Summary
Detta protokoll beskriver användningen av bromodeoxiuridin (BrdU) upptag för att tillåta den temporala spårning av celler som var i S-fas vid en viss tidpunkt. Tillsats av DNA-färgämnen och märkning antikropp underlättar detaljerad analys av vad som händer med S fasceller vid senare tillfällen.
Introduction
Bedömningen av cellcykelfunktioner och förändringar som sker i celler under cellcykelns framskridande är grundläggande för att förstå många aspekter av biologi, särskilt cancerbiologi. Många agenter i utveckling för behandling av maligniteter har djupgående effekter på cellcykelprogression eller inducera celldöd via cellcykelberoende mekanismer. För att studera cellcykel dynamik eller celler i en särskild fas av cellcykeln, är det vanligt att synkronisera cellerna. Men synkroniseringsmetoder kan ha skadliga effekter på cellerna som studeras, potentiellt confounding de resultat som uppnåtts. 1 Nyligen användningen av fluorescerande taggade proteiner som endast föreligger vid vissa faser av celler cykeln har tillåtit analys av cellcykelprogression i enskilda celler över tiden 2, emellertid de celler som skall studeras behov av att vara genetiskt manipulerade för att uttrycka dessa märkta proteiner, vilket begränsar deras användning till system där detta kan läsasily uppnåtts.
Cellcykeln består av två aktiva faser: syntesen (S) fasen, där DNA replikeras och mitos (M) där celldelning sker. Dessa faser skiljs åt av tre gap faser, G 0, G 1 och G 2. G 0 eller passivitet, är en vilofas där cellen har lämnat cykeln, G 1 är där cellerna ökar i storlek före DNA-replikation och G2 där celltillväxt fortsätter mellan slutförandet av DNA-replikation, men innan celldelningen. Progressionen genom cellcykeln styrs av ett antal kontrollpunkter. G 1 checkpoint aktiveras när miljöförhållanden inte stöder DNA-syntes och hindrar ikraftträd S-fasen. Den intra-S-fasen checkpoint eller försening kan utlösas av DNA-skador som kan resultera i avstannade replikationsgafflar. Under G2 trohet den replikerade DNA bekräftas och om skador upptäcks då G2 3 Aktivering av dessa checkpoints används ofta för att synkronisera cellpopulationer. Cellcykelkontrollpunkter kan aktiveras av ett antal faktorer, men i cancerbiologi den vanligaste är detektion av DNA-skada. Den DNA-skada svaret initieras av PI3-kinasliknande kinaser ataxia telangiectasia och Rad3 relaterade (ATR) och ataxia telangiectasia mutated (ATM) som aktiverar nedströms effektor kinaser Chk1 och Chk2, respektive. 3 En rad händelser aktiverar Chk1 inklusive avstannat replikering gafflar, DNA-tvärbindningar, och ultraviolett strålning skador medan Chk2 främst aktiveras genom dubbelsträngbrott.
Den vanliga metoden för att studera effekten av ändrade förutsättningar på längden av cellcykeln is för att synkronisera cellerna i en särskild fas av cellcykeln. 1 Detta kan uppnås genom flera metoder. Celler kan separeras fysiskt baserat på storlek, täthet, sidospridning (granularitet), och cellyteexpression markörer. Mer praktiskt, kan celler synkroniseras med kemiska medel. Flera medel såsom tymidin, hydroxiurea och cytosinarabinosid kan användas för att hämma DNA-syntes i S-fasen av cellcykeln resulterar i en ackumulering av celler i S-fas som fortsätter cykling efter medlen avlägsnas. Celler behandlades med nokodazol, som förhindrar bildningen av den mitotiska spolen, gripande med en G 2 - eller M-fas DNA-innehåll. Eliminering av serum från odlingsmediet resulterar i en ackumulering av celler vid G 0 fasen. Åter tillsats av näringsämnen inom kultur serum återstartar den normala cykla av cellerna. Emellertid är alla dessa synkroniseringsmetoder störa normal cykling och tillväxt av celler och kan Result betydande celldöd.
