Summary
Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.
Introduction
La valutazione delle caratteristiche del ciclo cellulare e cambiamenti che si verificano nelle cellule durante la progressione del ciclo cellulare è fondamentale per capire molti aspetti della biologia, in particolare biologia del cancro. Molti agenti di sviluppo per il trattamento di tumori maligni hanno effetti profondi sulla progressione del ciclo cellulare o indurre la morte cellulare per ciclo cellulare dipendente-meccanismi. Per studiare la dinamica del ciclo cellulare o cellule in una particolare fase del ciclo cellulare, si è soliti sincronizzare cellule. Tuttavia metodi di sincronizzazione possono avere effetti negativi sulle cellule in fase di studio, potenzialmente confondere i risultati ottenuti. 1 analisi Recentemente l'uso di proteine con tag fluorescenza che sono presenti solo in determinati fasi del ciclo di cellule hanno permesso di progressione del ciclo cellulare in cellule singole nel tempo 2, tuttavia le cellule da studiare bisogno di essere manipolato geneticamente per esprimere queste proteine taggati, limitando il loro utilizzo ai sistemi in cui questo può essere lettoily raggiunto.
Il ciclo cellulare è costituito da due fasi attive: la fase di sintesi (S), in cui il DNA si replica e la mitosi (M), dove la divisione cellulare si svolge. Queste fasi sono separate da tre fasi gap, G 0, G 1 e G 2. G 0 o quiescenza, è una fase di riposo in cui la cellula ha lasciato il ciclo, G 1 è dove le cellule aumentano di dimensione prima replicazione del DNA e G 2 dove la crescita cellulare continua tra il completamento della replicazione del DNA ma prima divisione cellulare. La progressione attraverso il ciclo cellulare è controllato da una serie di punti di controllo. Il G 1 checkpoint si attiva quando le condizioni ambientali non sono favorevoli della sintesi del DNA e impedisce l'entrata in fase S. La fase di checkpoint o ritardo intra-S possono essere attivati da danni al DNA che può provocare forche replica stallo. Durante G 2 la fedeltà del DNA replicato è confermata e se il danno è rilevato poi il G 2 3 L'attivazione di questi punti di controllo è comunemente usato per sincronizzare popolazioni cellulari. Checkpoint del ciclo cellulare possono essere attivati da una serie di fattori, ma in biologia del cancro il più comune è il rilevamento dei danni al DNA. La risposta al danno al DNA è iniziata dalla PI3-chinasi-like chinasi telangiectasia atassia e RAD3 connessi (ATR) e atassia telangiectasia mutato (ATM) che attivano chinasi effettori a valle Chk1 e CHK2 rispettivamente. 3 una serie di eventi attiva Chk1 compresi stallo forche replica, legami crociati DNA, e danni radiazione ultravioletta mentre Chk2 è attivata principalmente da rotture del doppio filamento.
Il metodo usuale per studiare l'effetto di mutate condizioni della lunghezza del ciclo cellulare is per sincronizzare le cellule in una particolare fase del ciclo cellulare. 1 Ciò può essere ottenuto mediante diversi metodi. Le celle possono essere fisicamente separate in base alle dimensioni, densità, dispersione laterale (granularità), e marcatori di espressione di superficie cellulare. Più in concreto, le cellule possono essere sincronizzati con mezzi chimici. Diversi agenti come timidina, citosina arabinoside e idrossiurea possono essere utilizzati per inibire la sintesi del DNA nella fase S del ciclo cellulare risultante in un accumulo di cellule nella fase S che continuano ciclismo dopo che gli agenti sono rimossi. Le cellule trattate con nocodazole, che impedisce la formazione del fuso mitotico, l'arresto a G 2 - o M-fase contenuto di DNA. Eliminazione di siero dai risultati medi cultura in accumulo di cellule in G 0 fase. Tale aggiunta dei nutrienti nei siero cultura ri-avvia il normale bicicletta delle cellule. Tuttavia, tutti questi metodi di sincronizzazione interferisce con il ciclismo normale e la crescita delle cellule e possono Result significativa morte cellulare.
La sincronizzazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta è particolarmente impegnativo e queste cellule non sono suscettibili di manipolazione genetica. Il metodo qui descritto consente di stimare le dinamiche del ciclo cellulare e lo studio delle cellule in particolari fasi del ciclo cellulare senza sincronizzazione tradizionale o modificazione genetica. Questo metodo può anche essere utile per altri tipi di cellule in cui la modificazione genetica e procedure di sincronizzazione tradizionali non sono facilmente ottenibili. Il metodo si basa sull'uso consolidata di bromodeossiuridina (BrdU), che ha un impatto sulla crescita a breve termine e la proliferazione delle cellule. 4 protocolli BrdU fondazione sfruttano l'incorporazione di BrdU nel DNA di nuova sintesi in fase S . Questo segna definitivamente le cellule come dopo essere stato in fase S durante l'esposizione BrdU. Questa popolazione può essere identificato in momenti successivi con la colorazione per BrdU Incorporzione e quindi agiscono come una popolazione sincronizzato che può essere seguito e valutati nel corso del tempo permettendo lo studio degli effetti dei farmaci sul transito del ciclo cellulare. BrdU deve essere esposto prima della colorazione degli anticorpi, di solito raggiunti per DNasi o trattamento con l'acido. 6,7 citometria a flusso per rilevare BrdU incorporata consente l'inserimento di altri marker. La più importante è l'uso di coloranti per misurare il contenuto di DNA, consentendo la valutazione del ciclo cellulare distribuzione di fase delle cellule che erano in fase S all'inizio dello studio. 8 Inoltre aggiuntivi antigeni di superficie o intracellulari possono essere studiate. 9 Questi possono riguardare eventi del ciclo cellulare, come Ki67 o funzioni cellulari per apparentemente non correlate, come marcatori di apoptosi, come spaccati caspasi-3. Le potenziali applicazioni sono limitate dalla fantasia del ricercatore.
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Protocol
Il protocollo qui descritto utilizza la linea cellulare linfoblastica acuta leucemia NALM6 ma può essere applicato ad altri tipi di cellule.
1. Soluzioni e reagenti
- Completa RPMI
- Aggiungere 56 ml di siero fetale bovino (FCS) e 5,5 ml di 200 mM di L-glutammina in un flacone da 500 ml di mezzo RPMI-1640.
- BrdU Stock Solution
- Preparare 32.5 BrdU mm (10 mg / ml) in Dulbecco tampone fosfato (DPBS).
- BrdU completo RPMI
- Aggiungere 6,2 ml di soluzione madre BrdU per 10 ml di RPMI completo.
- DNase Soluzione
- Preparare 1 mg DNase / ml in DPBS.
- Colorazione Buffer
- Preparare 3% FCS inattivato al calore e 0,09% di sodio azide in DPBS.
- Vedi Materiali Lista per le definizioni di Fixation Buffer, Permeabilization tampone e tampone di lavaggio.
2. Cellule
NoTE: Le cellule non sono state coltivate per oltre 6 mesi. Questo metodo è direttamente adattabile a qualsiasi linea cellulare non aderente con adattamenti densità cellulare e coltura. Utilizzare le cellule che stanno crescendo in modo esponenziale a inizio dell'esperimento.
- Mantenere le cellule NALM6 in T-75 fiasche di coltura in RPMI completo. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili utilizzando una classe II biosicurezza Cabinet.
- Mantenere le cellule NALM6 tra 1-2 x 10 6 cellule per ml dividendo cultura tre volte alla settimana.
- Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 in aria.
3. Pulse Etichettatura di Celle con BrdU
ATTENZIONE: Maneggiare con cura BrdU in quanto è un potenziale mutageno e teratogeno.
- Cellule centrifugare a 150 xg per 5 min. Nota: Trasferimento di cellule in mezzi freschi migliora la riproducibilità dei risultati.
- Eseguire un numero di celle e risospendere le cellule in RPMI completo a 2 x 10 6 cells / ml.
