Summary
Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.
Introduction
hücre döngüsü ilerlemesi sırasında hücre döngüsü özellikleri ve hücrelerde meydana gelen değişikliklerin değerlendirilmesi biyolojisi, özellikle kanser biyolojisi birçok yönünü anlamak için esastır. Malignitelerin tedavisi için geliştirilmesinde bir çok madde, hücre döngüsü ilerlemesi üzerinde derin etkilere sahip ya da hücre devre bağımlı-mekanizmalar yoluyla hücre ölümüne neden olmaktadır. Hücre döngüsünün belirli fazında hücre döngüsü dinamikleri veya hücreleri incelemek için, bu hücrelerin senkronize olağandır. Ancak senkronizasyon yöntemleri potansiyel sonuçlar elde karıştırıcı, çalışılan hücreleri üzerinde zararlı etkileri olabilir. 1 zamanla tek hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin son hücrelerin döngüsünün belirli aşamalarında sadece mevcut floresan isim levhası proteinlerin kullanılmasına izin var analizi 2, bununla birlikte, bu hücreler, genetik olarak okunabilir sistemlere kullanımlarını sınırlayan, bu etiketlenmiş proteinlerin sentezlenmesi için manipüle edilmesi ihtiyacı incelenecekily elde etti.
(S) faz DNA çoğaltılır ve mitoz (M) burada hücre bölünmesi gerçekleşir: hücre döngüsü, iki aktif aşamadan oluşmaktadır. Bu fazlar, üç boşluk fazlar, G 0, G1 ve G2 ile ayrılır. Hücreler boyutu önceden hücre büyümesi DNA replikasyonu tamamlanması arasındaki fakat hücre bölünmesi öncesinde devam DNA replikasyonu ve G 2 artırmak nerede G 0 ya da sessizlik, hücre döngüsünü terk etti bir dinlenme aşamasıdır, G 1'dir. hücre döngüsü yoluyla ilerleme kontrol noktaları bir dizi tarafından kontrol edilir. Çevre koşulları, DNA sentezinin destekleyici değildir ve S fazına girişi önler G 1 kapısı aktive edilir. içi S fazı kapısı veya gecikme durdu çoğaltma çatal yol açabilir DNA hasarı ile tetiklenebilir. Hasar G 2 sonra tespit edilirse G 2 Sırasında çoğaltılan DNA sadakat onaylanır ve 3 aktivasyonu yaygın hücre popülasyonlarının eşitlemek için kullanılır. Hücre döngüsü kontrol noktası, bir dizi faktöre göre ancak en yaygın DNA hasarının tespiti, Kanser biyolojisinde etkinleştirilebilir. DNA hasar cevabı (ATR) ile ilgili PI3-kinaz benzeri kinazlar ataksi telenjiektazi ve RAD3 tarafından başlatılan ve ataksi telenjiektazi (ATM) sırasıyla aşağı efektör kinazları CHK1 ve Chk2 aktive olduğu mutasyona uğramış. 3 olaylar bir dizi durdu dahil CHK1 aktive çoğaltma çatal, DNA çapraz bağlarının ve ultraviyole radyasyon hasarı Chk2 öncelikle çift iplikli kırılmalara tarafından aktive ediliyor.
hücre döngüsü i uzunluğuna değiştirilmiş koşullarının etkisini incelemek için her zamanki yöntemis hücre döngüsü belirli bir aşamasında hücreleri senkronize etmek. 1. Bu çeşitli yöntemler ile elde edilebilir. Hücreler fiziksel boyutu, yoğunluk, yan dağılım (parçalı) ve hücre yüzey ifadesi belirteçleri dayalı ayrıştırılır edilebilir. Daha pratik hücreleri kimyasal yollarla senkronize edilebilir. Örneğin timidin, hidroksiüre ve sitosin arabinosid gibi çeşitli ajanlar ajanlar çıkarıldıktan sonra bisiklet devam S fazında hücrelerin birikimiyle sonuçlanır hücre döngüsünün S fazında DNA sentezini inhibe etmek için de kullanılabilir. Veya M-fazı DNA içeriğinin - Hücreler G 2 mitotik iğ oluşumunu tutuklama önler nokodazolun ile işlemden geçirildi. G 0 aşamasında hücrelerin birikimi kültür ortamı sonuçlarından serum ortadan kaldırılması. kültür, serum içindeki besinlerin yeniden eklenmesi hücrelerinin normal bisiklet yeniden başlatır. Ancak, bu senkronizasyon yöntemlerinin tüm hücrelerin normal bisiklet ve büyüme ile müdahale ve resul edebilirsinizönemli bir hücre ölümü t.
Akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin Senkronizasyon özellikle zor olduğu ve bu hücreler genetik manipülasyon için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntem, hücre döngüsü dinamiklerinin değerlendirme ve geleneksel senkronizasyon veya genetik değişiklik yapılmadan hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücreleri çalışmasına izin verir. Bu yöntem, aynı zamanda genetik modifikasyon ve geleneksel senkronizasyon işlemleri kolayca elde olmayan diğer hücre türleri için yararlı olabilir. yöntem hücrelerin kısa vadeli büyüme ve çoğalması üzerinde çok az etkiye sahiptir bromodeoksiüridin (BrdU) Kuruluş, uzun kurulan kullanımına dayanmaktadır. 4 Kuruldu BrdU protokolleri S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine BrdU dahil yararlanmak . Bu kalıcı BrdU maruziyeti sırasında S fazında yapılmış olan olarak hücreleri işaretler. Bu popülasyon BrdU incorpor için boyama daha sonra zaman noktalarında tespit edilebilirtirme ve böylece takip ve hücre döngüsü transit uyuşturucu etkileri çalışma izin zamanla değerlendirilebilir senkronize nüfus olarak hareket ederler. BrdU genellikle DNase veya asit tedaviden sonra elde önce antikor boyama maruz kalması gerekir. 6,7 dahil BrdU ek markörler dahil sağlayan tespit etmek için akış sitometrisi kullanılarak. En önemli çalışma başlangıcında S fazında olan hücrelerin, hücre döngüsü faz dağılımının değerlendirilmesini sağlayan DNA içeriğini ölçmek için boyalar kullanılmasıdır. 8 Ayrıca ek yüzey ya da hücre içi antijenler de incelenebilir. 9 Bu Böyle Ki67 gibi hücre döngüsü olaylarla ilgili ya da bölünmüş kaspaz-3 gibi apoptoz belirteçlerinin olarak görünüşte ilgisiz hücre özellikleri olabilir. potansiyel uygulamalar araştırmacı hayal gücü ile sınırlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan protokol, akut lenfoblastik lösemi hücre çizgisi NALM6 kullanır, ancak diğer hücre tiplerine uygulanabilir.
1. Çözümler ve Reaktifler
- Tam RPMI
- 56 ml cenin buzağı serumu (FCS) ve RPMI-1640 ortam içinde 500 ml'lik bir şişeye 5.5 mi, 200 mM L-glutamin ekleyin.
- BrdU Stok Çözümü
- Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 32.5 mM BrdU (10 mg / ml) hazırlayın.
- BrdU tam RPMI
- Tam RPMI 10 ml BrdU stok çözeltisi 6.2 ul ekleyin.
- DNaz Çözümü
- 1 mg Dnaz / DPBS ml hazırlayın.
- Lekeleme tampon maddesi
- DPBS içinde% 3 ısı ile inaktive edilmiş FCS ve% 0.09 sodyum azit hazırlayın.
- Sabitleme Buffer, Permeabilization Tampon ve Yıkama Tamponu tanımları için malzemeler Listesine bakınız.
2. Hücreler
Hayırte: Hücreler 6 aydan fazla süre ile kültüre değildi. Bu yöntem, hücre yoğunluğu ve kültür ortamına ayarlamaları ile herhangi bir bitişik olmayan hücre hattına doğrudan uyarlanabilir. Deneyin başlangıcında katlanarak büyüyen hücreler kullanın.
- Tam RPMI içinde, T-75 kültür şişelerinde NALM6 hücreleri korumak. Bir Sınıf II Biyogüvenlik Kabini kullanarak steril şartlar altında tüm adımları uygulayın.
- Haftada üç kez kültürü bölerek ml başına 6 10 x 1-2 arasındaki hücreleri NALM6 hücreleri korumak.
- Havadaki CO2,% 5 37 ° C'de inkübe edilir.
BrdU Hücre 3. Darbe Etiketleme
DİKKAT: potansiyel bir mutajen ve teratojen olduğu gibi özenle BrdU kullanın.
- 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüje hücreleri. Not: Taze ortama aktarılması hücrelerin sonuçların tekrarlanabilirliği geliştirir.
- 2 x 10 6 c Komple RPMI bir hücre sayımı ve tekrar süspansiyon hücreleri gerçekleştirinarşın / ml olmuştur.
