Abstract
Dit protocol beschrijft hoe neuronale activiteit tijdelijk en op afstand zwijgen in discrete hersengebieden terwijl dieren zijn betrokken bij leren en geheugen taken. De aanpak combineert farmacogenetica (Designer-receptoren-Uitsluitend-Activated-by-Designer-Drugs) met een gedrags-paradigma (zintuiglijke preconditionering) dat is ontworpen om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van leren. Specifiek wordt viraal-bemiddelde aflevering gebruikt om een genetisch gemodificeerde remmend G-proteïne gekoppelde receptor (de ontwerpers receptor) in een afzonderlijk gebied van de hersenen bij knaagdieren tot expressie. Drie weken later, wanneer ontwerper receptor expressieniveaus zijn hoog, een farmacologisch middel (de ontwerpers Drug) wordt systemisch toegediend 30 min vóór een bepaalde gedrags-sessie. Het geneesmiddel heeft affiniteit voor de ontwerper receptor en dus resulteert in remming van neuronen die de ontwerper receptor tot expressie maar anderszins biologisch inert. De hersenen regio blijft zwijgen voor 2-5 uur (afhankeding van de dosis en wijze van toediening). Na voltooiing van de gedrags- paradigma wordt hersenweefsel beoordeeld op correcte plaatsing en receptor expressie. Deze benadering is bijzonder nuttig voor het bepalen van de bijdrage van afzonderlijke hersengebieden bepaalde onderdelen van gedrag en kan worden gebruikt in willekeurig aantal gedragsparadigma's.
Introduction
Een uitdaging op het gebied van Behavioral Neuroscience is het neurale substraat van complexe gedrag te bepalen. Een aantal technieken zoals permanente laesies, tijdelijke inactivering hersenen via canules implantaten en optogenetics zijn gebruikt om de bijdrage van discrete hersengebieden identificeren subcomponenten van complexe gedragingen. Hoewel deze benaderingen te informeren ons begrip van regionale specificiteit tijdens het leren, elke techniek is niet zonder beperkingen. Specifiek worden permanent laesies gewoonlijk uitgevoerd vóór gedragstesten, waardoor het effect gedurende de duur van het paradigma aanwezig. Canulatie studies dat de presentatie van een korte-termijn neurale inactivator (bijv tetrodotoxin) te betrekken kan aanzienlijke schade aan hersenweefsel te produceren en kan stress in proefpersonen vlak voor gedrags testen induceren. Verder wordt inactivering door middel canulatie beperkt tot het gebied van weefsel dat rond detopje van de canules. Tot slot, terwijl optogenetics biedt een scala van flexibiliteit voor de tijdelijke controle van de activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, het is onbetaalbaar en technisch veeleisend.
Deze beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van een farmacogenetische aanpak (Designer-receptoren Uitsluitend-Activated-by-Ontwerper-Drugs, DREADDs) 1,2. Belangrijk, terwijl het begrip farmacogenetica is verfijnd, de uitvoering van de techniek is eenvoudig. Vergelijkbaar met traditionele stereotaxische chirurgische methoden die infusie toxine (bijvoorbeeld NMDA, iboteenzuur) in discrete hersengebieden omvat deze techniek infusie een adeno-geassocieerd virus (AAV), die een DNA-fragment dat voor een gemodificeerd remmend G-proteïne gekoppelde receptor bevat betrekken (hM4Di, de ontwerper receptor) in het interessegebied van standaard laboratorium knaagdieren (zie figuur 1). De virale vector bevat ook een fluorescerende reporter (mcitrine). Eenmaal opgenomen incellen, worden de designer receptor (en reporter proteïne) maximaal tot expressie ~ 3 weken na infusie en kan selectief worden geactiveerd voor 2-5 uur met de systemische toediening van de anderszins biologisch inert ontwerperdrug, clozapine-N-oxide (CNO) 1 , 3. Omdat de experimentator is begiftigd met precieze, maar remote temporele controle over de neurale activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, farmacogenetica combineert bijzonder goed met gedragsproblemen paradigma's die worden uitgevoerd in meerdere fasen. In dit voorbeeld is de bijdrage van de retrospleniale cortex (RSC) naar stimulus stimulus learning vergeleken met zijn rol in Pavlov leren evenwel deze combinatie van benaderingen is zeer geschikt om een aantal vragen die proberen te bepalen hoe specifieke hersengebieden bijdragen aan complex gedrag.