Synkronisering av akut lymfoblastisk leukemiceller är särskilt utmanande och dessa celler är inte mottagliga för genetisk manipulation. Den här beskrivna metoden medger en bedömning av cellcykelns dynamik och studiet av celler i specifika faser av cellcykeln utan traditionell synkronisering eller genetisk modifiering. Denna metod kan också vara till nytta för andra celltyper där genetisk modifiering och traditionella synkroniseringsförfaranden inte lätt uppnås. Metoden bygger på den sedan länge etablerade användning av bromodeoxiuridin (BrdU) bolagsordning, som har mycket liten inverkan på kort sikt tillväxt och proliferation av celler. 4 Etablerade BrdU protokoll utnyttja införlivandet av BrdU i nysyntetiserat DNA under S-fasen . Detta markerar permanent celler som har varit i S-fas under BrdU exponering. Denna population kan identifieras vid senare tidpunkter genom färgning för BrdU incorporation och därigenom fungera som en synkroniserad population som kan följas och utvärderas över tiden tillåter studier av läkemedelseffekter på cellcykel transitering. BrdU behöver utsättas före antikroppsfärgning, uppnås vanligen efter DNas eller syrabehandling. 6,7 Använda flödescytometri för att detektera inkorporerade BrdU möjliggör införande av ytterligare markörer. Det viktigaste är att använda färgämnen för att mäta DNA-innehåll, gör det möjligt att bedöma cellcykeln fas fördelning av celler som var i S-fas i början av studien. 8 Dessutom ytterligare yta eller intracellulära antigener kan också studeras. 9 Dessa kan avse cellcykelhändelser såsom Ki67 eller till synes oberoende cellfunktioner såsom apoptosmarkörer som klyvs kaspas-3. De potentiella tillämpningar begränsas av fantasin hos utredaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som beskrivs här använder akut lymfoblastisk leukemi-cellinjen NALM6 men kan tillämpas på andra celltyper.
1. Lösningar och reagens
- Fullständigt RPMI
- Lägg 56 ml fetalt kalvserum (FCS) och 5,5 ml 200 mM L-glutamin till en 500 ml flaska RPMI-1640-medium.
- BrdU Förrådslösning
- Förbered 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
- BrdU fullständigt RPMI
- Lägg 6.2 pl BrdU stamlösning till 10 ml av komplett RPMI.
- DNas Lösning
- Bered 1 mg DNas / ml i DPBS.
- Färgning Buffert
- Bered 3% värmeinaktiverat FCS och 0,09% natriumazid i DPBS.
- Se Materiallista för definitioner av Fixering buffert, Permeabilization buffert och tvättbuffert.
2. Celler
NejTe: Celler inte odlades i mer än 6 månader. Denna metod är direkt anpassas till alla icke-vidhäftande cellinje med justeringar av celltäthet och odlingsmedier. Använd celler som växer exponentiellt vid initieringen av experimentet.
- Behåll NALM6 celler i T-75 odlingsflaskor i fullständigt RPMI. Utför alla steg under sterila betingelser med användning av en klass II biosäkerhet skåp.
- Behåll NALM6 celler mellan 1-2 x 10 6 celler per ml genom att dela kulturen tre gånger i veckan.
- Inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 i luft.
3. Puls Märkning av celler med BrdU
VARNING: Hantera BrdU med försiktighet eftersom det är en potentiell mutagen och teratogen.
- Centrifugera cellerna vid 150 xg under 5 min. Obs: Överföra celler i färskt medium förbättrar reproducerbarhet av resultaten.
- Utför en cellräkning och återsuspendera cellerna i fullständigt RPMI på 2 x 10 6 cElls / ml.
- Späd celler 1 i två med BrdU fullständigt RPMI framställning av en slutlig cellkoncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 45 minuter, späd sedan cellerna 1 i 10 med fullständigt RPMI. Centrifugera cellerna vid 150 xg under 5 minuter och noggrant kassera alla av supernatanten.
- Resuspendera cellerna i en liten volym (~ 100 | al) av fullständigt RPMI, utför en cellräkning och justera till 1 x 10 6 celler / ml.
- Pipettera 1 ml av cellerna till brunnarna i en 48-brunnsplatta. Pipettera 1 ml DPBS till alla lediga brunnar för att få mer reproducerbara resultat.
- Inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 i luft för önskade tidpunkter, här en, två, tre, fyra, fem, sex, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, och 24 timmar. Obs: Den tid kommer att bero på vad den experimentella utformningen är att mäta.