- BrdU tam RPMI 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir nihai hücre konsantrasyonu üreten 2 hücreleri: 1 seyreltin.
- Daha sonra tam RPMI ile 10 hücreleri: 1 seyreltin, 45 dakika boyunca% 5 CO2 37 ° C'de inkübe edilir. Dikkatle 150 5 dakika boyunca xg ve Santrifüj hücreleri süpernatant tüm atın.
- Tam RPMI küçük bir hacme (~ 100 ul) içinde süspanse edin hücreleri, bir hücre sayımı yapar ve 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlanır.
- Pipet 48 çukurlu bir levhanın çukurlarına içine hücre 1 mi. Herhangi bir işgal edilmemiş kuyulara DPBS pipetle 1 ml daha yeniden üretilebilir sonuçlar elde edilmiştir.
- 17 Burada arzu edilen zaman noktalarında, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 için hava içinde% 5 37 ° C'de CO2 inkübe , 18, 19, 20, 21, 22, 23 ve 24 saat. Not: süre deneysel tasarım ölçmeyi amaçlamaktadır ne bağlıdır.
- Bir pipet kullanarak FACS tüpler içine tüm hücreleri aktarın. 1 mi VOLU iyi bir sekans durulayın5 ml'lik bir nihai toplam hacim PBS mes.
- 5 dakika boyunca 150 xg'de Santrifüj ve dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak. Hücreler, boyama için hazır hemen bu (bölüm 4) gerçekleştirin.
4. Hücre Boyama
Not: hücre yüzeyi boyaması gerekli ise hücreler boyunca 4 ° C'de tutulmasını sağlamak, tespit öncesinde bunu gerçekleştirmek.
- Lekeleme tampon maddesi içinde 100 ul içinde süspanse hücreleri (isteğe bağlı yüzeyi boyama, antijenleri yüzey ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübasyona antikorun önerilen hacim kazandırmak).
- 150 x g'de 5 dakika boyunca boyama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır.
Not: vs. özel antikor, konsantrasyon, kuluçkalama süresi spesifik deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. - Tespit ve Permeabilization
- Sabitleme tampon 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- 1 ml o eklemef yıkama tamponu, 150 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj ve süpernatant atın.
- Permeabilizasyon tampon maddesi içinde 100 ul hücrelerin tekrar ve buz üzerinde 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin.
- 150 x g'de 5 dakika boyunca yıkama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır.
- Tüp başına sabitleme tampon 100 ul hücre yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- 150 x g'de 5 dakika boyunca yıkama tamponu 1 ml santrifüj ekleyin ve süpernatant atılır.
Not: Gerekirse protokol burada durdurulmuş olabilir. lekeleme tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmış, eğer sabit hücreler 4 ° C 'de pek çok gün boyunca stabildir. Devam etmeden önce santrifüj aşağıdaki boyama tamponu çıkarın.
- DNaz Tedavi
- DNaz çözeltisi 100 ul (30 DNase / 10 6 hücre ug) ve 37 ° C'de 1 saat boyunca hücrelerin inkübe yeniden süspanse hücreleri.
- 5 dakika boyunca 150 xg'de yıkama tamponu, santrifüj 1 ml ekleyin ve süpernatant atın.
- Antikor Boyama
Not: BrdU dışındaki hücre içi belirteçler için boyama BrdU boyama ile eş zamanlı olarak yapılabilir.- ÖNEMLİ: Her bir florokrom etiketli lekesiz hücreleri ve hücrelerin oluşturduğu tazminat kontrolleri hazırlayın. İdeal olarak, deney tüpleri kullanılanlar gibi dengeleme kontrol için aynı antikorları kullanır. Bu mümkün değilse Ancak, son derece ifade antijenlere karşı antikorlar yerine aynı florokromu konjuge.
- Yıkama tamponu, 50 ul hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 ul / BrdU antikoru 10 6 hücre ekleyin. Not: diğer spesifik hücre içi antijenlere karşı doğrudan konjüge edilmiş antikorlar da ilave edilebilir.
NOT:. Cdc2 için Ser10 üzerinde fosforile histon H3 antikorlar G2 ve M hücreleri arasında ayrım yapmak için kullanılabilir, histon H3 mitoz sırasında Ser10 üzerinde fosforlaştırılır 10 antikorlar, hav hücreleri tespit etmek için kullanılabilir Tyr15 ilgili fosforileE mitoz kararlıdır. 11 - Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- 5 dakika boyunca 150 x g'de 1 yıkama tampon maddesinin ml'si santrifüj hücreleri ekleyin ve süpernatant atılır.
