Summary
Denne protokollen beskriver bruken av bromdeoksyuridin (BrdU) opptak for å tillate den temporale sporing av celler som var i S-fasen ved et bestemt tidspunkt. Tilsetning av DNA-fargestoffer og antistoffmerking muliggjør detaljert analyse av skjebnen til S-fasen cellene på senere tidspunkt.
Introduction
Vurderingen av cellesyklus og endringer som oppstår i cellene under cellesyklusprogresjon er grunnleggende for å forstå mange aspekter av biologi, spesielt kreft biologi. Mange midler under utvikling for behandling av maligniteter ha betydelig effekt på cellesyklusprogresjon eller indusere celledød via cellesyklusavhengig-mekanismer. For å undersøke cellesyklus dynamikk eller celler i en bestemt fase av cellesyklusen, er det vanlig å synkronisere cellene. Imidlertid synkroniseringsmetoder kan ha skadelige effekter på cellene som blir studert, potensielt samvirkende oppnådde resultatene. En nylig bruk av fluorescensmerket proteiner som bare er til stede i bestemte faser av celler syklusen har tillatt analyse av cellesyklusutvikling i enkeltceller over tid 2, men cellene som skal studeres trenger å bli genetisk manipulert til å uttrykke disse merkede proteiner, noe som begrenser deres anvendelse til systemer hvor det kan lesesily oppnådd.
Cellesyklus består av to aktive faser: syntese (S) fase, hvor DNA blir replikert og mitose (M) hvor celledelingen foregår. Disse fasene er adskilt av tre gap faser, 0 G, G 1 og G 2. G 0 eller quiescence, er en hvilefase, hvor cellen har forlatt syklusen, G er en hvor cellene øke i størrelse før DNA-replikasjon og G 2, hvor celleveksten fortsetter mellom fullføring av DNA-replikasjon, men før celledeling. Den progresjon gjennom cellesyklus styres av en rekke kontrollpunkter. G en kontrollpost blir aktivert når miljøforholdene ikke er støttende for DNA-syntese og forhindrer inntreden i S-fasen. Intra-S fasen sjekkpunkt eller forsinkelse kan utløses av DNA skader som kan resultere i fastlåste replikering gafler. Under G 2 gjengivelsen av det replikert DNA bekreftes og hvis skaden blir oppdaget deretter G 2 3 Aktivering av disse sjekkpunkter er vanligvis brukes til å synkronisere cellepopulasjoner. Cellesykluskontrollpunkter kan aktiveres av en rekke faktorer, men i kreft biologi de mest vanlige er påvisning av DNA-skade. Den DNA-skade responsen initiert av PI3-kinase-lignende kinaser ataxia telangiectasia og Rad3 relatert (ATR) og ataxia telangiectasia mutated (ATM) som aktiverer nedstrøms effektor kinaser Chk1 og Chk2, respektivt. 3 en rekke arrangementer aktiverer Chk1 inkludert fastlåste replikering gafler, DNA kryssbindinger, og ultrafiolett stråling skader mens Chk2 er primært aktiveres av dobbel tråd pauser.
Den vanlige metode for å studere effekten av endrede betingelser av lengden av cellesyklusen is å synkronisere cellene i en bestemt fase av cellesyklusen. 1. Dette kan bli oppnådd via flere metoder. Celler kan separeres fysisk på grunnlag av størrelse, tetthet, side scatter (granularitet), og celleoverflate-ekspresjon markører. Mer praktisk, kan cellene bli synkronisert ved hjelp av kjemiske midler. Flere midler slik som thymidin, hydroksyurea og cytosinarabinosid kan brukes til å inhibere DNA-syntese i S-fasen av cellesyklus som resulterer i en akkumulering av celler i S-fasen som fortsetter etter sykling midlene er fjernet. Celler behandlet med nocodazol, som hindrer dannelsen av den mitotiske spindel, rest med en G 2 - eller M-fase DNA-innhold. Eliminering av serum fra kulturmediet resulterer i akkumulering av celler i G 0 fase. Den gjen tilsetning av næringsstoffer i kulturen serum gjen starter normal sykling av cellene. Men alle disse synkroniseringsmetoder forstyrre normal sykling og vekst av celler og kan Result i betydelig celledød.