- Överför alla celler i FACS rör med hjälp av en pipett. Skölj väl i följd med 1 ml VOLUmes PBS till en slutlig total volym av 5 ml.
- Centrifugera vid 150 xg under 5 minuter och försiktigt bort alla supernatanten. Cellerna är redo för färgning, utföra denna (avsnitt 4) omedelbart.
4. Cell Färgning
Obs: Om det krävs ytan färgning av celler utföra det före fixering, se till att cellerna hålls vid 4 ° C under hela.
- Resuspendera cellerna i 100 | il färgningsbuffert (för valfri ytfärgning, tillsätt den rekommenderade volymen av antikropp till ytantigener och inkubera under 30 minuter vid 4 ° C).
- Tillsätt 1 ml färgningsbuffert, centrifugera i 5 minuter vid 150 xg och kassera supernatanten.
Obs: Specifik antikropp, koncentration, inkubationstiden mm kommer att variera beroende på specifika experimentella mål. - Fixering och Permeabilization
- Resuspendera cellerna i 100 ^ il fixeringsbuffert och inkubera under 15 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml of tvättbuffert, centrifugera i 5 min vid 150 x g och kasta supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 | il permeabilization buffert och inkubera cellerna under 10 min på is.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert, centrifugera under 5 min vid 150 x g, och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 ^ il fixeringsbuffert per rör och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert, centrifugera under 5 min vid 150 x g, och kassera supernatanten.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här om det behövs. De fixerade cellerna är stabila under flera dagar vid 4 ° C om återsuspenderades i färgningsbuffert. Ta bort färgning buffert efter centrifugering innan du fortsätter.
- DNas Behandling
- Resuspendera cellerna i 100 | il DNas-lösning (30 | j, g av DNas / 10 6 celler) och inkubera cellerna under 1 h vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert, centrifugera vid 150 xg under 5 min och kassera supernatanten.
- Antikropp Färgning
Anmärkning: Färgning för andra än BrdU intracellulära markörer kan utföras samtidigt med BrdU färgning.- VIKTIGT: Förbered ersättning kontroller bestående av ofärgade celler och celler märkta med varje enskild fluorokrom. Helst använder samma antikroppar för ersättnings kontroller som de som används i de experimentella rör. Men om detta inte är möjligt, ersätta antikroppar mot höguttryckta antigener konjugerade till samma fluorokrom.
- Resuspendera cellerna i 50 | il tvättbuffert och tillsätt 1 pl / 10 6 celler av BrdU-antikropp. Obs: Direkt konjugerade antikroppar mot andra specifika intracellulära antigener kan också tillsättas.
Anmärkning. Antikroppar mot histon H3 fosforylerades på Ser10 kan användas för att skilja mellan celler i G2 och M, är histon H3 fosforylerad på Ser10 under mitos 10 Antikroppar mot cdc2 fosforylerades på Tyr15 kan användas för att detektera celler som HAVe åtagit sig att mitos. 11 - Inkubera cellerna i 20 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert, centrifugera celler vid 150 xg under 5 min och kassera supernatanten.
- Fläck DNA för cellcykelanalys
- Lossa pelleten och tillsätt 20 | il av den 7-AAD-lösning (0,25 ^ g). OBS: Det är viktigt att använda en konstant mängd av 7-AAD / cell.
- Resuspendera cellerna i 1 ml färgning buffert.
5. Insamling av flödescytometri Data
Obs: Maskinen krävs kommer att bero på antalet och typen av fluorokromerna används.
- Samla följande parametrar: FSC-A, SSC-A, FSC-H (FSC-W kan användas i stället för FSC-H) och 7-AAD-fluorescens på en linjär skala. Samla APC-kanalen på en log-skala. Samla några ytterligare kanaler som krävs för bedömning av yttre eller inre etiketter med en logaritmisk skala.
- Utför comersättning av överlappande signaler i emissionsspektra observerats mellan olika fluorokromer innan analysera proverna. Obs: De flesta flödescytometrar skall göra detta automatiskt.
- Samla minst 10.000 händelser för varje prov.
6. Analys av flödescytometri Data
Obs: FlowJo användes i denna studie för flödescytometri analys av data men andra programvarupaket kan också användas. Gating Strategin illustreras i fig 1.
