Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.
Introduction
ההערכה של תכונות מחזור תא ושינויים המתרחשים בתאים במהלך התקדמות מחזור התא היא יסוד להבנת היבטים רבים של ביולוגיה, במיוחד ביולוגיה של הסרטן. יש סוכנים רבים בפיתוח לטיפול בגידולים ממאירים השפעות עמוקות על התקדמות מחזור תא או לגרום למוות של תאים באמצעות תלויים-מנגנוני מחזור התא. כדי ללמוד דינמיקת מחזור תא או תאים בשלב מסוים של מחזור התא, זה רגיל לסנכרן תאים. עם זאת שיטות סנכרון יכולות להיות השפעה מזיקה על התאים הנלמדים, שעלול להיות בלבול התוצאות שהתקבלו. 1 ניתוח לאחרונה את השימוש בחלבונים מתויגים fluorescently שנמצאים רק בשלבים מסוימים של מחזור התאים התיר להתקדמות מחזור התא בתאים בודדים לאורך זמן 2, לעומת זאת תאים להיחקר צורך לטפל גנטי כדי לבטא חלבונים מתויגים אלה, להגביל את השימוש שלהם למערכות שבן ניתן לקרוא את זההשיג ily.
מחזור התא מורכב משני שלבים פעילים: שלב הסינתזה (S), שבו ה- DNA משוכפל ומיטוזה חלוקת תא שבו (M) מתקיימת. שלבים אלה מופרדים על ידי שלושה שלבי פער, G 0, 1 G ו- G 2. G 0 או קפאון, הוא שלב מנוחה שבו התא עזב את המחזור, 1 G הוא שבו תאי גידול בגודל לפני שכפול ה- DNA וG 2 שבו צמיחת תאים ממשיך בין השלמת שכפול הדנ"א אבל לפני חלוקת תא. ההתקדמות דרך מחזור התא נשלטת על ידי מספר המחסומים. מחסום 1 G מופעל כאשר תנאי סביבה אינם תומכים של סינתזת DNA ומונעים כניסה לשלב S. מחסום שלב התוך-S או העיכוב יכול להיות מופעל על ידי נזק לדנ"א שעלולה לגרום למזלגות שכפול נתקע. במהלך G 2 הנאמנות של ה- DNA המשוכפל הוא אישרה ואם הנזק הוא זוהה לאחר מכן G 2 3 הפעלה של מחסומים אלה משמשת בדרך כלל כדי לסנכרן אוכלוסיות תאים. יכולים להיות מופעלים על מחסומי מחזור תא על ידי מספר הגורמים, אך בביולוגיה של הסרטן הנפוץ ביותר היא גילוי של נזק לדנ"א. תגובת הנזק ל- DNA היא ביוזמת telangiectasia כמו-PI3-kinase אטקסיה קינאזות וRad3 קשור (ATR) וtelangiectasia אטקסיה מוטציה (כספומט) המפעיל את קינאזות מפעיל במורד הזרם Chk1 וChk2, בהתאמה. 3 מגוון של אירועים מפעיל Chk1 לרבות נתקע מזלגות שכפול, crosslinks DNA, ונזקי קרינת האולטרה סגולות ואילו Chk2 מופעל בעיקר על ידי הפסקות גדיל פעמיים.
השיטה הרגילה ללימוד ההשפעה של תנאים שהשתנו באורך של i מחזור התאים כדי לסנכרן את התאים בשלב מסוים של מחזור התא. 1 זה יכול להיות מושגים באמצעות מספר שיטות. תאים יכולים להיות פיזי מפרידים על בסיס גודל, צפיפות, פיזור צד (גרעיניות), וסמני ביטוי פני תא. יותר כמעט, תאים עשויים להיות מסונכרנים באמצעים כימיים. כמה סוכנים כגון תימידין, hydroxyurea וarabinoside ציטוזין יכולים לשמש כדי לעכב סינתזת DNA בשלב S של מחזור התא וכתוצאה מכך הצטברות של תאים בשלב S שימשיכו רכיבה על אופניים לאחר הסוכנים יוסרו. תאים שטופלו nocodazole, אשר מונע היווצרות של ציר mitotic, מעצר עם G 2 - תוכן DNA או M-שלב. ביעור סרום מהתוצאות בינוני התרבות בהצטברות של תאים בשלב G 0. מחדש התוספת של החומרים המזינים בסרום התרבות מחדש מתחילה רכיבה על אופניים הרגילים של התאים. עם זאת, כל שיטות סנכרון אלה מפריעים לרכיבה על אופניים וצמיחה נורמלים של תאים ויכולים Resulלא במוות של תאים משמעותיים.