- Hücre Döngüsü Analizi için Leke DNA
- Pelet gevşetin ve 7-AAD çözeltisi (0.25 mcg) 20 ul ekleyin. Not: 7-AAD / hücre sabit bir miktarda kullanımı için çok önemlidir.
- Lekeleme tampon maddesi içinde 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
Sitometrisi Verilerin 5. Koleksiyonu
Not: Kullanılan fluorochromes sayısı ve niteliğine bağlı olacaktır gerekli makine.
- Aşağıdaki parametreler toplamak: FSC A, SSC-A, FSC lH doğrusal bir ölçek üzerinde ve 7-AAD floresan (FSC W yerine FSC H kullanılabilir). Bir günlük ölçeğinde APC kanalı toplayın. Bir günlük ölçeği kullanılarak yüzey veya iç etiket değerlendirilmesi için gerekli herhangi bir ek kanallar toplayın.
- Com gerçekleştirinörnekleri analiz etmeden önce farklı fluorochromes arasında gözlenen emisyon spektrumları sinyalleri örtüşen Telafisi. Not: Çoğu akış sitometrelerinde otomatik olarak gerçekleştirecektir.
- Her bir numune için en azından 10,000 olayları toplayın.
Sitometrisi Verilerin 6. Analizi
Not: Veri analizi, ancak diğer yazılım paketleri de kullanılabilir sitometri FlowJo akışı için bu çalışmada kullanılmıştır. Ayırıcı stratejisi, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
- FSC-A ve SSC-A parametreleri kullanılarak canlı hücre popülasyonu tanımlayın.
- Bu nüfus içinde çiftleri ve (burada da kullanılabilir FSC-W) FSC-A ve FSC-H kullanılarak agrega dahil değildir.
- Bu nüfusun içinde y ekseni üzerinde x-ekseni ve BrdU-APC 7-AAD kullanarak nokta arsa ayarlayın.
Şekil 1: Yolluk Strateji Sol pa.nel: ungated hücreler SSC-A nokta arsa vs FCS-A gösterilir. canlı hücre popülasyonu gösterilen kapısı ile tanımlanır. Merkez paneli: sol panelden Geçitli hücreler FSC-H nokta arsa (yerine yüksekliği kullanılabilir FSC-W) vs FSC-A gösterilir. Ikilileri ve agrega tespit ve gösterilen kapısı ile dışlanır. Sağ paneli: orta panelinde ikili dışlama tarihinden itibaren Geçitli hücreler APC-bir nokta arsa vs 7-AAD gösterilir. BrdU antikoru APC darbe etiketleme sırasında BrdU dahil hücrelerin tanımlanmasına imkân ile etiketlenir. 7-AAD DNA içeriği hakkında bilgi verir. Üst geçit BrdU darbe, sol alt kapısı, hücrelerde G 0/1 ve G olanlar sağ alt geçidin zamanında S fazında nedenle BrdU pozitif ve hücreleri tanımlar / M 2. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.- Hücre Döngüsü A nalysis
- Ikili dışlama kapısı hücreler üzerinde ilk veri dosyası ve kapıyı açın.
- (Flojo yazılımında platformlarda altında bulunur) hücre döngüsü dağıtımı için bu nüfusu analiz ve Dean-Jett-Fox modeli kullanın.
- G 0/1 ve G kapıları oluşturmak kullanarak 2 / M zirveleri konumlarını edinin.
- BrdU pozitif hücrelerin ve konuyla ilgili Kapısı aynı hücre döngüsü analizi bu nüfus.
- Oluşturmak kapıları aynı kapıları uygulanması ve G 0/1 ve G 2 / M zirveleri pozisyonları için (yaratılmış kapıları kullanarak) kısıtlamaları ayarlayarak G 0/1 ve G 2 / M zirveleri için pozisyonları sağlayın. Bu durum, Şekil 2'nin birinci 2 panel gösterilmiştir.
Not: Diğer yazılım aynı zamanda verileri analiz etmek için kullanılabilir ve talimatlar buna göre değişecektir.
