analyser.
- Montera ringformade prov på stänger av rostfritt stål av den mikromekaniska tester (figur 7C). Se till att placera provet i mitten av staplarna.
Anm: Plaströret i steget 3.4.1 och ett skärsystem som visas i fig 7B
- Trötthet test på konstruktioner i längd- eller omkretsriktningen.
- Sträck konstruktionen till dess ursprungliga mätlängden.
- Bibehåll konstruktet i denna position under 10 minuter i pseudo fysiologisk miljö.
- Applicera 10% cyklisk stam av den ursprungliga mätsträckan (30 cykler) till konstruktionen vid 5% / sek töjningshastighet.
- Upprepa steg 3.5.3 vid stegvis från 10% cyklisk stam tills fel på provet.
Anmärkning: Användning av pseudo-fysiologiska miljö kräver med hänsyn till flytförmåga och tröghet gripsystem som påverkar mätningen av den anbringade belastningen. - Anteckna bakgrunden på följande sätt:
- Förskjuta lastramen till den ursprungliga mätlängden.
- Upprepa steg 3.5.3 och 3.5.4 utan prov monteras och hålla grip enheter som är anslutna till lastcellen (endast 1 cykel är behöver utförasröd).
4. Luminal endotelisering av konstruktioner
Obs: Efter att ha följt avverkningsprotokoll (avsnitt 2.4), konstruktionerna tål hantering att monteras i den roterande vägg bioreaktor för ytterligare endotelisering.
- Roterande-vägg Bioreaktor design
- Borra ett hål 4,5 mm i diameter vid centrum av det ventilerade locket till förrådsröret utan att skada filtermembranet som täcker luftningshålen.
- Press-montera en spindel (diameter = 4,5 mm, längd = 40 mm) i hålet och fixera kärnan som beskrivs i steg 1.1.2.
- Förbered två C-formade stöd silikon för konstruktionen yttre diameter = 14 mm; inre diameter = 8 mm).
- Placera en roterande motor i en ände av den roterande-väggen bioreaktor och bäring på andra änden (Figur 8B).
- Lumen endotelisering
- Expand humant umbilical venendotelceller (HUVEC) i 25 cm 2 odlingskolvar med 5 ml av M199-odlingsmedium kompletterat med 10% (volym / volym) PS, 10% (volym / volym) FBS, 1% (volym / volym) pen-strep i petriskål inuti en inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) tills 90% konfluens.
- Bered 1,5 ml av proteinbeläggningslösning per konstrukt krävs för optimal cellvidhäftning genom att späda koncentratet proteinblandningen till 10,5 ng / ml i serumfritt endotelial cellodlingsmedium.
- Mät längden av konstruktionen med hjälp av ett skjutmått.
- Beräkna luminala volymen V och den luminala ytan A av konstruktionen som: V = D i 2 L / 4 och A = D L respektive (där D i är innerdiameter motsvarande dornen diametern, och L är längden av konstruktionen).
- Placera konstruktet vid centrum av behållaren efter skörd förfarandet (avsnitt 2.4).Använd C-formade stöd silikon för att fixera konstruktionen i båda ändarna till reservoaren (figur 8A).
- Fyll behållaren med 35 ml odlingsmedium.
- Fyll 75% av den beräknade luminala volymen av konstruktionen (V) med proteinbeläggningslösningen som framställts i steg 4.2.2. Stäng båda ändarna av konstruktionen för att undvika läckage av proteinbeläggningslösningen (figur 8A).
- Montera den roterande vägg bioreaktorsystem inuti cellodlings huven.
- Placera bioreaktorn i en 37 ° C inkubator och starta rotationen av bioreaktorn vid 4,02 x 10 -5 g kraft under 1 h för att tillåta den luminala beläggningen såsom visas i figur 8B.
- Öppna den övre änden av konstruktionen och aspirera proteinbeläggningslösningen från lumen.
- Drag av HUVEC (passage 2-3) genom att avlägsna odlingsmediet från kolven av HUVEC och tillsats 3 ml av trypsinlösningen (1x i PBS). Jagncubate under 5 minuter (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet).
- Resuspendera HUVECs vid en koncentration av 4 x 10 6 celler / ml i kompletterat M199-odlingsmedium.