Bovendien, terwijl in het onderhavige protocol beschreven, virale en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om type-specifieke cel DREADD expressie 2 bereiken. Zoals iks inherent aan gedragsparadigma's die farmacologische en / of andere vormen van experimentele manipulaties, zorgvuldige afweging van proefopzet en daaropvolgende kwantitatieve bepalingsmethoden kunnen nodig bij gebruik van de DREADD benadering. Onderzoekers nieuw voor de DREADD benadering worden verwezen naar een uitgebreid overzicht van de huidige DREADD technologie 2.
Dagelijks organismen informatie over nieuwe impulsen en gebeurtenissen en hun onderlinge relaties. Zelfs in een vertrouwde omgeving, zoals thuis, men snel veranderingen detecteren in de relatie tussen stimuli, die veranderingen voorspellende betekenisvolle gebeurtenissen zijn. Dergelijke stimulus-stimulus (ie, relationeel) leren betreft de samenvoegende van meerdere stimuli en is van oudsher geassocieerd met de hippocampus, die centraal woont binnen de mediale temporale kwab 4. Echter, de hippocampus niet bestaat of geïsoleerd optreden; corticale gebieden, zowel binnen als buitenkant van de mediale temporale kwab bieden kritische zintuiglijke informatie naar de hippocampus formatie 5-7. Traditionele permanent letsel studies dwingend bewijs voor de betrokkenheid van een aantal corticale gebieden (bijvoorbeeld de retrospleniale, postrhinal en entorhinale cortex) in hippocampus-afhankelijk leren, maar zijn beperkt in hun vermogen om de functie van een bepaald gebied te onderscheiden in afzonderlijke fasen leren 8-10.
Het onderhavige protocol test de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor stimulus-stimulus leren door silencing de RSC tijdens een fase van een 3-fasen sensorische preconditionering paradigma 11,12. In het kort, ratten infusies krijgen van een AAV dat de ontwerper receptor bevat en ~ 3 weken later toegediend de ontwerperdrug (CNO) 30 minuten voor aanvang van gedragsonderzoek. In het huidige protocol, experimentele ratten ontvangt CNO tijdens de eerste fase van het testen (als stimulus-stimulus learning optreedt) en ze het voertuig ontvangt gedurende de volgende 2 fasen van het testen. Om te controleren voor onbedoelde effecten van CNO op het gedrag, bezielen ratten met de ontwerper receptor (hM4Di) en injecteren met het voertuig in plaats van CNO. Om rekening te houden algemene gevolgen van virale infusie en receptor expressie, trekken een controlevirus dat de ontwerper receptor bevat en beheren CNO.
Een aantal verschillende serotypen van AAV worden gebruikt om genetisch materiaal. De huidige NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant of synthetische moleculen stelt dat AAV (alle serotypes) en recombinant of synthetische AAV constructen, waarbij het transgen niet of potentieel tumorigene genproduct of een toxine molecuul coderen en worden geproduceerd in afwezigheid van een helper virus, vereisen BSL-1 voorzorgsmaatregelen (Bijlage B-1. Risk Group 1 (RG1) gemachtigden) 13. Een aantal beoordelingen met betrekking tot de AAV structuur, het nut en de veiligheid zijn beschikbaar 14,15. Opmerkelijk is dat de, Als gevolg van bezorgdheid met betrekking tot mogelijke reproductie 16,17 potentiële carcinogene mechanismen 18-20 in knaagdieren, sommige instellingen vereisen het gebruik van BSL-2 bij het werken met AAV. Controleer de juiste BSL voor gebruik door overleg met de commissies van toezicht op individuele instellingen waar het onderzoek zal worden uitgevoerd, de Centers for Disease Control en de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA-moleculen 13 bij het gebruik van virale vectoren voor genetische manipulatie in de Verenigde Staten. Persoonlijke bescherming, onderzoeker opleiding, vector insluiting, ontsmetting, de verwijdering van ontsmet materialen, en post-injectie dierverblijven eisen worden gespecificeerd door deze richtlijnen. Bovendien, raadplegen en geschikte Institutional Animal Care en gebruik richtlijnen comité of gelijkwaardige richtlijnen institutionele commissie van toezicht op de veilige behandeling, het beheer en de verwijdering van AAV waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren worden goedgekeurd door het Oberlin College Institutional Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren 21.