840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Şekil 2:. Hücre Döngüsü İlerleme ilk panel (Tüm Hücreler) ikili dışlama kapısı tarafından tanımlanan hücre popülasyonu üzerinde işlenir. Bu popülasyon, X ekseni üzerindeki 7-AAD içeren bir histogramda gösterilen edildi. G 0/1 pikin tepe ekseninin altında bir okla gösterilir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi daha sonra paneller BrdU pozitif hücreler kapılanmış edilmiştir. Çiftler dışlama kapısının yolluk elde edilen G 0/1 pozisyonda değeri FlowJo hücre döngüsü yazılım içinde BrdU pozitif kapılanmış hücrelerin uygulanır. Şekil 1, ilk iki panel de gösterildiği gibi, tüm nüfus analizinde elde edilen değere göre G 0/1 tepe pozisyonda gösterildiği gibi, her bir takip eden paneli BrdU pozitif popülasyonu üzerinde geçirilen edildi. Aynı samp BrdU pozitif hücrelerin G 0/1 nüfus yerini belirlemek için BrdU negatif kısmını kullanmale örnekler arasındaki DNA leke yoğunluğunda herhangi küçük farklılıklar için kontrol eder. Her panelde gösterilen numara BrdU darbe sona ermesinden bu yana zamanı temsil eder. Hesaplanan hücre döngüsü fazları gölgeli yeşil gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, bir dizi bilgi elde etmek için kullanılabilir. Birkaç uygulamalar burada özetlenmiştir.
Hücre döngüsü süresinin değerlendirilmesi
Hücre döngüsü yoluyla transit hücreleri için gerekli süreyi belirlemek için, hücreler BrdU darbe sonra çeşitli zaman noktalarında toplanır. değerlendirmeler arasındaki aralıklar analiz edilmekte olan özel hücrelere uyarlanabilir. Hematopoietik hücre hatları, standart kültür koşulları altında, hücre döngüsü fazlarına uzunluğunu belirlemek için herhangi bir ilaç tedavisi olmaksızın, 24 saatlik bir süre boyunca her saat değerlendirildi. 2, 24 saatlik bir süre boyunca NALM6 hücrelerinin anlık analizinin bir seçimi göstermektedir. BrdU p sonra 10 saat tespit (örneğin, Şekil 1 'de BrdU pozitif kapısı içinde) BrdU vuruş süresinde, S fazında hücre olan hücre döngüsünün bu evresinde hücreleri olan bir tepe, G 2 / M yoluyla ilerlemeulse. S fazında BrdU etiketli hücrelerin oranı darbesi sonra nadir 14 saat ulaştı ve hemen hemen tüm hücrelerin 17 saat sonra, 1 g döndü. 24 saat BrdU etiketli hücrelerin bir kısmının ancak çoğu henüz 36 bilinen tutarlı replikasyon ikinci tur girilen olmasaydı hücreler, 24 saat içinde bir hücre döngüsünü tamamlamak olduğunu belirten sonraki hücre döngüsünün bir parçası olarak S fazına reentered vardı Bu hücreler için ikiye katlanma süresinde saat.
Hücre döngüsü dağılımı ayrıca ilave belirteçleri dahil edilmesi ile rafine edilebilir. Örneğin, Ser10 üzerinde fosforile histon H3 (mitozda hücre işaretleme) bir antikorunun ilavesi G 2 olanlardan mitozda hücre ayrımı izin verir (Şekil 3'ün sol paneller).
Şekil 3: OnayHücre döngüsü aşaması ek markörler kullanılarak., Şekil 1 'de gösterildiği gibi üst panel BrdU pozitif kapısı hücrelerinin hücre döngüsü analizi gösterir. Hücreler BrdU darbe sonrası 18 saat 3 nM vinkristin varlığında veya yokluğunda inkübe edilmiştir . Şekil 2'de açıklandığı gibi hücre döngüsü analizi yapılmıştır. Alt paneller Ser10 nokta arsa üzerinde fosforile histon H3 vs 7-AAD aynı hücreleri göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hücre Döngüsü Uyuşturucu Etkileri Değerlendirilmesi
Sitotoksik ajanlar hücre döngüsü ilerleme üzerinde derin etkileri olabilir ve hücre ölümüne neden olabilir. hücre döngüsü ilerlemesi üzerindeki ilaç etkileri BrdU darbesinin, aşağıdaki ilgi konusu ilacın eklenmesi ile değerlendirilebilir. İki örnek gösterilmektedir. İlk durum nerede indüksiyon of hücre ölümü, hücre döngüsü verilerinin analizi (Şekil 3 sağ paneller) şaşırmış. NALM6 hücreleri BrdU darbe sonrası 18 saat süre ile 3 nM vinkristin maruz kalmış. Hücreler vinkristin hedefleri mikrotübüllerin olarak mitoz içinde tutuklama bekleniyordu. Ancak hücre döngüsü analizi hücreleri tutuklandı ama G 0/1 (Şekil 3 sağ üst panel) aracılığıyla transit olmadığını öne sürdü. Ser10 üzerinde fosforile histon H3 bir antikorunun ilavesi hücreleri azaltılmış DNA muhtevasına sahip olmasına rağmen, mitoz (Şekil 3, alt sağ panel) çıkıldı olmadığını göstermiştir. Bu DNA içeriği hücreleri apoptozise ve bunların DNA'yı başlamıştır çünkü azalmış olması muhtemeldir. Mitoz (yani 4N DNA ile) olarak, S fazı veya yerine tipik apoptotik alt G 1 tepe G 0/1 hücreleri gibi görünen ise hücreler apoptoz başlatılan beri.