Synkronisering av akutt lymfatisk leukemi cellene er spesielt utfordrende og disse cellene er ikke mottagelig for genetisk manipulasjon. Metoden som beskrives her muliggjør vurdering av cellesyklus dynamikk og studiet av celler i bestemte faser av cellesyklusen uten tradisjonell synkronisering eller genetisk modifisering. Denne metoden kan også være nyttig for andre celletyper hvor genetisk modifisering og synkroniserings tradisjonelle fremgangsmåter er ikke lett oppnås. Metoden er basert på veletablert bruk av bromdeoksyuridin (BrdU) innlemmelse, som har svært liten innvirkning på den kortsiktige vekst og spredning av celler. 4 Etablert BrdU protokoller dra nytte av inkorporering av BrdU inn nylig syntetisert DNA under S fasen . Dette markerer permanent celler som har vært i S-fasen i løpet av BrdU eksponering. Denne befolkningen kan identifiseres ved senere tidspunkter ved farging for BrdU incorporasjon og derved fungere som en synkronisert populasjon som kan følges og vurderes over tid tillater studiet av legemiddeleffekter på cellesyklus transitt. BrdU trenger å bli utsatt før antistoffarging, vanligvis oppnås etter DNase eller syrebehandling. 6,7 ved hjelp av flow-cytometri for å detektere inkorporerte BrdU muliggjør inkludering av ytterligere markører. Det viktigste er bruk av fargestoffer for å måle DNA-innhold, slik at vurderingen av cellesyklus fasefordeling av cellene som var i S-fasen ved starten av studien. 8 Videre ytterligere overflate eller intracellulære antigener kan også bli undersøkt. 9 Disse kan forholde seg til celle syklus hendelser som Ki67 eller tilsynelatende urelaterte cellefunksjoner som apoptose markører som kløyvet caspase-3. De potensielle bruksområder er begrenset av fantasien til etterforskeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er beskrevet her anvender akutt lymfoblastisk leukemi-cellelinje NALM6 men kan anvendes på andre celletyper.
1. Solutions og reagenser
- Komplett RPMI
- Legg 56 ml kalvefosterserum (FCS) og 5,5 ml 200 mM L-glutamin til en 500 ml flaske med RPMI-1640 medium.
- BrdU Stock Solution
- Forbered 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS).
- BrdU Komplett RPMI
- Legg 6.2 mL av BrdU stamløsning til 10 ml Komplett RPMI.
- DNase Solution
- Forbered 1 mg DNase / ml i DPBS.
- Farging Buffer
- Forbered 3% varmeinaktivert FCS og 0,09% natriumazid i DPBS.
- Se i Materialer List for definisjoner av Fixation Buffer, permeabiliseringsbuffer og vaskebuffer.
2. Celler
Neite: Celler ble dyrket i ikke mer enn 6 måneder. Denne metoden er direkte tilpasses en hvilken som helst ikke-klebende cellelinje med justeringer av celletetthet og kulturmedier. Bruk celler som vokser eksponentielt ved initiering av eksperimentet.
- Oppretthold NALM6 celler i T-75 kulturflasker i Komplett RPMI. Utføre alle trinnene under sterile forhold med en klasse II biosikkerhet kabinettet.
- Oppretthold NALM6 celler mellom 1-2 x 10 6 celler per ml ved å splitte kulturen tre ganger ukentlig.
- Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i luft.
3. Pulse Merking av celler med BrdU
FORSIKTIG: Håndter BrdU med forsiktighet da det er en potensiell mutagen og teratogen.