- Diluire le cellule in 1 2 con BrdU completo RPMI producendo una concentrazione cellulare finale di 1 x 10 6 cellule / ml.
- Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 45 minuti, poi diluito 1 a 10 celle con RPMI completo. Cellule centrifugare a 150 xg per 5 minuti e con attenzione scartano tutto il surnatante.
- Risospendere le cellule in un piccolo volume (~ 100 ml) di RPMI completo, eseguire un conteggio delle cellule e regolare per 1 x 10 6 cellule / ml.
- Pipettare 1 ml di cellule nei pozzetti di una piastra ben 48. Pipettare 1 ml di DPBS in qualsiasi pozzetti non occupate per ottenere risultati più riproducibili.
- Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 in aria per timepoints desiderati, qui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24 ore. Nota: La lunghezza del tempo dipenderà da ciò che il disegno sperimentale mira a misurare.
- Trasferire tutte le cellule in tubi FACS con una pipetta. Sciacquare la sequenza bene con 1 ml volumes di PBS per un volume totale finale di 5 ml.
- Centrifugare a 150 xg per 5 minuti e rimuovere con attenzione tutto il surnatante. Le cellule sono pronte per la colorazione, eseguire questa (sezione 4) immediatamente.
Colorazione 4. cellulare
Nota: Se è richiesta superficie colorazione di cellule eseguirla prima del fissaggio, in modo che le cellule sono conservati a 4 ° C per tutta.
- Risospendere le cellule in 100 ml di tampone colorazione (per facoltativo colorazione della superficie, aggiungere il volume consigliato di anticorpi di superficie antigeni e incubare per 30 minuti a 4 ° C).
- Aggiungere 1 ml di tampone colorazione, centrifugare per 5 min a 150 xg ed eliminare il surnatante.
Nota: l'anticorpo specifico, la concentrazione, il tempo di incubazione ecc varierà a seconda degli obiettivi sperimentali specifici. - Fissazione e permeabilizzazione
- Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone di fissaggio e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml of tampone di lavaggio, centrifugare per 5 min a 150 xg ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone permeabilizzazione e incubare le cellule per 10 min in ghiaccio.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifuga per 5 minuti a 150 xg, e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone di fissaggio per tubi e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifuga per 5 minuti a 150 xg, e scartare il surnatante.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, se necessario. Le cellule fissate sono stabili per diversi giorni a 4 ° C se risospeso in tampone colorazione. Rimuovere il buffer di colorazione seguente centrifugazione prima di procedere.
- DNase Trattamento
- Risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione di DNasi (30 microgrammi di DNasi / 10 6 cellule) e incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifugare a 150 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Anticorpi colorazione
Nota: colorazione di marcatori intracellulari diversi BrdU può essere eseguita contemporaneamente alla colorazione BrdU.- IMPORTANTE: Preparare controlli di compensazione costituiti da cellule non colorati e cellule marcate con ogni singolo fluorocromo. Idealmente, utilizzare gli stessi anticorpi per i controlli di compensazione come quelle utilizzate nei tubi sperimentali. Tuttavia, se ciò non è fattibile, anticorpi sostituto antigeni altamente espressi coniugati allo stesso fluorocromo.
- Risospendere le cellule in 50 ml di tampone di lavaggio e aggiungere 1 ml / 10 6 cellule di anticorpi BrdU. Nota: anticorpi coniugati direttamente ad altri antigeni intracellulari specifici possono anche essere aggiunti.
NOTA:. Gli anticorpi anti istone H3 fosforilata in Ser10 possono essere utilizzati per discriminare tra cellule in G2 e M, istone H3 è fosforilata in Ser10 durante la mitosi 10 Anticorpi anti cdc2 fosforilati su Tyr15 può essere utilizzato per rilevare le cellule che HAVe impegnata per mitosi. 11 - Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, le cellule centrifugare a 150 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
- DNA Stain per l'analisi del ciclo cellulare
- Allentare pellet e aggiungere 20 ml di soluzione di 7-AAD (0,25 mg). Nota: è fondamentale utilizzare una quantità costante di 7-AAD / cell.
- Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di colorazione.
5. Raccolta di Citometria a Flusso di dati
Nota: La macchina richiesta dipenderà dal numero e natura dei fluorocromi usati.
- Raccogliere i seguenti parametri: FSC-A, SSC-A, FSC-H (FSC-W possono essere utilizzati al posto di FSC-H) e 7-AAD fluorescenza su una scala lineare. Raccogliere il canale APC su una scala logaritmica. Raccogliere eventuali canali aggiuntivi necessari per la valutazione della superficie o interne etichette utilizzando una scala logaritmica.
- Eseguire comcompensazione dei segnali in spettri di emissione osservata tra diversi fluorocromi prima di analizzare i campioni si sovrappongono. Nota: La maggior parte dei citofluorimetri eseguirà automaticamente.
- Raccogliere almeno 10.000 eventi per ciascun campione.
6. Analisi di citometria a flusso di dati
Nota: FlowJo stato utilizzato in questo studio per citometria di flusso possono essere utilizzati anche l'analisi dei dati, ma altri pacchetti software. La strategia di gating è illustrato nella figura 1.
- Identificare la popolazione di cellule vitali con i parametri FSC-A e SSC-A.
- All'interno di questa popolazione escludere doppietti e aggregati utilizzando FSC-A e FSC-H (FSC-W possono anche essere usato qui).
- All'interno di questa popolazione impostare un diagramma a punti con 7-AAD sulla xe BrdU-APC sul y.
Figura 1: strategia di gating pa sinistra.nel: cellule ungated vengono visualizzati su un FCS-A e SSC-A dot plot. La popolazione di cellule vitali è identificata dalla porta mostrato. Pannello centrale: le cellule gated dal pannello a sinistra vengono visualizzati su un FSC A vs. FSC-H dot plot (FSC-W può essere usato al posto di altezza). Farsetti e aggregati sono identificati, ed esclusi dalla porta mostrato. A destra: le cellule gated dalla data di esclusione doppietto nel pannello centrale vengono visualizzati su un 7-AAD vs. APC-A diagramma a punti. L'anticorpo è marcato con BrdU APC consentono di identificare le cellule che hanno incorporato BrdU durante l'etichettatura impulso. 7-AAD fornisce informazioni sul contenuto di DNA. La porta superiore definisce cellule positive per BrdU e quindi in fase S al tempo dell'impulso BrdU, porta inferiore sinistra, cellule in G 0/1 e la porta inferiore destro quelli in G 2 / M. Fare click qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.- Cell Cycle A nalisi
- Aprire il primo file di dati porta e sulle cellule del cancello esclusione doppietto.
- Analizzare questa popolazione per la distribuzione del ciclo cellulare (che si trova sotto le piattaforme di software Flojo) e utilizzare il modello Dean-Jett-Fox.
- Ottenere le posizioni del G 0/1 e G 2 / M vette utilizzando creare cancelli.
- Porta sul BrdU cellule positive e soggetti a questa popolazione stessa analisi del ciclo cellulare.
- Fornire le posizioni per la G 0/1 e G 2 / M picchi applicando le stesse porte da creare porte e impostare vincoli (utilizzando le porte create) per le posizioni del G 0/1 e G 2 / M picchi. Questo è illustrato nei primi 2 pannelli di figura 2.
Nota: altri software può essere utilizzato anche per analizzare i dati e le istruzioni varierebbe di conseguenza.