הסנכרון של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפים הוא מאתגר במיוחד ותאים אלה אינם ניתנים למניפולציה גנטית. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה של דינמיקת מחזור התא והמחקר של תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא ללא סנכרון מסורתי או שינוי גנטי. שיטה זו עשויה להיות שימושית גם עבור סוגי תאים אחרים שבם הנדסה גנטית ונהלי סנכרון מסורתיים אינן מושגות בקלות. השיטה מבוססת על השימוש הוותיק של bromodeoxyuridine התאגדות (BrdU), שבו יש השפעה קטנה מאוד על הצמיחה בטווח הקצר והתפשטות של תאים. 4 פרוטוקולי BrdU הוקם לנצל את השילוב של BrdU לתוך ה- DNA מסונתז חדש בשלב S . זה באופן קבוע מסמן תאים כמי שהיה בשלב S במהלך חשיפת BrdU. אוכלוסייה זו ניתן לזהות בנקודות זמן מאוחר יותר על ידי הצביעה לincorpor BrdUני ובכך לפעול כאוכלוסייה מסונכרנת שניתן בעקבות והעריך לאורך הזמן מאפשר המחקר של שפעות תרופה על מעבר מחזור התא. BrdU צריך להיות חשוף לפני מכתים נוגדן, בדרך כלל מושגת הבאה DNase או טיפול בחומצה. 6,7 באמצעות cytometry זרימה לזהות BrdU המשולב מאפשר ההכללה של סמנים נוספים. החשוב ביותר הוא השימוש בצבעים למדוד תוכן DNA, המאפשר ההערכה של הפצת שלב מחזור התא של התאים שהיו בשלב S בתחילת המחקר. יכולים להיות גם למדו 8 אנטיגנים משטח או תאיים יתר נוסף. 9 אלה עשוי להתייחס לאירועי מחזור התא כגון Ki67 או תכונות תא שאינה קשורה לכאורה כגון סמני אפופטוזיס כמו caspase-3 ביקע. היישומים הפוטנציאליים מוגבלים על ידי הדמיון של החוקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בקו תא לוקמיה לימפובלסטית החריף NALM6 אבל יכול להיות מיושם על סוגי תאים אחרים.
1. פתרונות וריאגנטים
- RPMI מלא
- להוסיף 56 מיליליטר סרום עגל עוברי (FCS) ו -5.5 מיליליטר של 200 מ"מ L- גלוטמין לבקבוק 500 מיליליטר של מדיום RPMI-1640.
- BrdU פתרון במלאי
- הכן 32.5 מ"מ BrdU (10 מ"ג / מיליליטר) בבופר פוספט של Dulbecco (DPBS).
- RPMI המלא BrdU
- להוסיף 6.2 μl של פתרון מניות BrdU 10 מיליליטר של RPMI השלם.
- פתרון DNase
- הכן DNase 1 מ"ג / מיליליטר בDPBS.
- מכתים מאגר
- הכן 3% FCS מומת חום ושל 0.09% אזיד הנתרן בDPBS.
- עיין בחומרי רשימה להגדרות של קיבוע מאגר, permeabilization הצפת והצפה לשטוף.
2. תאים
לאטה: תאים לא היו בתרבית ליותר מ -6 חודשים. שיטה זו היא באופן ישיר וישימה לכל שורת תאים שאינם חסיד עם התאמות לצפיפות תאים ותקשורת ותרבות. להשתמש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי בייזום של הניסוי.
- שמור על תאי NALM6 בצלוחיות תרבות T-75 בRPMI השלם. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים באמצעות Class II בטיחות ביולוגית קבינט.
- שמור על תאי NALM6 בין 1-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר ידי פיצול התרבות שלוש פעמים בשבוע.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר.
3. תיוג דופק של תאים עם BrdU
זהירות: ידית BrdU בזהירות כפי שהוא mutagen וטךטוגן פוטנציאליים.