- Sentrifuger cellene ved 150 xg i 5 minutter. Merk: Overføring av cellene inn i friskt medium forbedrer reproduserbarhet av resultatene.
- Utfør en celletall og resuspender celler i Komplett RPMI på 2 x 10 6 cells / ml.
- Fortynn cellene 1 i to med BrdU fullstendig RPMI produsere en endelig cellekonsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml.
- Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 45 minutter, deretter fortynnes cellene i en 10 med komplett RPMI. Sentrifuger cellene ved 150 xg i 5 minutter og omhyggelig forkaste alle av supernatanten.
- Resuspender celler i et lite volum (~ 100 ul) av fullstendig RPMI, utføre en celletelling og juster til en 6 x 10 celler / ml.
- Pipetter 1 ml celler i brønnene i en 48 brønners plate. Pipettes 1 ml DPBS inn noen ubebodde brønner for å få mer reproduserbare resultater.
- Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i luft i de ønskede tidspunkter, her 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 og 24 timer. Merk: Hvor lang tid vil avhenge av hva eksperimentell design tar sikte på å måle.
- Overfør alle cellene i FACS rør ved hjelp av en pipette. Skyll godt sekvensielt med 1 ml volumes av PBS til en endelig totalvolum på 5 ml.
- Sentrifuger ved 150 xg i 5 minutter og fjern all supernatanten. Cellene er klar for farging, utføre denne (del 4) umiddelbart.
4. Cell Farging
Merk: Hvis overflaten farging av celler er nødvendig å utføre den før fiksering, slik at cellene holdes ved 4 ° C i hele.
- Resuspender celler i 100 ul farging buffer (for valgfri overflatefarging, tilsett anbefalte volum av antistoff mot overflateantigener og inkuberes i 30 min ved 4 ° C).
- Legg en ml flekker buffer, sentrifuger i 5 min ved 150 xg og kast supernatanten.
Merk: Spesifikk antistoff-konsentrasjon, inkubasjonstid etc. vil variere avhengig av spesifikke eksperimentelle mål. - Fiksering og Permeabilization
- Resuspender celler i 100 mL av fikseringsbuffer og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 1 ml of vaskebuffer, sentrifuger i 5 minutter ved 150 xg, og supernatanten kastes.
- Resuspender celler i 100 ul permeabiliseringsbuffer og inkuberes cellene i 10 minutter på is.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer, sentrifuger i 5 minutter ved 150 xg, og supernatanten kastes.
- Resuspender celler i 100 ul av fikseringsbuffer per rør og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer, sentrifuger i 5 minutter ved 150 xg, og supernatanten kastes.
Merk: Protokollen kan bli stanset her hvis nødvendig. De fikserte celler er stabile i flere dager ved 4 ° C dersom resuspendert i buffer farging. Fjern flekker buffer etter sentrifugering før du fortsetter.
- DNase-behandling
- Resuspender celler i 100 ul av DNase-løsning (30 ug DNase / 10 6 celler) og inkuberes cellene i 1 time ved 37 ° C.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer, sentrifuger ved 150 xg i 5 minutter, og supernatanten kastes.
- Antistoffarging
Merknad: farging for intracellulære markører andre enn BrdU kan utføres samtidig med BrdU farging.- VIKTIG: Forbered kompensasjon kontroller består av ufargede celler og celler merket med hvert enkelt fluorokrom. Ideelt sett bruker de samme antistoffene for kompensasjon kontroller som de som brukes i de eksperimentelle rør. Imidlertid, hvis dette ikke er mulig, erstatning antistoffer mot høyt uttrykte antigener konjugert til den samme fluorokrom.
- Cellene resuspenderes i 50 ul vaskebuffer og tilsett 1 pl / 10 6 celler av BrdU-antistoff. Merk: Direkte konjugerte antistoffer mot andre spesifikke intracellulære antigener kan også legges til.