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Figura 2:. Cell Cycle Progression Il primo pannello (tutte le celle) è recintato sulla popolazione di cellule definito dalla porta esclusione farsetto. Questa popolazione è stata visualizzata in un istogramma con 7-AAD sulla X-asse. Il picco della G 0/1 picco è indicata dalla freccia sotto dell'asse. In pannelli successivi cellule positive BrdU sono stati gated come mostrato in Figura 1. Il valore per la posizione G 0/1 ottenuto quando gating del cancello esclusione doppietto è applicato alle cellule BrdU positive gated nel software ciclo cellulare FlowJo. Ogni pannello posteriore sia stato gating sulla popolazione positiva BrdU come mostrato nella figura 1 e la posizione del G 0/1 picco in base al valore ottenuto quando si analizza l'intera popolazione come mostrato nelle prime due pannelli. Utilizzando la frazione negativo BrdU per identificare la posizione della popolazione G 0/1 per le cellule positive BrdU nella stessa SAMPle controlla per eventuali lievi differenze nell'intensità della macchia DNA tra i campioni. Il numero indicato su ogni pannello rappresenta il tempo da quando l'impulso BrdU conclusa. Le fasi del ciclo cellulare calcolati sono mostrati in verde ombreggiato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Questo metodo può essere utilizzato per ottenere una serie di informazioni. Alcune applicazioni sono elencate qui.
Valutazione della durata del ciclo cellulare
Per determinare il tempo necessario per le cellule di transito attraverso il ciclo cellulare, le cellule vengono raccolte in vari momenti seguenti dell'impulso BrdU. Gli intervalli tra le valutazioni possono essere adattati alle particolari cellule essere analizzati. Linee cellulari ematopoietiche sono stati valutati ogni ora per un periodo di 24 ore in assenza di qualsiasi trattamento farmacologico per determinare la lunghezza delle fasi del ciclo cellulare in condizioni standard di coltura. La Figura 2 mostra una selezione di analisi un'istantanea di cellule NALM6 corso di un periodo di 24 ore. Le cellule in fase S al tempo dell'impulso BrdU (cioè entro il cancello positiva BrdU in figura 1) progredito attraverso G 2 / M, con un picco di cellule in quella fase del ciclo cellulare essendo rilevata 10 ore dopo la BrdU pUlse. La percentuale di cellule BrdU marcate in fase S ha raggiunto il suo punto più basso 14 ore dopo l'impulso e quasi tutte le cellule era tornato a G 1 dopo 17 ore. Con 24 ore una parte delle cellule BrdU marcato era rientrato fase S come parte del loro ciclo cellulare accanto indica che le cellule in grado di completare un ciclo cellulare entro 24 ore, ma la maggior parte non era ancora entrato in una seconda tornata di replica, in linea con la nota 36 hr tempo di raddoppio di queste cellule.
Distribuzione del ciclo cellulare può essere ulteriormente perfezionato con l'inclusione di altri marker. Ad esempio, l'aggiunta di un anticorpo istone H3 fosforilata su Ser10 (un marcatore di cellule in mitosi) consente la discriminazione delle cellule in mitosi da quelli in G 2 (sinistra pannelli di figura 3).
Figura 3: Confermadel ciclo cellulare fase utilizzando i marcatori aggiuntivi. I pannelli superiori mostrano l'analisi del ciclo cellulare delle cellule dal cancello positiva BrdU come mostrato in Figura 1. Le cellule erano state incubate in presenza o assenza di 3 nM vincristina per 18 ore dopo l'impulso BrdU . L'analisi del ciclo cellulare è stata condotta come descritto nella Figura 2. I pannelli inferiori mostrano le stesse cellule del 7-AAD vs. istone H3 fosforilati su Ser10 dot plot. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Valutazione degli effetti dei farmaci sul ciclo cellulare
Agenti citotossici possono avere effetti profondi sui progressi del ciclo cellulare e può indurre la morte delle cellule. L'effetto dei farmaci sulla progressione del ciclo cellulare può essere valutata con l'aggiunta di farmaci di interesse a seguito dell'impulso BrdU. Sono mostrati due esempi. La prima era una situazione in cui l'induzione omorte cellulare f confuso l'analisi dei dati del ciclo cellulare (pannelli di destra della Figura 3). Cellule NALM6 erano stati esposti a 3 Nm vincristina per 18 ore dopo l'impulso BrdU. Le cellule si sono pensati per arrestare in mitosi come obiettivi vincristina microtubuli. Tuttavia l'analisi del ciclo cellulare suggerito che le cellule non avevano arrestato ma transitato a G 0/1 (Figura 3 Pannello superiore destra). L'aggiunta di un anticorpo di istone H3 fosforilata su Ser10 mostrato che le cellule non erano usciti mitosi (figura 3 in basso pannello di destra), pur avendo un contenuto di DNA ridotta. È probabile che il contenuto di DNA è stata ridotta perché le cellule erano apoptotiche e avevano iniziato a degradare loro DNA. Poiché le cellule iniziati apoptosis mentre nella mitosi (cioè con DNA 4N), appaiono come fase S o G 0/1 celle invece della tipica apoptotico sub-G 1 picco.