- תאי צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות. שים לב: העברת תאים לתקשורת טריות משפרת את שחזור של התוצאות.
- לבצע ספירת תאים ותאים גלולים בRPMI המלא ב 2 x 10 6 ג/ אמות מיליליטר.
- לדלל תאים 1 ב 2 עם RPMI השלם BrdU ייצור ריכוז תא סופי של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 45 דקות, ואז לדלל תאים 1 ב 10 עם RPMI השלם. תאי צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות ובזהירות להשליך את כל supernatant.
- תאים גלולים בנפח קטן (~ 100 μl) של RPMI השלם, לבצע ספירת תאים ולהתאים ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- פיפטה 1 מיליליטר של תאים לתוך הבארות של צלחת גם 48. מיליליטר פיפטה 1 של DPBS לתוך כל בארות פנויות כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר לנקודות זמן רצוי, כאן 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, ו -24 שעות. הערה: משך הזמן יהיה תלוי במה העיצוב הניסיוני שמטרתו למדוד.
- העבר את כל התאים לתוך צינורות FACS באמצעות פיפטה. יש לשטוף את הרצף גם עם 1 מיליליטר voluMES של PBS להיקף כולל סופי של 5 מיליליטר.
- צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות ולהסיר את כל supernatant בזהירות. תאים מוכנים לצביעה, לבצע את זה (סעיף 4) באופן מיידי.
מכתים 4. סלולארי
הערה: אם נדרש צביעת תאי שטח לבצע אותו לפני הקיבוע, על מנת להבטיח כי התאים נשמרים על 4 מעלות צלזיוס לאורך כל דרך.
- תאים גלולים במאגר של הכתמת 100 μl (מכתים משטח אופציונאלי, להוסיף הנפח המומלץ של נוגדן על פני השטח אנטיגנים דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C).
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ מכתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG וזורקים supernatant.
הערה: נוגדן ספציפי, ריכוז, זמן דגירה וכו 'ישתנה בהתאם למטרות ניסוי ספציפיות. - קיבעון וpermeabilization
- Resuspend תאים במאגר של קיבעון 100 μl ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 1 מיליליטר oחיץ F לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG וזורקים supernatant.
- Resuspend תאים במאגר של permeabilization 100 μl דגירה התאים במשך 10 דקות על קרח.
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG, וזורקים supernatant.
- Resuspend תאים במאגר של קיבוע לכל צינור 100 μl ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG, וזורקים supernatant.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן אם נדרש. התאים הקבועים יציבים במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם resuspended במאגר מכתים. הסר את החיץ מכתים הבא צנטריפוגה לפני שימשיך.
- DNase טיפול
- תאי Resuspend בפתרון DNase 100 μl (30 מיקרוגרם של DNase / 10 6 תאים) ותאי דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות ב XG 150 במשך 5 דקות וזורקי supernatant.
- נוגדן מכתים
הערה: מכתים עבור סמנים תאיים אחרים מאשר BrdU ניתן לבצע בו זמנית עם מכתים BrdU.- חשוב: הכן בקרות פיצוי בהיקף של תאים בלא כתם ותאים שכותרתו עם כל fluorochrome יחיד. באופן אידיאלי, להשתמש באותו נוגדנים עבור פקדי פיצויים אלו המשמשים בצינורות הניסיוניים. עם זאת, אם זה לא ריאלי, נוגדני תחליף לאנטיגנים הביעו מאוד מצומדות לאותו fluorochrome.
- Resuspend התאים 50 μl של חיץ לשטוף ולהוסיף μl 1/10 6 תאים של נוגדן BrdU. הערה: ניתן גם להוסיף נוגדנים מצומדות ישירות לאנטיגנים ספציפיים תאיים אחרים.
הערה:. נוגדנים להיסטון H3 phosphorylated על Ser10 יכולים לשמש כדי להבחין בין התאים בG2 וM, היסטון H3 הוא phosphorylated בSer10 במהלך מיטוזה 10 נוגדנים לcdc2 phosphorylated על Tyr15 יכול לשמש כדי לזהות תאים שhavדואר מחויב למיטוזה. 11 - דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, תאי צנטריפוגות ב XG 150 במשך 5 דקות וזורקי supernatant.