1. Voorbereiding voor Virale Infusion
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van BSL-1 voorzorgsmaatregelen. Bij toepassing van BSL-2 voorzorgsmaatregelen, een wegwerp laboratoriumjas, handschoenen, schoenen covers, oog bescherming en een stofmasker (type N95) zijn verplicht. Alle individuen omgaan met BSL-2 verbindingen moeten passen getest voor een stofmasker door een lokale volksgezondheid agentschap. Raadpleeg Lowery & Majewska (2010) 22 voor meer informatie over de behandeling en opslag van virale vectoren.
- Bij het eerste gebruik, hoeveelheid en op te slaan ongebruikte virus in 20 ul microcentrifugebuizen herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden.
- Bereid het werkoppervlak van onnodige voorwerpen verwijderen en steriliseren van het oppervlak met 70% ethanol. Bereid een 10% bleekwater oplossing voor het reinigen van AAV afval. Plaats een beker vol van de bleekwater oplossing en een steriele 10 ul injectiespuit op het werkvlak. Plaats de microcentrifugebuis met de AAV in een container met crushed ijs tijdens set-up.
- Plaats de microcentrifugebuis met het virus in een standaard bankschroef. Laad een 10 gl spuit met tenminste 4 pl AAV. Let erop dat de punt van de spuit tegen de onderzijde van de microcentrifugebuis buigen tijdens het laden. Zorg dat er geen luchtbellen in de 4 gl AAV oplossing in de injectiespuit.
- Gooi de lege virus buis in de beker met 10% bleekmiddel. Bewaar ongebruikte delen van het virus, zoals gespecificeerd door de leverancier.
- Voeg extra 10% bleekwater naar de afvalcontainer, en laat afval te zitten voor 30 min voor het weggooien van de ontsmet vloeibaar afval.
- Gooi alle beschermingsmiddelen en plastic afval in een biohazard container in opdracht van institutionele richtlijnen. Decontaminate alle apparatuur en oppervlakken die in contact komen met het virus middels 10% bleekwater kwam.
2. Chirurgie
- Bereid de chirurgische gebied door het plaatsen van absorberend bankje papier onder de stereotaxische apparaat en op een aangrenzende ruimte aangewezen als een speciale virus handling gebied.
- Plaats een 10% bleekmiddel afvalcontainer in de speciale virus handling in de buurt van de chirurgische apparatuur.
- Leiden tot een stabiel niveau van de anesthesie en de voorbereiding van de rat voor een operatie.
- Plaats de rat in een inductiekamer met een mengsel van isofluraan gas (traject van 1-3%) en zuurstof (100% bij ongeveer 1 l / min) bevat totdat er een verlies van bewustzijn en gebrek aan grove doelgerichte beweging. Handhaaf isofluraan anesthesie gedurende de chirurgische procedure.
- Na 6 diepe narcose is bereikt, scheren de rat van tussen de ogen om iets achter de oren.
- Plaats de rat weer in de inductie kamer voor eenAanvullende 1-3 min.
- Controleer of de isofluraan anesthesie is aangesloten op de neuskegel van de stereotaxische chirurgie. Open de plugkraan op de isofluraan buis om de stroom van isofluraan de stereotax beginnen. Handhaving van de isofluraan en zuurstof op het hierboven aangegeven niveau.
- Plaats de rat in een stereotaxische apparaat door het veiligstellen van de mond naar de beet bar en het veiligstellen van het oor bars.
- Breng oogzalf voor de ogen en betadine op de chirurgische lokatie vóór incisie.