Figura 4:. Rilevamento del ciclo cellulare fase uccisione specifico I dot plots mostrano la percentuale di cellule positive BrdU rimanenti nella coltura 24 h dopo l'impulso BrdU. Le cellule erano state coltivate in presenza o assenza del solo veicolo (controllo), 1,5 o 16 mM RAD001 dalla fine dell'impulso BrdU. Il pannello in basso mostra la percentuale di cellule che erano BrdU positivo nel incubazione 24 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In un altro esempio, la Figura 4 mostra come in presenza di una bassa concentrazione di RAD001 (un inibitore mTOR) cellule sono state in grado di completare il ciclo cellulare, ma poi subito un ritardo o arresto in G 0/1. Una maggiore concentrazione di RAD001 cellule da TRA ampiamente prevenutansiting fino alla G 0/1. Importante sottolineare cellule in fase S (cioè BrdU positivi) sono stati mostrati a scomparire preferenzialmente dalla cultura in cui è stata aggiunta RAD001. Questo suggerisce che le cellule che passano attraverso G 2 / M sono più suscettibili alla morte cellulare da questo agente. 12
È anche possibile esaminare le risposte di cellule in particolari fasi del ciclo cellulare utilizzando anticorpi diretti contro antigeni specifici. Nella figura 5 l'attivazione del controllo del ciclo cellulare che controllano proteine Chk1 e Chk2 in risposta al trattamento vincristina è mostrato. Chk1 e Chk2 sono attivate da fosforilazione su Ser345 e Thr68 rispettivamente. Attivazione di Chk1 e Chk2 può essere visto in cellule che sembrano avere un contenuto 2N DNA ma come illustrato in Figura 5 sono suscettibili di essere cellule in mitosi che hanno iniziato la degradazione del DNA a causa dell'apoptosi.
È possibile aggiungere farmaci in vari momenti dopo laImpulso BrdU per esaminare l'effetto dell'agente su cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare.
Figura 5:. Rilevamento di modifiche per Celle in particolari fasi del ciclo cellulare Il pannello superiore mostra le cellule gated sulle cellule positive BrdU come in figura 1 a 7-AAD vs. fosforilata Chk1 (sinistra) o Chk2 (destra) dot plot. Le cellule erano state coltura per 18 ore dopo l'impulso di BrdU in presenza o assenza di 3 nM vincristina come per la Figura 3. I pannelli inferiori mostrano istogrammi sovrapposizione delle stesse cellule gated su entrambi frazione 2N o 4N come indicato. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La capacità di analizzare il ciclo cellulare è importante per la comprensione della biologia del cancro e il meccanismo di azione di entrambi i farmaci e geni che influenzano la proliferazione e la crescita cellulare. Mentre ci sono una moltitudine di saggi che misurano riferito proliferazione cellulare, la maggioranza solo fornire una misura che indica le cellule numerici presenti. Questi includono test che misurano il numero di cellulare per la visualizzazione diretta e il conteggio, l'attività metabolica o la concentrazione di ATP. Il vantaggio principale di molti di questi metodi è che sono relativamente facili da eseguire e suscettibili di formati micropiastre e automazione, che li rende utili per lo screening di un gran numero di condizioni o composti. Un inconveniente di molti di questi metodi è che la perdita di cellule a causa di morte non viene presa in considerazione, potrebbe condurre ad una sottostima della proliferazione cellulare. Anche questi metodi misurano la popolazione rinfusa e non permettono lo studio di singole cellule o di transito delle cellule attraversoil ciclo cellulare.