- ה- DNA כתם לניתוח תא מחזור
- שחרר גלולה ולהוסיף 20 μl של פתרון 7-AAD (0.25 מיקרוגרם). הערה: זה קריטי כדי להשתמש בכמות קבועה של 7-AAD / תא.
- Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ מכתים.
5. אוסף של cytometry זרימת נתונים
הערה: המכונה הנדרשת יהיו תלוי במספר והאופי של fluorochromes בשימוש.
- לאסוף את הפרמטרים הבאים: FSC-, SSC-, FSC-H (FSC-W יכול לשמש במקום FSC-H) וקרינה 7-AAD בקנה מידה ליניארי. לאסוף את ערוץ APC בקנה מידת יומן. לאסוף כל ערוצים נוספים הנדרשים להערכת תוויות משטח או פנימי באמצעות סולם יומן.
- בצע compensation של חופף אותות בספקטרום פליטה נצפה בין fluorochromes שונה לפני ניתוח הדגימות. הערה: רוב הזרימה cytometers יבצע זאת באופן אוטומטי.
- לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה.
6. ניתוח cytometry זרימת נתונים
הערה: FlowJo שימש במחקר זה לזרימה גם cytometry יכול לשמש לניתוח נתונים, אך חבילות תוכנה אחרות. אסטרטגית gating מודגמת באיור 1.
- זהה את אוכלוסיית תאי קיימא באמצעות פרמטרים FSC-וSSC-.
- בתוך אוכלוסייה זו לא לכלול כפילויות ואגרגטים באמצעות FSC-וFSC-H (FSC-W יכול לשמש גם כאן).
- בתוך אוכלוסייה זו נקבעה עלילת נקודה באמצעות 7-AAD על ציר x וBrdU-APC על ציר y.
איור 1: gating אסטרטגיה שמאל הרשות הפלסטינית.Nel: תאי ungated מוצגים בFCS-מול SSC-עלילת נקודה. אוכלוסיית תאי קיימא מזוהה על ידי השער שמוצג. פנל מרכז: תאים מגודר מהלוח השמאלי מוצגים בFSC-מול עלילת נקודת FSC-H (FSC-W יכול לשמש במקום גובה). כפילויות ואגרגטים מזוהות, ולא נכללו בשער שמוצג. פנל ימני: תאים מגודר ממועד הרחקת כפיל בלוח המרכז מוצגים על 7-AAD לעומת APC-עלילת נקודה. נוגדן BrdU מסומן עם APC מאפשר זיהוי של תאים ששולבו במהלך BrdU תיוג הדופק. 7-AAD מספק מידע על תוכן DNA. השער העליון מגדיר תאים חיוביים לBrdU ולכן בשלב S בזמן דופק BrdU, השער השמאלי התחתון, התאים בG 0/1 והשער הימני התחתון אלה בG 2 / M. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.- תא מחזור nalysis
- פתח את הקובץ הראשון נתונים ושער על התאים בשער הדרת כפיל.
- לנתח אוכלוסייה זו להפצת מחזור התא (הממוקמת תחת פלטפורמות בתוכנה פלה-ג'ו) ולהשתמש במודל הדיקן-ג'ט-פוקס.
- השג את העמדות של G 0/1 וG 2 / M פסגות באמצעות ליצור שערים.
- שער בנושא תאים וחיוביים BrdU אוכלוסייה זו לאותו ניתוח מחזור התא.
- לספק המשרות לG 0/1 וG 2 / M פסגות על ידי יישום אותו השערים משערים ליצור וקביעת מגבלות (באמצעות השערים שנוצרו) לעמדות של G 0/1 וG 2 / M פסגות. זו באה לידי ביטוי בלוחות 2 הראשונים של איור 2.
הערה: גם תוכנות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את הנתונים וההוראות היו להשתנות בהתאם.