- Wordt 2,4 cm middellijn incisie van de huid op het dorsale oppervlak van de schedel vanaf ongeveer 2 mm caudaal van de ogen. Trek de huid aan de schedel bloot te leggen. Periodiek inboezemen steriele 0,9% steriele zoutoplossing in de marge van de chirurgische site om weefsel van uitdroging te voorkomen.
- Clear membraneuze weefsel van de schedel tot bregma en lambda zijn duidelijk zichtbaar.
- Zorg ervoor dat de schedel is niveau door het meten van de dorsale-ventrale coördinaten opbregma en lambda. Stel het stereotaxische apparaat dienovereenkomstig tot dorsale-ventrale coordinaten bregma en lambda verschillen niet meer dan 0,04 mm.
- Op dit moment beperken de isofluraan gas tussen 2 en 2,5%.
- Zet de boormachine aan bregma, ReZero de coördinaten en verplaats de boor op de gewenste mediale-laterale en de voorste-achterste coördineren.
- Boor een gat in het coördineren van het gebruik van een 0,9 mm boor als het produceert een passende omvang gat voor een 28 G infuus spuit.
- Stel de infusiepomp tegen virus te leveren met een snelheid van 0,2 ul / min. Plaats de injectiespuit in de arm infusie van het stereotaxische apparaat en laat de spuit in de gewenste coördinatie. Levert de gewenste hoeveelheid virus (spreiding 0,1-0,8 pl). Zo levert 0,8 gl AAV dan 4 min.
Opmerking: voeren proefonderzoeken het ideale infusievolume en de typische verspreiding van virus in elk gebied van belang te bepalen.- Na levering van virus complete laat de spuit in de plaats voor 10 min om terugstromen in de naald-darmkanaal te voorkomen. Langzaam verhogen van de spuit met een snelheid van ongeveer 5 mm / min. Herhaal dit tot alle coördinaten zijn doordrenkt met AAV.
- Sluit de wond met chirurgische nietjes en de vacht van de wond met actuele antibiotische zalf.
- Volg de institutionele richtlijnen voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Plaats de rat in een kooi met beddengoed, een deksel en een goede bewegwijzering en de terugkeer van de rat om het dier faciliteit.
- Als het werken onder BSL-2 voorzorgsmaatregelen, verzamel beddengoed voor de hoeveelheid tijd (meestal 48-72 uur) die door institutionele richtlijnen. Plaats beddengoed in een biologisch gevaarlijk afval container.
- Gooi alle AAV-verontreinigde materialen zoals gespecificeerd door richtlijnen voor veilige verwijdering.
3. Behavioral Apparatuur
Opmerking: De sensorische preconditionering apparaat bestaat uit een standaard operante conditionering chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) met een roestvrij stalen rooster vloer, 2 Plexiglas zijwanden en 2 metalen wanden.
- Monteer een 2,8 W licht op een van de aluminium wanden om te dienen als het huis licht en de visuele stimulus toen flitste op 2 Hz. Monteer een luidspreker op de kamer naar de auditieve stimuli te leveren (10 sec, 1500 Hz, 78 dB zuivere toon en een 10 sec 78 dB witte ruis).
- Gebruik een voedsel hopper tot 45 mg voedsel pellets leveren in het voedsel beker. Binnen het voedsel kopje, infrarood fotocellen de totale tijdsduur in het voedsel kopje vóór, tijdens en na presentatie van stimuli en levensmiddelen punten.
- Het huis van de kamers in-geluiddempende kasten (22 "W x 22" H x 16 "D) uitgerust met afzuigventilatoren (~ 68 dB).
- Gebruik een PC computer met Med Associates software om de operante kamer van de gegevens te controleren en te verwerven. Tijdens de sessies Conditioning, data te verzamelen over de totale tijd doorgebracht met het hoofd in het voedsel beker tijdens presentatiestie van het licht stimulus (5 sec tijdperk) en tijdens de presentatie van het eten beloning (5 sec tijdperk). Tijdens de testsessie gegevens verzameld over de totale tijdsduur in de voedselkop in reactie op de presentatie van auditieve stimuli (10 sec epoch begin als de auditieve stimuli worden beëindigd).