Şekil 4:. Hücre Döngüsü Sahne Özgül Killing Algılama nokta araziler BrdU darbe sonrası kültür 24 saat kalan BrdU pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Hücreler, 1.5 ya da 16 uM RAD001 BrdU darbe sonundan itibaren varlığında veya tek başına araç yokluğunda (kontrol) içinde kültive edilmiştir. Alt panel 24 saat inkübasyon üzerinde BrdU pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Başka bir örnekte, Şekil 4, RAD001 (bir mTOR inhibitörü), hücrelerin düşük bir konsantrasyonunun mevcudiyetinde hücre döngüsünü tamamlamak mümkün ama G 0/1 bir gecikme ya da hapsine uğradılar gösterir. RAD001 daha yüksek bir konsantrasyonu büyük ölçüde tra hücreleri engellenirG 0/1 kadar nsiting. S fazında Önemli hücreleri (örneğin, BrdU pozitif) RAD001 ilave edilmediği zaman, tercihen kültürden yok gösterildi. Bu G 2 / M geçerek hücreler bu ajan tarafından hücre ölümüne karşı daha duyarlı olduğunu gösteriyor. 12
Bu, belirli antijenlere karşı antikorlar kullanılarak, hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücreleri yanıtları incelemek mümkündür. Şekil 5 vinkristin tedaviye yanıt olarak proteinler CHK1 ve Chk2 kontrol Hücre döngüsü kontrol nokta aktivasyonu gösterilmiştir. CHK1 ve Chk2 sırasıyla Ser345 ve Thr68 üzerinde fosforilasyon ile aktive edilir. CHK1 ve Chk2 aktivasyonu 2N DNA muhtevasına sahip gibi görünmektedir hücrelerde görülebilir fakat Şekil 5 'de gösterildiği gibi apoptoz sonucu DNA bozunmasını başlamış mitozda hücre olması muhtemeldir.
Bu sonra çeşitli zaman noktalarında ilaçları eklemek mümkündürBrdU darbe hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında hücreleri üzerinde ajanın etkisini incelemek.
Şekil 5:., Belirli bir hücre döngüsü fazlarına hücrelere Değişikliklerin Algılama üst panel genel fosforile CHK1 (sol) veya Chk2 (sağ) nokta araziler 7-AAD, Şekil 1 'deki gibi BrdU pozitif hücrelerin üzerinde geçirilen hücreler gösterilmiştir. Hücreler Şekil 3 için olduğu gibi 3 nM vinkristin varlığında veya yokluğunda BrdU darbe sonra 18 saat süre ile kültür olmuştur. Alt paneller gösterildiği gibi 2N veya 4N fraksiyonu ya da üzerinde kapı aynı hücrelerin katlamalı histogramlarını gösterir. Burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre döngüsü analiz yeteneği kanseri biyoloji anlaşılması ve hücre çoğalmasını ve büyümesini etkileyen iki ilaç ve gen hareket mekanizması için çok önemlidir. Bildirildi hücre çoğalmasını ölçmek deneylerinde bir sayıda olsa da, çoğunluğu sadece Halen mevcut hücreleri gösteren bir ölçü sağlar. Bu doğrudan görselleştirme ve sayma, metabolik aktivite veya ATP konsantrasyonu ile hücre sayısını ölçmek deneyleri içermektedir. Bu yöntemlerin çoğu temel avantajı, koşullar ya da bileşikler, çok sayıda taranması için faydalı hale, mikro biçimleri ve otomasyon nispeten uygulaması kolay ve müsait olmasıdır. Bu yöntemlerin çoğu bir eksiklik ölüm nedeniyle hücre kaybı, potansiyel hücre çoğalmasının tahminlerin yol dikkate alınmaz olmasıdır. Ayrıca bu yöntemler, yığın nüfus ölçer ve tek hücre çalışma ya da hücre geçiş yoluyla izin vermemektedirHücre döngüsü.