MERK:. Antistoffer mot histon H3 fosforylert på Ser10 kan brukes til å diskriminere mellom celler i G2 og M, er histon H3 fosforylert på Ser10 under mitose 10 Antistoffer mot cdc2 fosforylert på Tyr15 kan brukes for å påvise celler som have forpliktet til mitose. 11 - Cellene inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer, sentrifuger cellene ved 150 xg i 5 minutter, og supernatanten kastes.
- Stain DNA for Cell Cycle Analysis
- Løsne pellet og tilsett 20 pl av den 7-AAD-løsning (0,25 ug). Merk: Det er viktig å bruke en konstant mengde av 7-AAD / celle.
- Suspender cellene i 1 ml Beising buffer.
5. Innsamling av flowcytometrisystemer data
Merk: Det er nødvendig vil avhenge av antallet og arten av de fluorokromer benyttes maskin.
- Samle de følgende parametre: FSC-A, SSC-A, FSC-H (FSC-W kan brukes i stedet for FSC-H) og 7-AAD fluorescens på en lineær skala. Samle APC kanal på en log skala. Samle noen ekstra kanaler som kreves for vurdering av overflate eller interne etiketter med en log skala.
- Utfør comerstatning av overlappende signaler i emisjonsspektra observert mellom forskjellige fluorokromer før analysering av prøvene. Merk: De fleste flowcytometere vil utføre denne automatisk.
- Samle minst 10.000 hendelser for hver prøve.
6. Analyse av flowcytometrisystemer data
Merk: FlowJo ble brukt i denne studien for flowcytometri dataanalyse, men andre programvarepakker kan også brukes. Portstyringsstrategi er vist i figur 1.
- Identifisere levedyktig cellepopulasjonen ved hjelp FSC-A og SSC-A parametere.
- Innenfor denne populasjonen utelukke dubletter og aggregater ved hjelp av FSC-A og FSC-H (FSC-W kan også anvendes her).
- Innenfor denne populasjonen satt et prikkplott ved hjelp av 7-AAD på x-aksen og BrdU-APC på y-aksen.
Figur 1: gating Strategy Venstre pa.nel: ungated celler er vist på en FCS-A vs. SSC-A prikkplott. Den levedyktige cellepopulasjon er identifisert av porten vist. Midtre panelet: celler gated fra venstre panelet vises på en FSC-A vs. FSC-H prikkplott (FSC-W kan brukes i stedet for høyde). Dubletter og aggregater er identifisert, og ekskludert ved porten vist. Høyre panel: celler gated fra dublett utelukkelse dato i sentrum panelet vises på en 7-AAD vs. APC-A prikkplott. Den BrdU-antistoff er merket med APC som tillater identifisering av celler som har inkorporerte BrdU under pulsen merking. 7-AAD gir informasjon om DNA innhold. Den øvre port definerer cellene som var positive for BrdU og derfor i S-fasen ved tidspunktet for BrdU puls, nedre venstre port, celler i G 0/1 og den nedre høyre porten de i G2 / M. Trykk her for å vise en større versjon av dette tallet.- Cell Cycle A nalysis
- Åpne den første datafil og gate på cellene i det dublett utelukkelse porten.
- Analysere denne populasjonen for cellesyklus distribusjon (under plattformene i flojo programvare) og bruke Dean-Jett-Fox modell.
- Skaff posisjonene til 0/1 G og G 2 / M topper ved hjelp skape porter.
- Gate på BrdU positive celler og underlagt denne populasjonen til samme celle syklus analyse.
- Gi posisjoner for G og G 0/1 2 / M topper ved å anvende de samme portene fra skaper porter og å sette begrensninger (ved hjelp av portene som er opprettet) for de posisjoner av 0/1 G og G 2 / M-topper. Dette er illustrert i de første to paneler av figur 2.
Merk: Annen programvare kan også brukes til å analysere dataene og instruksjonene vil variere tilsvarende.