Dei saggi di proliferazione comunemente utilizzati, forse il più affidabili e precise sono quelli che misurano la sintesi del DNA. Tradizionali saggi di proliferazione cellulare incubare cellule per poche ore a notte con 3 H-timidina, che è incorporato nel DNA di nuova sintesi. 13 Il problema evidente con questo metodo è l'uso di materiali radioattivi, ma un'altra limitazione è che le misure di risultato della media proliferazione di una popolazione di cellule. BrdU può essere usato in modo simile senza i problemi di radiazione, anche se sono necessari ulteriori passaggi e BrdU è un potenziale mutageno. Tuttavia, BrdU ha il vantaggio di essere compatibile con citometria a flusso, permettendo l'analisi di cellule singole. 14 Altro citofluorimetria metodi compatibili per valutare proliferazione cellulare a livello di singola cellula includere un numero crescente di coloranti che etichetta la membrana cellulare o proteine cellulari ( ad esempio CFSE) che dividono tra daughtcellule er, coloranti intercalanti del DNA e ciclo cellulare rilevazione antigene specifico da anticorpi. Il meglio di coloranti etichettatura cella permette di seguire la divisione cellulare su un numero di divisioni cellulari. 15 Essi forniscono una misura diretta della proliferazione, anche se si ottiene alcuna informazione riguardo fase del ciclo cellulare o distribuzione. La misurazione del contenuto di DNA utilizzando DNA coloranti intercalanti come propidio ioduro o 7-AAD fornire un forte distribuzione del ciclo cellulare 16, ma non temporale dei dati. Anche con la valutazione di molteplici punti di tempo rimane impossibile valutare la durata del ciclo cellulare o specifiche fasi del ciclo cellulare. Antigeni specifici del ciclo cellulare possono essere utilizzati per valutare fase del ciclo cellulare in una popolazione di cellule non sincronizzato. Antigeni specifici del ciclo cellulare comunemente usati includono fasi M del ciclo cellulare Ki-67, 17 che si esprime negli S, G e 2, ma non durante G 0/1, PCNA (antigene nucleare della proliferazione cellulare) 18, e la fosforilazione di histone H3. 19 Mentre questi forniscono buoni dati relativi alla fase del ciclo cellulare, le informazioni riguardanti le dinamiche del ciclo cellulare che manca.
Ottenere i dati sulla dinamica del ciclo cellulare è stato tradizionalmente esaminate sincronizzando cellule utilizzando agenti o condizioni di coltura che bloccano la progressione del ciclo cellulare. Questo provoca un accumulo di cellule dietro il blocco, che, una volta rimosso, causare un'ondata di cellule progrediscono insieme attraverso il ciclo cellulare. 1 Il calcolo della durata del ciclo cellulare e la lunghezza delle varie fasi del ciclo cellulare è quindi possibile. Le cellule possono essere indotte a uscire ciclismo cella attiva entrando G 0 da deprivazione di siero. Alla nuova aggiunta del siero le cellule possono quindi muoversi insieme in fasi successive. 20 Mentre questo è un metodo affidabile per determinati tipi di cellule, altri, tra cui molti tipi di cellule trasformate, non riescono a uscire dal ciclo cellulare e spesso subiscono morte cellulare come risultato. 21 In effetti il nostro stumuore trovato questo per essere la situazione per cellule della leucemia linfoblastica acuta. Inoltre, le cellule saranno spesso non riescono a rientrare ciclo cellulare in modo sufficientemente sincronizzato. I metodi chimici possono essere utilizzati per indurre l'arresto del ciclo cellulare nelle fasi specifiche del ciclo cellulare. Ad esempio, gli agenti che impediscono la sintesi del DNA (ad esempio eccesso timidina) o prevenire la formazione del fuso mitotico (ad esempio nocodazole) cellule arresto nelle fasi S e M, rispettivamente, ma sono tossici e possono provocare disturbi della crescita e anche la morte in una parte significativa della cellule. 22 in tutte le cellule di questi metodi non sono riusciti ad arrestare la maggior parte delle cellule senza uccidere una frazione significativa. Considerando che lo scopo è stato quello di valutare gli effetti di un potenziale agente anti-leucemica sui parametri del ciclo cellulare, la morte cellulare derivante dalla sincronizzazione era inaccettabile. Nonostante la descrizione di un gran numero di metodi per sincronizzare le cellule, tutti hanno difetti. I problemi principali sono: un insufficientiarricchimento per cellule della parte desiderata del ciclo cellulare, disturbi al normale fisiologia del ciclo cellulare o, come osservato, eccesso di tossicità.