840 / "width =" 700 52840fig2highres.jpg "/>
איור 2:. התקדמות פנל תא המחזור הראשון (כל התאים) הוא מגודר באוכלוסיית התא שהוגדרה על ידי שער הדרת כפיל. אוכלוסייה זו הוצגה בהיסטוגרמה עם 7-AAD על ציר ה- X. השיא של שיא G 0/1 מצויינים על ידי החץ מתחת לציר. בלוחות הבאים תאים חיוביים BrdU כבר מגודר בכפי שמוצגים באיור 1. הערך לתפקיד 0/1 G מתקבל כאשר gating של שער הדרת כפיל מוחל על התאים מגודרות החיוביים BrdU בתוך תוכנת מחזור תא FlowJo. כל פנל שלאחר מכן היה מגודר באוכלוסייה החיובית BrdU כפי שמוצג באיור 1 ואת עמדתו של שיא 0/1 G מבוסס על הערך שהושג בניתוח האוכלוסייה כולה, כפי שמוצג בשני הלוחות הראשונים. שימוש בחלק השלילי BrdU לזהות את המיקום של אוכלוסיית G 0/1 לתאים החיוביים BrdU באותו SAMPle שולט על כל הבדלים קלים בעוצמה של כתם DNA בין דגימות. המספר המוצג בכל פנל מייצג את הזמן מאז דופק BrdU הסתיים. שלבי מחזור התא המחושבים מוצגים בירוק מוצלת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי להשיג מגוון רחב של מידע. כמה יישומים המפורטות כאן.
הערכה של משך מחזור התא
כדי לקבוע את הזמן דרוש לתאים למעבר דרך מחזור התא, תאים נקצרים בנקודות זמן שונות הבאות דופק BrdU. המרווחים בין הערכות יכולים להיות מותאמים לתאים מסוימים להיות מנותח. שורות תאי hematopoietic הוערכו בכל שעה במשך 24 שעות בהיעדר טיפול תרופתי כדי לקבוע את האורך של שלבי מחזור התא בתנאי תרבות סטנדרטיים. איור 2 מציג מבחר של ניתוח תמונת מצב של תאי NALM6 פני תקופה של 24 שעות. התאים בשלב S בזמן דופק BrdU (כלומר בתוך השער החיובי BrdU באיור 1) התקדמו דרך G 2 / M, עם שיא של תאים בשלב זה של מחזור התא שיראו 10 שעות לאחר p BrdUulse. חלקם של תאי BrdU שכותרת בשלב S הגיע שעה שפל 14 אחרי הדופק וכמעט כל תאים חזרו ל -1 G לאחר 17 שעות. ב -24 שעות שיעור של תאי BrdU שכותרתו היה נכנס שוב שלב S כחלק ממחזור התא הבא שלהם מצביע על כך שתאים יכולים להשלים מחזור תא בתוך 24 שעות, אולם רובם עדיין לא נכנס לסיבוב שני של שכפול, עולה בקנה אחד עם ידועים 36 שעה הכפלת זמן לתאים אלה.
הפצת מחזור התא יכולה להיות מעודנת עוד יותר על ידי ההכללה של סמנים נוספים. לדוגמא, התוספת של נוגדנים להיסטון H3 phosphorylated על Ser10 (סמן של תאים במיטוזה) מתירה האפליה של תאים במיטוזה מאלה בG 2 (משמאל פנלים של איור 3).
איור 3: אישורשלב תא מחזור באמצעות סמנים נוספים. הלוחות העליונים להראות ניתוח מחזור התא של תאים מהשער החיובי BrdU כפי שמוצגים באיור 1. התאים שטופחו על ידי הנוכחות או עדר של 3 vincristine ננומטר במשך 18 שעות לאחר דופק BrdU . ניתוח מחזור התא נערך כמתואר באיור 2. הלוחות הנמוכים להראות את אותו תאים ב7-AAD לעומת היסטון H3 phosphorylated בעלילת נקודת Ser10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכה של שפעות תרופה על מחזור התא
סוכנים ציטוטוקסיות יכולים להיות השפעה עמוקה על התקדמות מחזור תא ויכולים לגרום למוות של תאים. ההשפעה של תרופות על התקדמות מחזור התא יכולה להיות מוערכת על ידי הוספת התרופות של העניין הבא דופק BrdU. שתי דוגמאות מוצגות. הראשון היה מצב שבו האינדוקציה oמוות של תאים ו מבולבל ניתוח נתוני מחזור התא (פנלים תקין של איור 3). תאי NALM6 נחשפו עד 3 vincristine ננומטר במשך 18 שעות לאחר דופק BrdU. תאים היו צפויים למעצר במיטוזה כmicrotubules מטרות vincristine. עם זאת ניתוח מחזור התא הציע שהתאים לא נעצרו אלא transited דרך לG 0/1 (איור 3 פנל ימני עליון). התוספת של נוגדנים להיסטון H3 phosphorylated על Ser10 הראתה כי תאים לא יצאו מיטוזה (איור 3 פנל ימני תחתון), למרות שיש תוכן DNA מופחת. סביר להניח כי תוכן DNA היה ירד בגלל התאים עוברים אפופטוזיס והתחילו להשפיל את הדנ"א שלהם. מאז התאים יזמו אפופטוזיס ואילו במיטוזה (כלומר עם 4N DNA), הם מופיעים כשלב S או G 0/1 תאים במקום השיא אפופטוטיים תת-G 1 הטיפוסי.