4. Overzicht van de Sensory Voorconditionering Paradigm
- Na herstel van de operatie geleidelijk voedsel beperken ratten 85% van het voedingssysteem lichaamsgewicht. Raadpleeg veterinaire personeel naar een geschikte voedsel beperking paradigma.
Noot: De 3-fasen sensorische preconditionering paradigma is weergegeven in figuur 2. - Preconditionering Sessions (fase 1; Daily 64 min trainingssessies uitgevoerd over 4 opeenvolgende dagen):
- Present ratten met 12 vermengd proeven die bestaan uit de levering van auditieve en visuele stimuli. Omvatten inter-proces intervallen die na elk een gemiddelde van 4,5 min (range 4,0-5,0 min)uditory presentatie.
- Op 6 van de proeven, het heden een toon (geconditioneerd stimulus) gedurende 10 sec, onmiddellijk gevolgd door een 5 sec presentatie van het knipperlicht stimulus.
- Aan de andere 6 proeven, presenteren de witte ruis (ongepaard stimulus) alleen al voor 10 sec.
- Conditioning sessies (fase 2; Daily 64 min trainingssessies uitgevoerd over 5 opeenvolgende dagen):
- Present ratten met 8 proeven die bestaan uit de levering van de visuele stimulus (het knipperlicht stimulus) voor 5 sec onmiddellijk gevolgd door levering van twee 45 mg voedsel pellets. Omvatten inter-proces intervallen die gemiddeld 7 min (range 6,0-8,0 min) na elke proef. Af en ratten vereisen meer dan 5 conditioning sessies om het licht voedsel vereniging leren.
- Test Session (fase 3, een enkele 78 min sessie):
- Presenteer de ratten met 12 vermengd proeven die bestaan uit de levering van de auditieve stimuli alleen. Omvatten inter-proces intervallen die average 4,5 min (range 4,0-5,0 min) na elke auditieve presentatie.
- Op 6 van de proeven, presenteren de toon stimulus (de geconditioneerde stimulus) alleen al voor 10 sec.
- Aan de andere 6 proeven, presenteren de witte ruis (de ongepaarde stimulus) alleen al voor 10 sec.
- Tegenwicht de stimuli door het invullen van de studie met een tweede set van ratten die de witte ruis als geconditioneerd stimulus en de toon als het ongepaarde stimulans krijgen.
5. farmacologische en Behavioral Procedure
- Schakel de stroom naar de gedrags-apparaat en laad de Med-PC-code voor de juiste gedrags-sessie. Draad en het programma van de behavioral apparaat zodanig dat de fans die op de geluiddempende kasten zijn gemonteerd ingeschakeld wanneer de stroom wordt ingeschakeld.
- Een 1 mg / ml oplossing van clozapine N-oxide (CNO) te bereiden, weeg 5,0 mg CNO in een 15 ml conische buis en voeg 5 ml steriel water en 5 ml van een steriele 0,9% saline. Vortex tot de oplossing helder is.
- Als CNO niet oplost in oplossing of meer geconcentreerde oplossingen van CNO gewenst voeg een oplosbaar makend middel zoals DMSO 23. Specifiek, een 1 mg / ml oplossing van CNO bereiden met 0,5% DMSO Weeg 5,0 mg CNO en voeg 25 pl van DMSO tot een 15 ml conische buis. Flick voorzichtig waarborgen dat de inhoud blijven op de onderkant van de buis. Wanneer de oplossing helder, voeg 5 ml steriel water en 5 ml van een steriele 0,9% zoutoplossing. Verdere instructies voor het bereiden van oplossingen van CNO zijn beschikbaar op de DREADD wiki resource pagina 25.
- Bereid een nieuwe CNO oplossing elke dag dat het wordt toegediend.
- Injecteer de CNO intraperitoneaal in een dosis van 1 mg / kg op ongeveer 30 minuten voor gedragstesten. Bijvoorbeeld Injecteer 200 g rat met 0,2 ml van de 1 mg / ml CNO oplossing. De dosis en tijdsverloop van CNO administratie werden geselecteerd op basis van eerder gepubliceerde rapporten 2,12.