Il metodo qui descritto è una semplice estensione del sistema di impulsi utilizzata lungo, in cui le cellule sono incubate per un breve periodo con BrdU per identificare le cellule in fase S. Abbiamo trovato un 45 minuti di impulso per essere ottimale nel nostro sistema, ma i periodi di tempo più brevi possono essere utilizzati se si ottiene un'etichettatura adeguata. Continuando a cellule di coltura dopo la rimozione della BrdU è possibile monitorare la progressione attraverso il resto della fase S, G 2, la mitosi, G 1 e l'ingresso nel ciclo cella successiva. Può essere possibile seguire ulteriormente le cellule. Il vantaggio di questo sistema è che non vi sono prove di tossicità per le cellule nell'arco temporale di questi esperimenti e non vi è il minimo disturbo per la crescita delle cellule, come è richiesto solo un paio di modifiche di supporto. Le cellule sono tuttavia mantenuti in conticultura nua. Il flusso citometria natura basata del metodo significa che può essere combinato con l'identificazione di sottopopolazioni di cellule da superficie supplementare o colorazione intracellulare. Abbiamo usato anticorpi BrdU coniugato APC ma altri coniugati può essere sostituito per facilitare lo sviluppo di pannelli di anticorpi. Abbiamo usato 7-AAD anziché propidio ioduro perché 7-AAD reagisce in un unico canale opzioni per massimizzare multicolor colorazione. Analogamente DAPI o Hoechst possono essere usati come macchie DNA ma richiedono un laser UV. CV più rigide per la colorazione del DNA possono essere ottenuti utilizzando fissazione etanolo ma questo compromette spesso colorazione anticorpale, limitando le opzioni per superficie aggiuntiva o macchie citoplasmatici. Il più grande svantaggio è che S fase dura circa 8 ore, in modo da cellule marcate possono essere appena entrati o in procinto di uscire fase S durante il periodo di impulso. Come risultato, la sincronizzazione non è così stretto come con altri sistemi. Tuttavia, combinando l'etichettatura BrdU con coloranti indicano DNAil contenuto e gli anticorpi alle proteine dipendenti del ciclo cellulare specifico, i dati forti possono essere ottenuti.
Al fine di ottenere dati coerenti è importante garantire che le cellule sono alla concentrazione corretta e che la concentrazione cellulare è coerente in confrontati tutte le condizioni. Criticamente la luminosità della colorazione 7-AAD è molto sensibile alla concentrazione cellulare. L'utilizzo di un sistema di conteggio delle cellule automatizzato può aiutare a garantire che le concentrazioni di cellule siano coerenti in tutti i campioni in ogni fase del processo. Un altro aspetto importante è la lunghezza del tempo le cellule sono esposte a BrdU. Piccole variazioni possono traducono in notevoli differenze, quindi è importante che tutti i campioni vengono incubati con BrdU per esattamente lo stesso tempo. Infine, è importante per titolare anticorpi avere colorazione ottimale e questo dovrebbe essere ripetuta ogni volta che un lotto viene modificata. Se tutti i passi sono seguiti costantemente e le concentrazioni di cellule mantenute costanti allora questo method modo affidabile permettere il tracciamento delle cellule attraverso il ciclo cellulare senza la necessità di sincronizzazione. C'è anche un notevole margine di modificare questo metodo per soddisfare particolari tipi di cellule e affrontare questioni specifiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
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