איור 4:. איתור של הריגה ספציפית שלב תא מחזור חלקות הנקודה להראות את אחוז התאים החיוביים BrdU שנותרו בשעת תרבות 24 אחרי דופק BrdU. תאים היו בתרבית בנוכחות או העדר של רכב לבד (בקרה), 1.5 או 16 מיקרומטר RAD001 מאז סוף דופק BrdU. הפנל התחתון מראה את אחוז התאים שהיו BrdU חיובי על הדגירה 24 שעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בדוגמא אחרת, איור 4 מראה כיצד בנוכחות ריכוז נמוך של RAD001 (מעכב mTOR) תאים היו מסוגל להשלים את מחזור התא אבל אז עבר לעיכוב או מעצר בG 0/1. ריכוז גבוה יותר של RAD001 מנע במידה רבה תאים מtransiting דרך לG 0/1. חשוב לציין תאים בשלב S (כלומר BrdU חיובי) הוצגו להיעלם מועדף מהתרבות כאשר RAD001 נוסף. הדבר מצביע על כך תאים עוברים דרך G 2 / M היו רגישים יותר למוות של תאים על ידי סוכן זה. 12
אפשר גם לבחון את תגובות של תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא באמצעות נוגדנים לאנטיגנים ספציפיים. באיור 5 ההפעלה של מחסום מחזור תא השליטה החלבונים Chk1 וChk2 בתגובה לטיפול vincristine מוצג. Chk1 וChk2 מופעלים על ידי זרחון על Ser345 וThr68 בהתאמה. הפעלה של Chk1 וChk2 ניתן לראות בתאים שנראה שיש לי תוכן DNA 2N אבל כפי שמוצג באיור 5 צפויים להיות תאים במיטוזה שהחלה השפלה DNA כתוצאה של אפופטוזיס.
ניתן להוסיף תרופות בנקודות זמן שונות לאחרדופק BrdU לבחון את ההשפעה של הסוכן על תאים בשלבים שונים של מחזור התא.
איור 5:. איתור של שינויים בתאים בשלבי מחזור תא מיוחדים הפנל העליון מציג תאים מגודר על התאים החיוביים BrdU כמו באיור 1 ב7-AAD לעומת Chk1 פוספורילציה (משמאל) או Chk2 (מימין) מגרשי נקודה. התאים היו תרבות במשך 18 שעות הבאות דופק BrdU בנוכחות או עדר של 3 vincristine ננומטר כלאיור 3. הלוחות הנמוכים להראות היסטוגרמות שכבה של התאים באותו מגודר משני חלק 2N או 4N כפי שצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת לנתח את מחזור התא היא חשובה להבנת ביולוגיה של סרטן ואת מנגנון פעולה של שתי התרופות וגנים המשפיעים על שגשוג תאים וצמיחה. אמנם יש מספר רב של מבחני שדיווחים למדוד התפשטות תאים, רוב לספק מידה המציינת את מספר התאים בהווה בלבד. אלה כוללים מבחני המודדים תא מספר על ידי הדמיה ישירה וספירה, פעילות המטבולית או ריכוז ה- ATP. היתרון העיקרי של רבים מהשיטות האלה הוא שהם קלים יחסית לביצוע ונוחים לפורמטים microplate ואוטומציה, שהופכים אותם שימושיים לסינון כמויות גדולות של תנאים או תרכובות. חסרונם של רבים משיטות אלה הוא שתא הפסד כתוצאה ממוות לא נלקח בחשבון, שעלול להוביל להערכה חסרה של התפשטות תאים. גם שיטות אלה למדוד את האוכלוסייה בתפזורת ואינה מאפשרות המחקר של תאים בודדים או המעבר של תאים דרךמחזור התא.