840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Fig. 2: cellesyklusprogresjon det første panelet (alle celler) er innkoplet cellepopulasjonen definert av dublett utelukkelse porten. Denne stammen ble vist i et histogram med 7-AAD på X-aksen. Toppen av G 0/1 toppen er indikert ved pilen under aksen. I etterfølgende paneler BrdU positive celler har blitt separert på, som vist i figur 1. Verdien for G 0/1 stilling oppnås når portstyring av dublett utelukkelse porten påtrykkes BrdU positive celler i gated FlowJo cellesyklus-programvare. Hver etterfølgende panel ble separert på den BrdU positive populasjon som vist i figur 1, og posisjonen til toppen G 0/1 basert på den verdi som oppnås ved analyse av hele befolkningen som er vist i de to første plater. Ved hjelp av BrdU negative fraksjonen for å identifisere plasseringen av G 0/1 populasjonen for BrdU positive celler i samme sample kontroller for eventuelle små forskjeller i intensiteten av DNA-flekken mellom prøver. Nummeret som vises på hvert panel representerer gang siden BrdU puls avsluttet. De beregnede cellesyklusfaser vises i skygge grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden kan brukes for å oppnå et utvalg av informasjon. Noen søknader er beskrevet her.
Vurdering av varigheten av cellesyklus
For å bestemme den tid som kreves for celler til transitt gjennom cellesyklus, blir cellene høstet ved forskjellige tidspunkter etter den BrdU puls. Intervallene mellom vurderinger kan tilpasses de spesielle cellene som blir analysert. Hematopoetiske cellelinjer ble undersøkt hver time over en 24 timers periode i fravær av enhver behandling for å bestemme lengden av cellesyklusfaser under standard dyrkningsbetingelser. Figur 2 viser et utvalg av øyeblikksbilde analyse av NALM6 celler over en 24 timers periode. Cellene i S-fasen ved tidspunktet for BrdU puls (dvs. innenfor BrdU positive porten på figur 1) kommet gjennom G 2 / M, med en topp av celler i den fase av cellesyklusen blir detektert 10 timer etter den BrdU pulse. Andelen av BrdU-merkede celler i S-fasen nådde bunnivå 14 timer etter puls, og nesten alle celler hadde returnert til G 1 etter 17 timer. Ved 24 timers en andel av BrdU-merkede celler hadde inn på nytt i S-fasen som en del av deres neste cellesyklusen som indikerer at celler kan fullføre en cellesyklus i løpet av 24 timer, men de fleste hadde ennå ikke er gått inn i en andre runde av replikasjon, i samsvar med den kjente 36 hr doblingstiden for disse cellene.
Cellesyklusfordeling kan ytterligere raffineres ved inkludering av ytterligere markører. For eksempel, tilsetning av et antistoff for histon H3 fosforylert på Ser10 (en markør for celler i mitose) tillater diskriminering av celler i mitose fra de i G 2 (venstre panel i figur 3).
Figur 3: Bekreftelsei Cell Cycle trinn ved bruk Andre markører. Den øvre panelene viser cellesyklusanalyse av celler fra BrdU positive porten som vist i figur 1. Cellene hadde blitt inkubert i nærvær eller fravær av 3 nM vinkristin i 18 timer etter at BrdU puls . Cellesyklus Analysen ble utført som beskrevet i figur 2. De nedre panelene viser de samme cellene på 7-AAD vs. Histone H3 fosforylerte på Ser10 prikkplott. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vurdering av stoffet effekter på cellesyklusen
Cytotoksiske midler kan ha dyptgripende virkninger på cellesyklus fremgang og kan indusere celledød. Effekt av legemidler på cellesyklusprogresjon kan vurderes ved å tilsette medikamentene av interesse å følge BrdU puls. To eksempler er vist. Den første var en situasjon hvor induksjon of celledød skamme analyse av cellesyklusdata (høyre panel i figur 3). NALM6 cellene hadde vært utsatt for tre nM vinkristin i 18 timer etter BrdU puls. Celler ble forventet å arrestere i mitosen som vinkristin rettet mot mikrotubuli. Men cellesyklusanalyse antydet at cellene ikke hadde arrestert, men passerte gjennom til G 0/1 (figur 3 øvre, høyre panel). Tilsetning av et antistoff til histon H3 fosforylert på Ser10 viste at cellene ikke hadde gått mitose (figur 3 nederst til høyre panel), til tross for at et redusert DNA-innhold. Det er sannsynlig at den DNA-innhold ble redusert fordi cellene ble gjennomgår apoptose og hadde begynt å nedbryte deres DNA. Siden cellene initiert apoptose mens i mitose (dvs. med 4N DNA), vises de som S-fasen eller G 0/1 celler i stedet for den typiske apoptotiske sub-G en topp.