- Inne i cellkultur huva, utsäde HUVEC i lumen av konstruktionen med en densitet av 1000 celler / cm 2 15. Stäng de övre ändarna av konstruktionen för att undvika läckage av HUVEC-lösning.
- Inkubera konstruktionerna (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) värd in i den roterande vägg bioreaktor (Figur 8B) och odling under två dagar vid en konstant rotation av 4,02 x 10 -5 g kraft.
- Skörda konstruktionen efter 2 dagars odling i sterila förhållanden och förbereda den för ytterligare biologisk karakterisering som beskrivs i avsnitt 2.4.
Representative Results
Detta arbete beskriver framställningen av modifierade rörformiga kollagenbaserade konstruktioner som innehåller vaskulära celler. Redan efter 1 timme av tidig gelning, blev cellerna-och-kollagenblandningen direkt monterad i en 3D rörformig geometri, med den yttre diametern är lika med diametern hos den motsvarande formen (omkring 14 mm). Längs statisk mognad, avslöjade mätningar en snabb minskning av den yttre diametern hos de rörformiga cellularized strukturer, såsom visas i tabell 1. Diametern på cellularized kollagengeler krympt av ca 60% av utgångsvärdet efter en dag av statisk odling, och nästan 85% inom 7 dagar (Supplemental Video 2). SMC inom konstruktionerna är ansvariga för den observerade krymper och tillhörande mekanisk förstärkning, eftersom detta fenomen inte inträffar i icke-cellularized kollagen ställningar. Observera att ingen gradient av någon typ (termisk, biokemiska, mekanisk eller andra) applicerades. Den celler-enhetn kompakteresulterade i ett material med större kollagendensitet som skulle kunna hanteras och dämpad för mekaniska kontakter (Supplemental Video 3 och 4).
För att relatera celler-drivna ombyggnad till de övergripande mekaniska och viskoelastiska egenskaper, var trötthet tester på konstruktionerna (Supplemental Video 5 och 6). Dessa tester bestod i att cykla konstruktionerna (30 gånger) vid olika konstanta stammar (10%, 20%, och 30% av ursprunglig mätlängd) och för att registrera den stress som svaret av konstruktionerna för den mekaniska värvning över tiden. De representativa resultat för ett konstrukt visas i figur 9. Konstruktet motstod högre påkänningar i den längsgående riktningen (75 kPa) än i omkretsriktningen (16 kPa) då de utsattes för samma stam intervall (30% töjning). Under tiden, vid varje cykel nådde spänningstoppvärdet för TArgeted maximala påfrestningar minskat över tiden. Detta beteende är typiskt för de höga viskoelastiska egenskaper som uppvisas av dessa kollagenbaserade konstruktioner.
Den biologiska aktiviteten hos de cellularized konstruktionerna bedömdes under statisk mognad. Därför var metabolisk aktivitet hos SMC utvärderas genom att mäta glukos konsumtion och laktat produktion under statisk kultur. Odlingsmedium Prov togs varje två dagar och glukos och laktat koncentrationer mättes med användning av en blod gasanalysator. Den konstanta ökningen av glukos konsumtion och laktat produktion i kombination med den viktiga krympningen av konstruktionerna, attestera SMC aktivitet längs statisk kultur (Figur 10).
Den ökad mekanisk stabilitet på grund av celldrivna ombyggnad tillåten manipulering av konstruktionerna och den efterföljande endotelisering processen. Massons trikrom-färgning utfördes på de endothelialized konstruktionernavisade en mycket homogen endotel. SMC uppvisade en spindelliknande formade morfologi och verkade homogent spridda genom väggen, medan HUVECs verkade väl spridas i luminala sidan (Figur 11).
Figur 1:. Komponenter i den statiska bioreaktorn Den statiska bioreaktor bestod av en modifierad 50 ml centrifugrör (A) och en dorn utrustat lock (B). Röret tjänade som medelreservoar, och var utrustad med en port för en 0,22 | im filter, för gasutbyte, och ett septum, för mediet provtagning och förändras. En dorn närvarande i den ventilerade kåpan tillät tillverkning av konstruktioner i rörform. Gasväv-grepp (C) utformades och tillverkades för att stödja gelning av konstruktionerna över dornen. Dessutom är dessagrepp tillät konstruktionerna som skall hanteras efter det statiska mognad och att fixeras till den mekaniska anordningen. Den yttre dornens diameter var 4.7 mm.