של מבחני ההתפשטות הנפוצות, אולי אמינות ומדויקים ביותר הם אלה המודדים סינתזת DNA. מבחני התפשטות תאים מסורתיים דגירה תאים לכמה שעות ללילה עם 3 H-תימידין, אשר שולב לתוך ה- DNA מסונתז חדש. 13 הבעיה הברורה בשיטה זו היא השימוש בחומרים רדיואקטיביים, אך מגבלה נוספת היא שהאמצעים התוצאה הממוצע ריבוי אוכלוסייה של תאים. BrdU ניתן להשתמש באופן דומה ללא בעיות הקרינה, למרות צעדים נוספים נדרשים וBrdU הוא mutagen פוטנציאלי. עם זאת, יש BrdU את היתרון של להיות תואם עם cytometry זרימה, המאפשר הניתוח של תאים בודדים. 14 זרימה אחר cytometry שיטות תואמות להערכת התפשטות תאים ברמת התא הבודד כולל מספר גדל והולך של צבעים שתווית קרום התא או חלבונים תאיים ( למשל CFSE) שמחלק בין daughtתאים אה, צבעי intercalating DNA וזיהוי אנטיגן הספציפי מחזור תא על ידי נוגדנים. הטובים ביותר של צבעי תיוג התא מאפשרים מעקב חלוקת תא על מספר חלוקות תא. 15 הם מספקים מדידה ישירה של שגשוג, למרות שאין מידע על שלב מחזור תא או הפצה מתקבל. המדידה של תוכן ה- DNA באמצעות צבעי intercalating DNA כגון יודיד propidium או 7-AAD לספק הפצת מחזור התא חזקה 16, אבל לא זמני, נתונים. אפילו עם ההערכה של נקודות זמן רבות הוא נשאר בלתי אפשרי להעריך את אורכו של מחזור התא או שלבי מחזור התא ספציפיים. אנטיגנים ספציפיים מחזור התא יכולים לשמש כדי להעריך בשלב מחזור התא באוכלוסיית תא לא מסונכרנת. אנטיגנים ספציפיים מחזור תא נפוץ כוללים קי-67, 17 אשר בא לידי ביטוי בS, G 2 ושלבי M של מחזור התא, אך לא בG 0/1, PCNA (אנטיגן התא מתרבים גרעיני) 18, וזירחון של חistone H3. 19 בעוד אלה מספקים נתונים טובים לגבי שלב מחזור התא, מידע הנוגע דינמיקת מחזור התא חסרה.
נתוני קבלת על דינמיקת מחזור התא באופן מסורתי נבדקו על ידי סנכרון תאים באמצעות סוכנים או תנאי תרבות, החוסמים את התקדמות מחזור התא. זה גורם להצטברות של תאים מאחורי הבלוק, שהוסר ברגע, לגרום לגל של תאים מתקדמים יחד דרך מחזור התא. 1 חישוב משך מחזור התא והאורך של שלבי מחזור התא השונים אז ניתן. יכולים להיגרם תאים כדי לצאת רכיבה על אופניים תא פעילים הזנת G 0 על ידי מניעת סרום. עם מחדש התוספת של סרום התאים עשויים לאחר מכן לעבור יחד לשלבים הבאים. 20 בזמן זה הוא שיטה אמינה לסוגי תאים מסוימים, אחרים, לרבות סוגי תאים רבים הפכו, לא מצליחים לצאת ממחזור התא ולעתים קרובות עוברים מוות תאי כ תוצאה. 21 אכן סטומת מצא את זה כדי להיות מצב לתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפים. יתר על כן, תאים לעתים קרובות אינם מצליחים להיכנס שוב מחזור התא באופן מסונכרן מספיק. שיטות כימיות ניתן להשתמש כדי לגרום לעצירת מחזור התא בשלבים מסוימים של מחזור התא. לדוגמא, סוכנים המונעים סינתזת DNA (למשל עודף תימידין) או למנוע היווצרות ציר mitotic (למשל nocodazole) תאי מעצר בשלבי S ו- M בהתאמה, אבל הם רעילים ויכולים לגרום להפרעות בגדילה ואף למוות בחלק משמעותי מ תאים. 22 בכל תאים בשיטות אלה לא הצליחו לעצור את רוב התאים בלי להרוג חלק משמעותי. בהתחשב בכך שהמטרה הייתה להעריך את ההשפעות של סוכן אנטי leukemic פוטנציאלי על פרמטרים מחזור התא, המוות של התאים כתוצאה מהסנכרון היה בלתי מתקבל על הדעת. למרות התיאור של מספר רב של שיטות לסנכרון תאים, לכולם יש חסרונות. הבעיות העיקריות הן: לא מספיקהעשרה לתאים בחלק הרצוי של מחזור התא, הפרעות לפיסיולוגיה הנורמלית של מחזור התא או, כפי שנצפתה רעילות, עודפת.