Fig. 4: Påvisning av Cell Cycle Stage Spesifikk dreping av dot plots viser prosentandelen av BrdU positive celler som er igjen i kulturen 24 timer etter den BrdU puls. Celler som hadde blitt dyrket i nærvær eller fravær av bærer alene (kontroll), 1,5 eller 16 uM RAD001 siden slutten av BrdU puls. Den nederste panelet viser prosentandelen av celler som var BrdU positive over 24 timers inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I et annet eksempel viser figur 4 hvordan, i nærvær av en lav konsentrasjon av RAD001 (en mTOR-inhibitor) celler som var i stand til å fullføre cellesyklusen, men gjennomgikk så en forsinkelse eller arrest i G 0/1. En høyere konsentrasjon av RAD001 stor grad hindret celler fra transiting gjennom til G 0/1. Viktigere celler i S-fasen (dvs. BrdU positive) ble vist å fortrinnsvis forsvinne fra kulturen når RAD001 ble tilsatt. Dette tyder på at celler som passerer gjennom G 2 / M var mer utsatt for celledød ved denne agent. 12
Det er også mulig å undersøke respons av celler i bestemte faser av cellesyklusen ved hjelp av antistoffer mot spesifikke antigener. I figur 5 aktivering av cellesykluskontrollpunktet kontrollerende proteiner Chk1 og Chk2 i respons til vinkristin behandling er vist. Chk1 og Chk2 aktiveres ved fosforylering på Ser345 og Thr68 hhv. Aktivering av Chk1 og Chk2 kan sees i celler som synes å ha en 2N DNA-innhold, men som vist i figur 5 er sannsynlig å være celler i mitose som har påbegynt DNA nedbrytning som et resultat av apoptose.
Det er mulig å legge til medikamenter ved forskjellige tidspunkter etterBrdU puls for å undersøke effekten av midlet på celler på ulike stadier av cellesyklusen.
Figur 5:. Påvisning av endringer i celler spesielt Cell faser Den øvre panelet viser celler gated på BrdU positive celler som i figur 1 i 7-AAD vs. fosforylert Chk1 (venstre) eller Chk2 (høyre) prikkplotter. Cellene hadde vært i kultur i 18 timer etter den BrdU puls i nærvær eller fravær av 3 nM vinkristin som for figur 3. De nedre panelene viser overlappings histogrammer av de samme cellene separert på enten 2N eller 4N fraksjon som angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å analysere cellesyklus er viktig for forståelsen av kreft biologi og virkningsmekanismen av begge legemidler og gener som påvirker celleproliferasjon og vekst. Mens det er en rekke analyser som angivelig måler celleproliferasjon, bare flertallet gi et mål som angir antall celler tilstede. Disse inkluderer analyser som måler celle nummer ved direkte visualisering og telling, metabolsk aktivitet eller ATP konsentrasjon. Den største fordelen med mange av disse metodene er at de er forholdsvis enkle å utføre og mottagelig for mikro formater og automatisering, noe som gjør dem nyttige for screening av et stort antall tilstander eller forbindelser. En ulempe ved mange av disse metodene er at celletap på grunn av død ikke er tatt i betraktning, noe som kan føre til en undervurdering av celleproliferasjon. Også disse fremgangsmåter måle hovedpopulasjon og ikke tillater studiet av enkeltceller eller transitt av celler viacellesyklusen.