- Identifiera levande celler befolkningen som använder FSC-A och SSC-A parametrar.
- Inom denna population utesluter dubbletter och aggregat som använder FSC-A och FSC-H (FSC-W kan även användas här).
- Inom denna population ställa ett punktdiagram med användning av 7-AAD på x-axeln och BrdU-APC på y-axeln.
Figur 1: Gating strategi Vänster pa.nel: ungated celler visas på en FCS-A kontra SSC-A punktdiagram. Den viabla cellpopulation identifieras av grinden visad. Center panel: celler gated från den vänstra panelen visas på ett FSC-A mot FSC-H punktdiagram (FSC-W kan användas i stället för höjd). Dubletter och aggregat identifieras och undantas genom porten visas. Höger panel: celler gated från dubb utanförskap datum i mittpanelen visas på en 7-AAD kontra APC-A punktdiagram. BrdU antikropp märks med APC möjliggör identifiering av celler som har inkorporerat BrdU under pulsmärkning. 7-AAD ger information om DNA-innehållet. Den övre porten definierar celler positiva för BrdU och därför i S-fas vid tidpunkten för BrdU puls, det nedre vänstra porten, celler i G 0/1 och nedre högra porten som i G2 / M. Klicka här för att se en större version av denna siffra.- Cellcykel A NALYS
- Öppna den första datafilen och grinden på cellerna i dubb uteslutning grind.
- Analysera denna population för cellcykelfördelning (placerad under plattformar i Flojo programvara) och använd Dean-Jett-Fox modell.
- Skaffa positioner G 0/1 och G 2 / M toppar använder skapa grindar.
- Gate på BrdU positiva celler och på denna population med samma cellcykelanalys.
- Ge positionerna för G 0/1 och G 2 / M toppar genom att tillämpa samma portar från skapa grindar och ställa begränsningar (med de skapade grindar) för positionerna för G 0/1 och G 2 / M toppar. Detta illustreras i de första två paneler av fig 2.
Obs: Andra program kan också användas för att analysera data och instruktioner skulle variera i enlighet därmed.
840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 2:. Cellcykelprogressionen Den första panelen (alla celler) är gated på cellpopulationen som definieras av dubb utslagning porten. Denna population var visas i ett histogram med 7-AAD på X-axeln. Toppen av G 0/1 topp indikeras med pilen under axeln. I efterföljande paneler BrdU positiva celler har gated på såsom visas i fig 1. Värdet för G 0/1 positionen erhålles när grindning av dubbletten uteslutning grinden appliceras på BrdU positiva gated celler inom FlowJo cellcykel programvara. Varje efterföljande panel gated på BrdU positiva befolkningen som visas i figur 1 och läget för G 0/1 topp baserat på det värde som erhålls när man analyserar hela befolkningen som visas i de två första panelerna. Använda BrdU negativa fraktionen för att identifiera platsen för G 0/1 populationen för BrdU-positiva celler i samma sample kontroller för några små skillnader i intensitet av DNA fläcken mellan prover. Det nummer som visas på varje panel representerar tiden sedan BrdU puls slut. De beräknade cellcykelfaser visas i skuggade grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod kan användas för att erhålla en mängd information. Några program beskrivs här.
Bedömning av varaktigheten av cellcykeln
För att bestämma den tid som erfordras för celler att passera genom cellcykeln, skördas celler vid olika tidpunkter efter BrdU pulsen. Intervallen mellan bedömningarna kan anpassas till de speciella celler som analyserats. Hematopoietiska cellinjer bedömdes varje timme under en 24 h period i frånvaro av någon läkemedelsbehandling för att bestämma längden av cellcykelfaser under standardodlingsbetingelser. Fig 2 visar ett urval av ögonblicksanalys av NALM6 celler under en 24 h period. Cellerna i S-fas vid tidpunkten för BrdU puls (dvs inom BrdU positiva porten i figur 1) utvecklats genom G2 / M, med en topp på celler i denna fas av cellcykeln som detekteras 10 timmar efter BrdU pulse. Andelen BrdU märkta celler i S-fas nådde sin nadir 14 timmar efter pulsen och nästan alla celler hade återvänt till G 1 efter 17 timmar. Genom 24 timmar en del av BrdU märkta celler hade återinträdde S-fas som en del av nästa cellcykeln vilket indikerar att cellerna kan fylla en cellcykeln inom 24 timmar, men de flesta hade ännu inte gått in i en andra omgång av replikation, vilket överensstämmer med den kända 36 h dubbleringstid för dessa celler.