Figur 2: Montering av den statiska bioreaktor Montering faser av bioreaktorn före steriliseringen.. Gasväv-greppen var monterade på dornen (A) på ett fast avstånd. En form fram införda (B) och tätt fixerad till silikonpropp (C). Den yttre dornens diameter var 4.7 mm.
Figur 3:. Tillverkning av konstruktionerna i sterila betingelser Den celler och kollagenblandningen hälldes in i höljet formkomplex (A), och låt gel för en timme vid rumstemperatur (B). Efteråt fick formen avlägsnas (C), var den statiska bioreaktor hopfogade (D) och överfördes i en reservoar för den statiska mognaden av konstruktionen i inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet). Den yttre dornens diameter var 4.7 mm.
Figur 4:. Mätning av tjockleken / ytterdiameter av konstruktionerna En laserskanning interferometer användes för att utföra mätningen av de yttre diametrarna hos konstruktionerna. Konstruktionen placerades i banan för laserstrålen och alstras en skugga. Bredden på den skugga, som motsvarar den yttre diametern av konstruktet, mättes sedan och visas på skärmen.
Figur 5:. Morfologisk utseende skördade konstruktionen (A) Direkt efter gelning och (B) efter celler motiverad ombyggnad under statisk mognad i 2 veckor.
Figur 6: Experimentell set-up för mekaniska karakteriseringar Den bestod av den mikromekaniska testare utrustad med en 5 eller 10 N belastningscell och ett bad innehållande PBS vid 37 ° C för att hålla proverna i pseudo-fysiologiska betingelser..
Figur 7: Provberedning f eller mekaniska karakteriseringar. Prov skörd (A) och beredning (B) för utmattningstester utförda i längd och omkrets riktningar (C). Den yttre dornens diameter var 4.7 mm.
Figur 8: Roterande-vägg bioreaktor (A) De rörformiga konstruktioner sattes samman i mitten av behållaren med hjälp av C-formade silikon stöd.. Båda de yttre delarna av konstruktionen stängdes för att undvika läckage av HUVEC lösningen. (B) Konstruktionerna odlades i inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) i rotation vid 4,02 x 10 -5 g kraft i två dagar.
2 / 52812fig9highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 9:.. Mekaniska karakteriseringar Resultat av utmattningstester utförda på konstruktioner i längd (A) och omkrets (B) riktningar efter celldrivna ombyggnad Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10:. Metabolisk aktivitet hos SMC inom kollagengeler Mätningar av glukosförbrukningshastigheten och laktat produktionshastigheten utfördes med blodet gasanalysatorn varje 2 dagar, efter det att odlingsmediet förändras. Färskt odlingsmedium användes som en baslinjenivå för glukos- och laktat koncentrationer mätningar.
Figur 11: Lumen endotelialisering Histologiska bilder av de radiella tvärsektioner av rörformiga konstruktioner.. Massons Trichome färgning av rörformiga konstruktioner odlades statiskt för en vecka (A) och 2 veckor (B). H & E-färgning av en rörformig konstruktion (C).
| Tid | Tjocklek (mm) | Compaction (%) |
| 0 h | 4,83 ± 0,02 | 0 ± 0 |
| 2 tim | 4,26 ± 0,02 | 12 ± 0 |
| 4 h | 4,21 ± 0,03 | 13 ± 1 |
| 6 tim | 4,06 ± 0,10 | 16 ± 2 |
| 12 timr | 3,16 ± 0,07 | 35 ± 1 |
| 1 dag | 2,08 ± 0,11 | 57 ± 2 |
| 1 vecka | 0,68 ± 0,07 | 86 ± 1 |
| 2 veckor | 0,36 ± 0,00 | 93 ± 0 |
Tabell 1: Snabb packning av konstrukt diameter under statiska mognaden Väggtjocklek av konstruktionerna och kompakteringshastigheten som en funktion av tiden för statisk odling.. Kompakte mättes genom bestämning av den yttre diametern hos de rörformade konstruktioner med en avsöknings laserinterferometer (serie 183B, LaserMike 136). Efter 24 timmar, konstruktionerna packas till 57% ± 2% av deras gjutna dimensioner. Data uttrycks som medelvärde ± SD (n = 3). Närvaron och aktiviteten av levande glatta muskelceller var den enda ansvariga för sådana stora förändringar.