Av de oftest brukte proliferasjonsanalyser, kanskje den mest pålitelige og nøyaktige er de som måler DNA syntese. Tradisjonelle celle proliferasjonsanalyser Inkuber cellene for et par timer til over natten med 3H-tymidin, som er innlemmet i nylig syntetisert DNA. 13 Den åpenbare problemet med denne metode er bruk av radioaktivt materiale, men en annen begrensning er at resultatet måler den gjennomsnittlige spredning av en populasjon av celler. BrdU kan likeledes anvendes uten stråle problemer, selv om ytterligere trinn er nødvendige, og BrdU er en potensiell mutagen. Imidlertid har BrdU fordelen av å være kompatibel med flowcytometri, tillater analyse av enkle celler. 14 Andre flowcytometri kompatible fremgangsmåter for å vurdere celleformering på celle-nivået er et økende antall fargestoffer som etiketten cellemembranen eller cellulære proteiner ( f.eks CFSE) som deles mellom daughteh celler, DNA interkaleringsforbindelser fargestoffer og cellesyklus spesifikt antigen påvisning av antistoffer. Den beste av cellemerkingsfargestoffer tillate celledeling sporings over et antall celledelinger. 15 De gir et direkte mål på proliferasjon, selv om ingen informasjon om cellesyklustrinn eller fordeling oppnås. Måling av DNA-innhold ved bruk av DNA-interkaleringsforbindelser fargestoffer som propidiumjodid eller 7-AAD gi sterk cellesyklusfordelingen 16, men ikke midlertidig, data. Selv med vurderingen av flere tidspunkter er det fortsatt umulig å vurdere lengden av cellesyklusen eller spesifikke cellesyklusfaser. Cellecyklus spesifikke antigener kan brukes til å vurdere cellesyklusfase i en usynkroniserte cellepopulasjon. Vanlig brukte cellesyklus spesifikke antigener inkluderer Ki-67, 17 som er uttrykt i løpet av S, G2 og M fasene av cellesyklusen, men ikke i løpet av G 0/1, PCNA (prolifererende cell nuclear antigen) 18, og fosforylering av hiStone H3. 19 Mens disse gir gode data om cellesyklus scenen, informasjon om cellesyklus dynamikk mangler.
Innhenting av data på cellesyklus dynamikk har tradisjonelt blitt undersøkt ved å synkronisere cellene ved hjelp av agenter eller dyrkningsforhold som blokkerer cellesyklusprogresjon. Dette fører til en opphopning av celler bak blokken, som en gang fjernes, resulterer i bølge av celler utvikler seg sammen gjennom cellesyklusen. 1. Ved beregning av varigheten av cellesyklusen, og lengden av de forskjellige cellesyklusfaser er da mulig. Celler kan induseres å avslutte aktive cellen sykling taste G 0 av serum deprivasjon. Ved re-tilsetning av serum cellene kan så bevege seg sammen inn i etterfølgende faser. 20 Selv om dette er en pålitelig metode for visse celletyper, andre, inklusive mange transformerte celletyper, mislykkes i å gå ut av cellesyklus og ofte gjennomgå celledød som en resultat. 21 Faktisk vår studør fant dette å være situasjonen for akutt lymfatisk leukemi celler. Videre vil cellene ofte mislykkes i å oppgi cellesyklus i en tilstrekkelig synkronisert måte. Kjemiske metoder kan brukes for å indusere cellesyklus-stans i bestemte faser av cellesyklusen. For eksempel, midler som hindrer DNA-syntese (f.eks overskudd tymidin) eller hindre den mitotiske spindeldannelse (f.eks nocodazol) arrest celler i S og M fasene henholdsvis, men er giftige og kan resultere i vekstforstyrrelser og til og med død i en betydelig andel av celler. 22 i alle celler disse metodene ikke klarte å arrestere de fleste celler uten å drepe en betydelig andel. Tatt i betraktning at målet var å vurdere effekten av en potensiell anti-leukemi agent på cellesyklusparametrene, celledød som følge av synkronisering var uakseptabelt. Til tross for beskrivelsen av et stort antall metoder for å synkronisere celler, har alle mangler. Hovedproblemene er: en utilstrekkeligberikelse for cellene i den ønskede delen av cellesyklus, forstyrrelser i den normale fysiologi av cellesyklusen eller, som observert, overskytende toksisitet.