Cellcykelfördelning kan raffineras ytterligare genom införlivande av ytterligare markörer. Till exempel, tillsats av en antikropp mot histon H3 fosforylerades på Ser10 (en markör för celler i mitos) tillåter diskriminering av celler i mitos från dem i G 2 (vänster paneler av fig 3).
Figur 3: Bekräftelseav Cellcykel Steg Använda ytterligare markörer. De övre fälten visar den cellcykelanalys av celler från den positiva porten BrdU såsom visas i fig 1. Cellerna hade inkuberats i närvaro eller frånvaro av 3 nM vinkristin under 18 h efter BrdU pulsen . Den cellcykelanalys utfördes såsom beskrivits i Figur 2. De lägre panelerna visar samma celler på 7-AAD kontra Histon H3 fosforylerade på Ser10 punktdiagram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bedömning av läkemedelseffekter på cellcykeln
Cytotoxiska medel kan få långtgående effekter på cellcykeln framsteg och kan inducera celldöd. Effekten av droger på cellcykelprogression kan bedömas genom att tillsätta läkemedel av intresse efter BrdU pulsen. Två exempel är visade. Den första var en situation där induktion of celldöd förvirrad analys av cellcykeldata (höger sida i figur 3). NALM6 celler hade exponerats för 3 nM vinkristin för 18 timmar efter BrdU pulsen. Celler förväntas gripa in mitos som vinkristin mål mikrotubuli. Emellertid cellcykelanalysen antydde att cellerna inte hade arrest men transiterat genom till G 0/1 (fig 3 övre högra panelen). Tillsatsen av en antikropp mot histon H3 fosforylerades på Ser10 visade att celler inte hade lämnat mitos (figur 3 undre högra panelen), trots att de har en reducerad DNA-halt. Det är troligt att DNA-halten minskades på grund av att cellerna genomgår apoptos och hade börjat att försämra deras DNA. Eftersom cellerna initieras apoptos medan mitos (dvs med 4N DNA), visas de som S-fasen eller G 0/1 celler i stället för den typiska apoptotiska under G 1 topp.
Figur 4:. Upptäckt av cellcykeln Stage Specifik döda dot tomter visar andelen BrdU positiva celler kvar i kulturen 24 timmar efter BrdU puls. Cellerna hade odlats i närvaro eller frånvaro av enbart vehikel (kontroll), 1,5 eller 16 ^ M RAD001 sedan slutet av BrdU-puls. Den nedre panelen visar andelen celler som var BrdU positiva över 24 timmars inkubering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I ett annat exempel, Figur 4 visar hur i närvaro av en låg koncentration av RAD001 (en mTOR-hämmare) celler kunde slutföra cellcykeln men sedan genomgick en försening eller gripande i G 0/1. En högre koncentration av RAD001 till stor del förhindras celler från transiting igenom till G 0/1. Viktigt celler i S-fas (dvs. BrdU positiva) visade sig företrädesvis försvinna från kulturen när RAD001 tillsattes. Detta tyder på att celler som passerar genom G2 / M var mer mottagliga för celldöd genom detta medel. 12
Det är också möjligt att undersöka svaren av celler i olika faser av cellcykeln med hjälp av antikroppar mot specifika antigener. I fig 5 aktiveringen av cellcykelkontrollpunkts kontrollerande proteiner Chk1 och Chk2 som svar på vinkristin behandling visas. Chk1 och Chk2 aktiveras genom fosforylering på Ser345 och Thr68 respektive. Aktivering av Chk1 och Chk2 kan ses i celler som verkar ha en 2N DNA-innehåll, men som visas i figur 5 kommer sannolikt att vara celler i mitos som börjat DNA nedbrytning som ett resultat av apoptos.
Det är möjligt att lägga till läkemedel vid olika tidpunkter efterBrdU puls för att undersöka effekten av medlet på celler i olika stadier av cellcykeln.