- Injecteer CNO 30 min voor elke preconditionering zitting (Fase 1, totaal 4 dagen na injectie) maar vóór het voertuig dienen aan alle volgende behavioral sessies.
- Na 30 min, plaatst de ratten in de gedragstesten kamers en inleiding van de computercode voor het betreffende gedrags- sessie.
- Na voltooiing van de gedragstaak, onmiddellijk de ratten uit de kamers en de terugkeer van de ratten aan het dier kolonie.
6. Analyses van Behavioral gegevens
Opmerking: De afhankelijke variabele voor gedrags sessies de tijdsduur dat het hoofd van de rat is in de voedselkop zoals gedetecteerd door onderbreking van de infrarode fotocellen in het voedselkop. De data (in sec) wordt verzameld en geregistreerd door de computer software.
- Niet uit te voeren analyses over de gegevens die tijdens de conditioneringsfase.
- Voor de conditionering sessies: analyseert elke ratten 'eenheid aan het licht voedsel vereniging leren door voedsel gedrag cup te vergelijken tijdens de presentatie van de visuele stimulus over de 5 behavioral sessies. Specifiek, het berekenen van de gemiddelde tijd doorgebracht in het voedsel beker tijdens de 5 sec licht tijdperk voor elk van 8 proeven / sessie (dwz een gemiddelde van 8 proeven die elk 5 sec duur / rat). Vergelijk gemiddelde controle en experimentele waarden voor elk van de 5 dagelijkse sessies (zie figuur 3A).
- Analyseer de motivatie van de ratten 'om voedsel te belonen verkrijgen door voedsel gedrag cup te vergelijken tijdens de levering van het voedsel beloning (5 sec tijdperk) over de 5 gedragstherapie sessies met behulp van dezelfde berekening als opgegeven voor de 5 sec licht tijdperk boven. Deze waarden zullen constant hoger dan die tijdens de presentatie van de visuele stimulus verworven (zie figuur 3B).
- Voor de testsessie: berekenen discriminatie verhouding die voedsel kopje gedrag van de ratten 'beschrijft in reactie op de presentations van elke auditieve stimulus.
- Specifiek voor elke rat, verdeelt de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de sensorische geconditioneerde stimulus (dwz de toon) door de som van de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de zintuiglijke voorgeconditioneerde stimulus (ie, de toon stimulus) plus het gemiddelde van de totale tijd doorgebracht in het voedsel beker na elk van 6 presentaties van de ongepaarde stimulus (ie, de witte ruis stimulus). Elk tijdvak is 10 seconden duren.
Opmerking: Een discriminatie score van 0,5 of hoger toont aan dat ratten leerden de verenigingen die inherent zijn aan het zintuiglijke preconditionering paradigma.
- Specifiek voor elke rat, verdeelt de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de sensorische geconditioneerde stimulus (dwz de toon) door de som van de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de zintuiglijke voorgeconditioneerde stimulus (ie, de toon stimulus) plus het gemiddelde van de totale tijd doorgebracht in het voedsel beker na elk van 6 presentaties van de ongepaarde stimulus (ie, de witte ruis stimulus). Elk tijdvak is 10 seconden duren.
7. Verificatie van AAV Plaatsing en Expression
- Verdoven en perfuseren de ratten transcardiaal met 4% paraformaldehyde. Door het gebruik van fluorescente labels, niet meer dan een post-fixatie periode van 2 uur tot minimize verlies van antigeniciteit en het fluorescentiesignaal te behouden.
- Uitdrogen geperfuseerd hersenen door ze in hersenen pot met 30 ml van een 20% sucrose-oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x) gedurende minstens 2 dagen of totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de pot hersenen.
- Gebruik een koude glijdende microtoom coronale hersensecties (20-40 urn) maken het gehele rostrocaudale omvang van het gebied van belang.
- Voer immunohistochemie tegen de gemerkte receptor of reporter proteïne om de locatie en expressie van de ontwerper receptor en / of reporter 12 bepalen. Een immunohistochemie kleuringsprotocol is voorzien op het DREADD wiki resource pagina 25.