Metoden som beskrives her er en enkel forlengelse av den lange puls som brukes system, hvor cellene blir inkubert i en kort periode med BrdU for å identifisere celler i S-fasen. Vi har funnet en 45 min puls å være optimal i systemet, men kortere tidsperioder kan benyttes dersom tilstrekkelig merking oppnås. Ved å fortsette å dyrke celler etter fjerning av BrdU er det mulig å spore deres progresjon gjennom resten av S-fase, G 2, mitose, en G og overgangen til det neste cellesyklusen. Det kan være mulig å følge cellene videre. Fordelen med dette systemet er at det ikke er noen tegn på toksisitet overfor cellene i tidsrammen av disse forsøk, og det er minimalt avbrudd for veksten av cellene, som bare et par av medie endringer er nødvendig. Cellene er på annen måte holdes i continuous kultur. Flowcytometri basert natur av fremgangsmåten innebærer at det kan kombineres med identifisering av celleunderpopulasjoner av ytterligere overflate eller intracellulær farging. Vi brukte APC konjugert BrdU antistoffer men andre konjugater kan erstattes til rette for utvikling av antistoff paneler. Vi brukte 7-AAD fremfor propidiumjodid fordi 7-AAD fluorescerer i en enkelt kanal maksimere muligheter for flerfarget farging. Tilsvar DAPI eller Hoechst kan brukes som DNA-flekker, men krever en UV-laser. Strammere CV for DNA flekker kan oppnås ved bruk av etanol fiksering, men dette ofte kompromisser antistoffarging, noe som begrenser mulighetene for ytterligere overflate eller cytoplasmatiske flekker. Den største ulempen er at S fasen varer ca 8 timer, så merkede celler kan ha nettopp kommet inn, eller i ferd med å avslutte S fasen under pulsperioden. Som et resultat, er synkroniseringen ikke er så tett som med noen andre systemer. Men ved å kombinere BrdU merking med fargestoffer som indikerer DNAinnhold og antistoffer til spesifikke cellesyklusavhengig proteiner, kan sterke data oppnås.
For å oppnå konsistente data er det viktig å sikre at cellene er i riktig konsentrasjon, og at cellekonsentrasjonen er uendret i alle betingelsene som sammenlignes. Kritisk lysstyrken til 7-AAD farging er svært følsom for cellekonsentrasjonen. Ved hjelp av en automatisert celletelling system kan bidra til at cellekonsentrasjonen er konsekvent i alle prøvene på hvert trinn i prosessen. Et annet viktig punkt er lengden av tiden cellene blir utsatt for BrdU. Små variasjoner kan føre til betydelige forskjeller, så er det viktig at alle prøvene blir inkubert med BrdU i nøyaktig samme tid. Til slutt er det viktig å titrere antistoffer for å oppnå optimal farging og dette bør gjentas hver gang en batch blir endret. Hvis alle trinnene er fulgt konsekvent og cellekonsentrasjonen holdes konstant, så dette method vil pålitelig muliggjøre sporing av cellene gjennom cellesyklusen uten behov for synkronisering. Det er også betydelig rom for å endre denne metoden for å dekke spesielle celletyper og løse konkrete spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