Supplemental Video 1:. Skörd av de icke-renoverade rörformiga kollagengeler Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Video 2:. Celler driven packning av rörformiga kollagengeler Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Video 3:. Manipulering av de icke-renoverade rörformiga kollagengeler Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Video 4:. Manipulering av celler-ombyggda rörformiga kollagengeler Klicka här för att se thär video.
Kompletterande Video 5:. Längsutmattningsprov (30%) på celler-ombyggda rörformiga kollagengeler Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Video 6:. Omkretsutmattningsprov (30%) på celler-ombyggda rörformiga kollagengeler Klicka här för att se filmen.
Discussion
Bland samhället av kärlvävnad ingenjörer, har enorma ansträngningar gjorts för att återskapa tunica media skiktet ansvarig för den mekaniska stabiliteten hos blodkärl 16. Eftersom pionjärarbete Weinberg och Bell 17, har kollagen använts i stor utsträckning som en byggnadsställning för vaskulär vävnadsteknik på grund av dess biokompatibilitet, icke-immunogena egenskaper och tillgänglighet. Emellertid har användningen av kollagen utgör en stor utmaning för forskare, eftersom detta material är inte lätt att hantera, på grund av den inneboende bristen på mekanisk styvhet. Manipulationer under byggnadsställning preparatet kan skada ställningar, kompromissa dem för vidare användning.
Den teknik som beskrivs i detta arbete kan: i) att konstruera cellularized kollagengeler till en rörformiga geometri, ii) att konstruera biologiska vävnader stark nog att hanteras efter en kort statisk mognadsperiod (1 eller 2 veckor), iii) somSESS mekaniska och viskoelastiska egenskaperna hos sådana rörformiga biologiska vävnader i 2 riktningar. Celler i gelén har en nyckelroll i kollagenmatrisen ombyggnad. Under mognadsperiod, sammandragande SMC ledde till kompaktering av gelerna som ger en konstruktion med högre mekanisk stabilitet som skulle kunna bedömas i de längsgående och periferiska riktningar. Efteråt HUVECs seedade i luminala sidan av konstruktioner genererade en homogen och livskraftig endotel, vilket visar lämpligheten av kollagengeler för kärlvävnad tekniska tillämpningar.
Bioreaktorn som presenteras i detta arbete var specifikt utformad för att ge en optimal miljö för celltillväxt under statisk mognad. Dessutom har de anordningar som utvecklats för karakteriseringen av de mekaniska och viskoelastiska egenskaperna hos konstruktionerna utformas med syftet att reducera eventuella skador som är inneboende i manipulering avsådana ömtåliga material. Därför var den statiska bioreaktor utrustad med en 0,22 um filter och en filtermembran på locket (steg 1.1.2, figur 1A och B) som tillät gasutbyte mellan odlingsmediet inuti behållaren och inkubatorn, och samtidigt hålla en steril odlingsmiljö. Luer skiljevägg vid botten användes som en port för odlingsmedium provtagning och bytas under statisk odling. Vissa kritiska steg måste beaktas under konstruktion tillverkning och karakterisering. Alla manipulationer (utförs i steg 2.1.1 och i de efterföljande stegen) som kan förändra sterilitet systemet genomfördes i en steril biologisk huva. Celler och kollagen gelblandning förberedelse hanterades på isen för att fördröja gelningsprocessen (steg 2.1.4 till 2.1.7). Vid steg 2.1.7, eventuella luftbubblor inneslutna i blandningen före gelning är potentiella spänningskoncentrationsområden som kan äventyra de slönsamheten av konstruktionerna. Därför kräver avlägsnandet av sådana luftbubblor något skaka montering eller användning av medicinsk vakuum under 3 minuter för avgasning under sterila förhållanden. Slutligen har greppen särskilt utformade för att bibehålla axeln hos dornen centrala i den rörformiga formen under gelning och för att tillåta delikat manipulering av konstruktionerna under skörd (avlägsnande av dornen, avsnitt 2.4), för endotelialisering, och för att underlätta montering på det mekaniska systemet (longitudinella tester).