Figur 5:. Upptäcka förändringar till celler i speciella cellcykelfaser Den övre panelen visar celler gated på BrdU positiva celler som i figur 1 i 7-AAD kontra fosforylerad Chk1 (vänster) eller Chk2 (höger) punktdiagram. Cellerna hade varit odling under 18 h efter BrdU-puls i närvaro eller frånvaro av 3 nM vinkristin som för figur 3. De nedre fälten visar overlay histogram av samma celler grindade på antingen 2N eller 4N fraktion såsom anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att analysera cellcykeln är viktigt för förståelsen av cancerbiologi och verkningsmekanismen av båda läkemedlen och gener som påverkar cellproliferation och tillväxt. Medan det finns en mängd olika analyser som enligt uppgift mäter cellproliferation, endast majoriteten ge ett mått som anger antalet celler närvarande. Dessa inkluderar analyser som mäter antalet celler genom direkt visualisering och räkna, metabolisk aktivitet eller ATP koncentration. Den största fördelen med många av dessa metoder är att de är relativt lätta att utföra och mottagliga för mikroplattformat och automatisering, vilket gör dem användbara för screening av ett stort antal villkor eller föreningar. En brist hos många av dessa metoder är att cellförlust pga dödsfall inte beaktas, vilket kan leda till en underskattning av cellproliferation. Också dessa metoder mäter bulkpopulation och tillåter inte att studera enskilda celler eller transitering av celler genomcellcykeln.
Av de vanligen använda proliferationsanalyser, kanske den mest tillförlitliga och exakta är de som mäter DNA-syntes. Traditionella cellproliferationsanalyser inkubera cellerna under några timmar till över natten med 3 H-tymidin, som införlivas i nyligen syntetiserad DNA. 13 Det uppenbara problemet med denna metod är användningen av radioaktiva material, men en annan begränsning är att resultat mäter den genomsnittliga proliferation av en population av celler. BrdU kan på liknande sätt användas utan frågorna strålnings, även om ytterligare steg krävs och BrdU är en potentiell mutagen. Men har BrdU fördelen av att vara kompatibel med flödescytometri, medger analys av enskilda celler. 14 Annan flödescytometri kompatibla metoder för att bedöma celltillväxt vid den enda cellnivå inkluderar ett växande antal färgämnen som märka cellmembranet eller cellproteiner ( t.ex. CFSE) som delar mellan daughtER-celler, DNA-interkalerande färgämnen och cellcykelspecifikt antigen upptäckt av antikroppar. Det bästa av cellmärknings färgämnen tillåter celldelning spårning över ett antal celldelningar. 15 De ger ett direkt mått på spridning, även om ingen information om cellcykelstadiet eller distribution erhålls. Mätningen av DNA-innehåll med hjälp av DNA-interkalerande färgämnen såsom propidiumjodid eller 7-AAD ger starka cellcykelfördelning 16, men inte tidsmässiga data. Även med bedömningen av multipla tidpunkter det förblir omöjligt att bedöma längden av cellcykeln eller specifika cellcykelfaser. Cellcykelspecifika antigener kan användas för att bedöma cellcykelfasen i ett osynkroniserat cellpopulationen. Vanligen används cellcykelspecifika antigener innefattar Ki-67, 17 som uttrycks under S, G2 och M-faserna av cellcykeln men inte under G 0/1, PCNA (pcna) 18, och fosforylering av hiStone H3. 19 Även om dessa ger goda uppgifter om cellcykeln skede upplysningar om cellcykel dynamik saknas.