Belki de en güvenilir ve doğru yaygın olarak kullanılan çoğalma deneyleri, DNA sentezi ölçümü olanlardır. Geleneksel hücre çoğalma tahlilleri, birkaç saat boyunca yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilen, 3H-timidin ile. 13, bu yöntem ile belirgin bir sorun radyoaktif maddelerin kullanılması da hücreleri inkübe, ancak başka bir sınırlama sonucu ölçümleri ortalama olduğu bir hücre popülasyonunun çoğalması. Ek adımlar gereklidir, ancak BrdU Benzer radyasyon sorunları olmadan kullanılabilir ve BrdU potansiyel mutajen. Bununla birlikte, BrdU tek hücre analizine izin, akış sitometrisi ile uyumlu olma avantajına sahiptir. Tek hücre düzeyinde hücre çoğalmasını değerlendirmek için uygun yöntemler sitometri 14 diğer akış (hücre membran veya hücre proteinlerini etiket boyalar artan sayısını içerir kız çocuğu arasında bölmek gibi KAKE)er hücreleri, DNA intercalating boyalar ve antikorlar ile hücre döngüsü spesifik antijen saptama. Hücre etiketleme boyaların en iyi hücre bölünmeleri bir dizi üzerinden hücre bölünmesi izleme izin verir. 15 hücre döngüsü aşaması veya dağıtım hakkında hiçbir bilgi elde olmasına rağmen onlar, çoğalması doğrudan ölçümünü sağlamaktadır. Böyle propidium iyodür veya 7-AAD güçlü hücre döngüsü dağılımı 16 sağlar, ancak zamansal değil, veri olarak DNA interkalasyon boyalar kullanılarak DNA içeriğinin ölçülmesi. Hatta birden fazla zaman noktalarının değerlendirilmesi ile hücre döngüsü veya belirli hücre döngüsü aşamalarında uzunluğunu belirlemek imkansız kalır. Hücre devre özel antijenler eşitlenmemiş hücresi popülasyonunda hücre döngüsü faz değerlendirmek için de kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan, hücre döngüsü spesifik antijenler, S sırasında ifade edilebilir Ki-67, 17, G2 ve hücre döngüsüne ait M evrelerini kapsamamaktadır G 0/1 PCNA (prolifere edici hücre nükleer antijen) 18, ve h fosforilasyondaistone H3. Bu olsa 19 eksik hücre döngüsü dinamikleri ile ilgili iyi hücre döngüsü aşaması ile ilgili veri, bilgi sağlamaktadır.
Hücre döngüsü dinamiklerine Elde veri geleneksel maddeleri ya da hücre döngüsü ilerlemesini bloke kültür koşulları kullanılarak hücrelerin eşitleyerek incelenmiştir. Bu bir kez hücre döngüsü yoluyla birlikte ilerleyen hücreleri dalga neden çıkarıldı blok arkasında hücrelerin bir birikimine neden olur. 1 hücre döngüsü süresi ve değişik hücre döngüsü fazlarına uzunluğunun hesaplanması mümkün olmaktadır. Hücreler, serum yoksunluğu G 0 giren aktif hücre bisiklet çıkmak için teşvik edilebilir. Bu, pek çok dönüştürülmüş hücre türleri de dahil olmak üzere, belirli hücre tipleri, diğerleri için güvenilir bir yöntem olmakla birlikte, serum yeniden ilavesi üzerine hücreler daha sonra, hücre döngüsü çıkmak için başarısız. Müteakip fazlar bir araya 20 hareket edebilir ve sık sık bir hücre ölümünü mü Nitekim sonuç. 21 bizim stubu Bulunan ölür akut lenfoblastik lösemi hücreleri için durum olması. Ayrıca, hücreler genellikle yeterince senkronize bir şekilde hücre döngüsünü yeniden girmek için başarısız olur. Kimyasal yöntemler, hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücre döngüsü durdurulmasını sağlamak için de kullanılabilir. Örneğin, ajanlar DNA sentezini (örneğin aşırı timidin) engelleyen veya sırasıyla (örn nokodazolun) S ve M fazlarında tutuklama hücreleri mitotik iğ oluşumunu engellemek, ancak toksik ve önemli bir oranda hatta ölümle büyüme bozuklukları ve neden olabilir Hücreler. ALL hücrelerinin 22, bu yöntemler, önemli bir kısmını öldürmeden hücrelerin çoğunluğu tutuklamamış. Amaç hücre döngüsü parametreleri üzerinde potansiyel bir anti-lösemi maddesinin etkilerini değerlendirmek için olduğunu düşünüyor, senkronizasyon kaynaklanan hücre ölümü kabul edilemez. Yöntem çok sayıda açıklama hücrelerinin eş rağmen, tüm eksiklikleri vardır. başlıca sorunlar şunlardır: yetersizhücre döngüsünün istenen bölümünde hücreler için zenginleştirme, gözlenen aşırı toksisite, normal hücre döngüsünün fizyolojisinin ve e bozuklukları.