השיטה המתוארת כאן היא הרחבה פשוטה של מערכת הדופק הארוכה משמשת, שבו תאים מודגרת לתקופה קצרה עם BrdU לזהות תאים בשלב S. מצאנו דופק 45 דקות להיות אופטימלי במערכת שלנו, אבל פרקי זמן קצרים יותר עשויים לשמש אם תיוג מספיק מתקבל. על ידי המשך תאי תרבות לאחר הסרת BrdU ניתן לעקוב אחר ההתקדמות שלהם בשארית שלב S, G 2, מיטוזה, 1 G וכניסה למחזור התא הבא. ייתכן שניתן יהיה לעקוב אחר התאים נוספים. יתרונה של מערכת זו הוא שאין ראיות של רעילות לתאים במסגרת ניסויים אלו הזמן ויש הפרעה מזערית לצמיחה של התאים, כמו שרק כמה שינויי תקשורת נדרשות. התאים נשמרים אחרת בקונטיתרבות nuous. Cytometry זרימת הטבע של השיטה המבוססת אומרת שזה יכול להיות משולב עם זיהוי של אוכלוסיות תאים על ידי משטח נוסף או מכתים תאיים. אנו משמשים נוגדני BrdU מצומדות APC אבל ניתן להחליף conjugates האחר כדי להקל על הפיתוח של לוחות נוגדן. השתמשנו 7-AAD לא יודיד propidium כי 7-AAD מאיר בערוץ אחד למקסם את האפשרויות לצביעה ססגוניות. כמו DAPI או Hoechst יכול לשמש ככתמי DNA אך דורש לייזר UV. ניתן להשיג קורות חיים חזק יותר עבור מכתים DNA באמצעות קיבוע אתנול אבל זה לעתים קרובות פוגע מכתים נוגדן, המגביל את האפשרויות למשטח נוסף או כתמי cytoplasmic. החסרון הגדול ביותר הוא שS שלב נמשך כ -8 שעות, כך תאי שכותרת אולי פשוט נכנסו או עומדים לצאת שלב S במהלך תקופת הדופק. כתוצאה מכך, הסנכרון הוא לא חזק כמו בכמה מערכות אחרות. עם זאת, על ידי שילוב של תיוג BrdU עם צבעים המציינים DNAתוכן ונוגדנים לחלבונים תלויים מחזור התא ספציפיים, ניתן לקבל נתונים חזקים.
על מנת לקבל נתונים עקביים חשוב להבטיח שתאים נמצאים בריכוז הנכון ושריכוז התא הוא עקבי בכל התנאים מושווים. ביקורתי הבהירות של צביעת 7-AAD היא מאוד רגישה לריכוז תא. שימוש במערכת ספירת תאים אוטומטי יכול להבטיח שריכוזי התא עקביים בכל הדגימות בכל שלב בתהליך. נקודה חשובה נוספת היא המשך זמן התאים נחשפים BrdU. וריאציות קטנות יכולות לתרגם הבדלים ניכרים, ולכן חשוב שכל הדגימות מודגרת עם BrdU עבור בדיוק באותו הזמן. לבסוף, חשוב לכיל נוגדנים להשיג צביעה אופטימלית וזה צריך להיות חוזר ונשנה בכל פעם שיצווה משתנה. אם כל הצעדים בעקבות באופן עקבי וריכוזי תא נשמרו קבועים אז metho זהד באופן מהימן יאפשר המעקב של תאים דרך מחזור התא ללא הצורך בסנכרון. יש גם היקף ניכר לשנות שיטה זו כדי שתתאים לסוגים מסוימים של תאים ולענות על שאלות ספציפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