Inhämta uppgifter om cellcykel dynamik har traditionellt undersökts genom att synkronisera celler med användning av medel eller odlingsbetingelser som blockerar cellcykelprogressionen. Detta orsakar en ackumulering av celler bakom blocket, som en gång avlägsnats, resultera i våg av celler fortskrider tillsammans genom cellcykeln. 1 Beräkningen av varaktigheten av cellcykeln och längden av de olika cellcykelfaser är sedan möjligt. Celler kan förmås att lämna aktiv cellcykel in G 0 av serumdeprivation. Vid åter tillsats av serum cellerna kan sedan flytta ihop till senare faser. 20 Även om detta är en tillförlitlig metod för vissa celltyper, andra, däribland många transformerade celltyper, misslyckas med att avsluta cellcykeln och ofta genomgå celldöd som en resultat. 21 Faktiskt vår studör tyckte att det här vara fallet för akut lymfatisk leukemi celler. Dessutom kommer cellerna ofta misslyckas med att inträda cellcykeln på ett tillräckligt synkroniserat sätt. Kemiska metoder kan användas för att inducera cellcykelstopp vid specifika faser av cellcykeln. Till exempel, medel som förhindrar DNA-syntes (t ex överskott tymidin) eller förhindra den mitotiska spolen bildning (t.ex. nokodazol) stoppa celler i S och M-faserna respektive, men är giftiga och kan resultera i tillväxtstörningar och till och med död hos en betydande andel av den celler. 22 i alla celler dessa metoder inte att arrestera de flesta celler utan att döda en betydande andel. Med tanke på att syftet var att bedöma effekterna av en potentiell anti-leukemimedel på cellcykelparametrar, celldöd till följd av synkronisering var oacceptabelt. Trots beskrivningen av ett stort antal metoder för att synkronisera cellerna, alla har brister. De största problemen är: ett otillräckligtanrikning för celler i den önskade delen av cellcykeln, störningar på normala fysiologin av cellcykeln eller, såsom observerats, överskott toxicitet.
Den metod som beskrivs här är en enkel utvidgning av den långa används pulssystemet, där cellerna inkuberas under en kort period med BrdU att identifiera celler i S-fas. Vi fann en 45 min puls vara optimal i vårt system men kortare tidsperioder kan användas om tillräcklig märkning erhålls. Genom att fortsätta att odla celler efter avlägsnande av BrdU är det möjligt att spåra deras progression genom resten av S-fasen, G 2, mitos, G 1 och inträde i nästa cellcykeln. Det kan vara möjligt att följa cellerna ytterligare. Fördelen med detta system är att det inte finns några tecken på toxicitet till cellerna i tidsramen för dessa experiment och det finns minimala störningar i tillväxten av celler, eftersom endast ett par medie förändringar krävs. Cellerna i övrigt hålls i continuous kultur. Den flödescytometri baserad typ av metod innebär att den kan kombineras med identifieringen av cellsubpopulationer genom ytterligare yta eller intracellulär färgning. Vi använde APC konjugerade BrdU-antikroppar men andra konjugat kan vara substituerad för att underlätta utvecklingen av paneler antikropps. Vi använde 7-AAD snarare än propidiumjodid eftersom 7-AAD fluorescerar i en enda kanal maximera alternativ för flerfärgad färgning. Likaså DAPI eller Hoechst kan användas som DNA-fläckar men kräver en UV-laser. Strängare CV för DNA-färgning kan erhållas med användning av etanol fixering men detta äventyrar ofta antikroppsfärgning, vilket begränsar möjligheterna för extra yta eller cytoplasmiska fläckar. Den största nackdelen är att S fas varar omkring 8 timmar, så märkta celler kan ha just gått in eller på väg att avsluta S-fas under pulsperioden. Som ett resultat, är synkroniseringen inte så tätt som med några andra system. Men genom att kombinera BrdU märkning med färgämnen som indikerar DNAinnehåll och antikroppar mot specifika cellcykelberoende proteiner, kan starka data erhållas.
För att få konsekventa uppgifter är det viktigt att säkerställa att cellerna är i rätt koncentration och att cellkoncentrationen är enhetligt för alla de villkor som jämförs. Kritiskt ljusstyrka 7-AAD-färgning är mycket känslig för cellkoncentration. Använda en automatiserad cellräkning systemet kan bidra till att cellkoncentrationer är konsekventa i alla prover vid varje steg i processen. En annan viktig punkt är den tid cellerna utsätts för BrdU. Små variationer kan översätta till stora skillnader, så det är viktigt att alla prover inkuberas med BrdU i exakt samma tidpunkt. Slutligen är det viktigt att titrera antikroppar att erhålla optimal färgning och detta bör upprepas närhelst en sats ändras. Om alla steg följs konsekvent och cellkoncentrationer hålls konstant sedan detta metod kommer tillförlitligt möjliggöra spårning av celler genom cellcykeln utan behov av synkronisering. Det finns också stora möjligheter att ändra denna metod för att passa speciella celltyper och behandla specifika frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