Burada tarif edilen yöntem, burada hücreler S fazında hücreleri tanımlamak için BrdU ile kısa bir süre için inkübe edilir uzun zamandır kullanılan puls sistemi, basit bir uzantısıdır. Bizim sistemde optimum ama yeterli etiketleme elde edilirse kısa süreler kullanılabilir olması için bir 45 dakika nabız bulundu. BrdU çıkarılmasından sonra kültür hücreleri devam ederek bir sonraki hücre döngüsü içine S fazı, G2, mitoz, G 1 ve giriş geri kalanı boyunca da ilerlemesini izlemek mümkündür. Bundan başka, hücrelerin takip etmek de mümkün olabilir. Bu sistemin avantajı, bu deneylerin bir zaman dilimi içinde hücrelere toksisite kanıtı yoktur ve ortam değişiklikleri sadece birkaç gerekli olduğu gibi hücrelerin büyümesi için en az bozulma olmasıdır. Hücreler aksi kıta tutulurvam eden kültür. yöntemin temel doğası akış sitometrisi ek yüzey ya da hücre içi boyama ile hücre alt tanımlanması ile kombine edilebilir olduğu anlamına gelir. Biz APC konjuge BrdU antikorlar kullanılır ama diğer konjugatlar antikor panellerin gelişimi kolaylaştırmak için ikame edilebilir. 7-AAD renkli boyama seçeneklerini maksimize tek kanalda fluoresces çünkü propidium iyodür yerine 7-AAD kullanılır. Benzer DAPI veya Hoechst DNA lekeleri olarak kullanılan ancak UV lazer gerektiren edilebilir. DNA boyama Sıkı özgeçmişler etanol fiksasyonu kullanılarak elde edilebilir ama bu sık sık ek yüzey veya sitoplazmik lekeler için seçenekler sınırlayıcı, antikor boyama ödün. En büyük dezavantajı faz yaklaşık 8 saat, yani etiketli hücreler sadece girilen veya darbe döneminde S fazına çıkmak üzere olabilir sürer S olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, senkronizasyon başka sistemlerle olduğu kadar sıkı değildir. Bununla birlikte, DNA gösteren boyalarla BrdU etiketleme birleştirerekspesifik hücre devre bağımlı protein içeriği ve antikorlar, güçlü veri elde edilebilir.
Tutarlı veriler elde etmek için hücrelerin doğru konsantrasyonda ve her koşul karşılaştırılan arasında hücre konsantrasyonu tutarlı olduğundan emin olmak için önemlidir. Kritik 7-AAD boyama parlaklığı hücre konsantrasyonu çok hassastır. Otomatik hücre sayım sistemi kullanılarak hücre konsantrasyonları süreçte her aşamada tüm örneklerde tutarlı olmasını sağlamak yardımcı olabilir. Başka bir önemli nokta hücreleri BrdU maruz kaldığı süreyi uzunluğudur. Küçük farklılıklar önemli farklar çevirebilirsiniz, böylece tüm örneklerin tam olarak aynı süre BrdU ile inkübe olması önemlidir. Son olarak, optimal boyama elde etmek için antikorlar titre önemlidir ve bir toplu değiştiğinde bu tekrar edilmelidir. Tüm adımları sürekli takip edilmekte ve hücre konsantrasyonları bu meto sonra sabit tutulur ised güvenilir senkronizasyon için gerek kalmadan hücre döngüsü boyunca hücre takibini sağlayacaktır. Özellikle hücre tiplerine uygun ve spesifik soruları yanıtlamak için bu yöntemi değiştirmek için önemli kapsamı da vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