Den nuvarande protokollet föreslår en ursprunglig enkel att processen alternativt tillvägagångssätt för förstärkning av kollagengeler konstruktioner baserade på naturliga inneboende kontraktila potential SMC. Vanliga tekniker för kollagenmatriser förstärkning involverar användningen av fysiska och kemiska tvärbindningsmedel som kan ha skadliga effekter på celler-matrix interaktioner 18-20. Tekniken tillverkning presenteras idetta arbete gör att rikta detta celler driven ombyggnad process för att ge en vävnadsutvecklad konstruktion med riktade mekaniska egenskaper utan någon fysisk eller kemisk behandling.
Karakterisering av mekaniska och viskoelastiska egenskaperna hos hydratiserade kollagengeler är en stor utmaning. I detta perspektiv, beskriver det nuvarande protokollet en ursprunglig enkel och effektiv metod för att bedöma de mekaniska egenskaperna hos rörformiga mjuka vävnader. Denna karakterisering kan utföras inte endast i omkretsriktningen utan även i längdriktningen, direkt på det hela taget rörformiga strukturen. Under mekanisk karakterisering, temperatur, vatten miljö, pH och jonstyrka är några av de miljöfaktorer som är kända för att drastiskt påverka det mekaniska beteendet hos biologiska vävnader 21. Följaktligen föreslår föreliggande arbete en ursprunglig uppsättning och protokoll för den mekaniska karakteriseringen av biologiska vävnader i en mycketreproducerbar pseudo fysiologisk miljö (koksaltlösning vid 37 ° C och pH 7,4). Så vitt vi känner till, har denna typ av karaktärisering aldrig rapporterats på annat håll.
Sammanfattningsvis, den teknik som föreslås i detta arbete visar stor potential för direkt blandning av celler med kollagen för kärlvävnad tekniska tillämpningar. Denna metod tillsammans med den mekaniska karakterisering och endotelisering processen utgör höga polyvalenta protokoll. Därför genom smärre modifieringar av uppställningar och protokoll samtidigt hålla samma logik, huvudkraven för ingenjörskärl vävnadsekvivalenter kan adresseras såsom snabb och okomplicerad behandling, inklusive endotelbildning, och möjligheten att överföras till ett brett spektrum av mjuk vävnader med olika längder och diametrar. Dessutom, olika vidhäftande celltyper, ECM-proteiner och formade geometrier kan undersökas för ett antal riktade applicatitillbehör, såsom ingenjörs senor, hudtransplantat, hjärt plåster, nerver, bland andra. Även de mekaniska egenskaperna hos konstruktionerna är uppmuntrande, de är fortfarande lägre än för naturliga vävnader. I detta sammanhang är vi övertygade om att en mycket kort statisk mognadsperiod är ett avgörande steg mot den dynamiska stimulans i en bioreaktor, vilket leder till en högre strukturell integritet och mekanisk stabilitet. Möjligheten att snabbt producera vävnadstekniska cellularized kollagenbaserade konstruktioner lämpad för mekanisk och histologiska analyser gör det statiska bioreaktor beskrivs häri ett användbart och lovande verktyg för att ge insikt i samspelet mellan celler och ECM under tillväxt och ombyggnad, eller till och med användas som en modell för behandlingar och läkemedel leveranssystem.
Disclosures
Ingen finansiering mottogs från organisationer eller organ med potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av naturvetenskap och teknisk forskning Council of Canada, den kanadensiska Institutet för hälsa forskning och CHU de Québec Research Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | - | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | - | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%) | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | - | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 ml | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI - 500 ml | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial | BD Biosciences - Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | - | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | - | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | - | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | - | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | - | HUVECs were isolated in the laboratory |
References
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
- Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Lee, C., Singla, A., Lee, Y.
- Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
- Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
- Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
- Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004 (2012).
- Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
- Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
- Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
- Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B (2007).
- Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D.
- Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
- Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
- Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
- Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290 (2012).