- Monteer de onderdelen op SuperFrost-plus dia's en dekglaasje met 100-200 ul van een waterige montage medium.
- Voer fluorescentiemicroscopie op hersenweefsel te AAV plaatsing en eiwitexpressie 12,24 controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behavioral resultaten
Na voltooiing van het experiment, zou de doeltreffendheid van de regiospecifieke tijdelijke inactivatie kwantitatief en kwalitatief worden beoordeeld. Het onderhavige voorbeeld heeft betrekking op een 3-fasen behavioral paradigma (sensorische voorconditionering), waarbij CNO werd toegediend aan neurale activiteit in de RSC verzwakken Tijdens de voorbereiding heeft tot de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor de vorming van associaties tussen neutrale stimuli 12 testen. Belangrijk is dat onderzoekers niet beperkt tot de gedrags- paradigma of proefontwerp hierin beschreven als het farmacogenetische benadering kan worden gecombineerd met de meeste gedragsparadigma's.
Overwegende dat de analyses worden meestal niet uitgevoerd op de gegevens die tijdens de Voorconditionering sessies (fase 1), is het belangrijk te kwantificeren of ratten leerden het licht voedsel vereniging tijdens de Conditioning sessies (fase 2). Zoals getoond in Figuur 3A, zowel experimentele (Expt) en Control (Ctrl) ratten aantonen stijgende voedselprijzen gedrag kopje tijdens presentaties van het licht stimulus (figuur 3A) dat aangeeft dat ratten verwierf een Pavlov-associatie tussen de visuele stimulus (licht) en het eten beloning. Daarnaast demonstreren beide groepen stijgende voedselprijzen gedrag kop tijdens de presentatie van het voedsel beloning (figuur 3B) aangeeft gelijk motivatie om beloning te krijgen. Tijdens de kritische testsessie, wanneer de auditieve stimuli worden in de afwezigheid van andere stimuli, controleratten een discriminatie score die sterk afwijkt van experimentele ratten (Figuur 3C). Visuele inspectie van de grafiek blijkt dat de gemiddelde verhouding van discriminatie controleratten groter is dan 0,5, richting meer voedselkop gedrag in reactie op de presentatie van auditieve stimulus die is gekoppeld met het licht (in Voorbehandeling) in vergelijking met hun voedselkopgedrag in reactie op de presentaties van de auditieve stimulus die werd hebt ontkoppeld (tijdens Voorconditionering). In tegenstelling, experimentele ratten niet tot een verschil score die hoger is dan de kans te tonen. Zo Figuur 3C toont aan dat controle, maar niet de experimentele ratten toonde de zintuiglijke preconditionering effect.
Verificatie van AAV Placement
Bij de voltooiing van gedragstesten analyseren rat hersenweefsel juiste plaatsing en expressie van de ontwerper receptor. Conduct immunohistochemie 12,25 behulp primaire antilichamen gericht tegen een receptor label (bijvoorbeeld een anti-HA primair antilichaam) of fluorescente reporter (in dit voorbeeld mcitrine die wordt gedetecteerd door een antilichaam voor Green Fluorescent Protein (GFP)). Een schema van een coronale doorsnede door de rattenhersenen is getoond in figuur 4A. Figuur 4B illustreert robuuste fluorescente immunodetectie van de reporter prot. ein in de RSC in een representatieve experimentele rat zonder fluorescerend label gedetecteerd in de omliggende regio's figuren 4C - D illustreren representatief fluorescerende etikettering van reporter eiwitten in experimentele (Expt; ratten werden toegediend met een AAV-construct dat de ontwerper receptor-gen en de mcitrine gen ) en controle (Ctrl; ratten werden gemengd met een gelijke AAV-construct dat het GFP-gen maar geen sequentie voor de ontwerper receptor) ratten, resp. Receptor niveaus kunnen ook worden weergegeven als minimum, representatief en maximale expressie 24. Als labeling wordt gedetecteerd in gebieden buiten het interessegebied, sluiten deze gegevens uit de gedragsanalyses.
Figuur 1. Schematische weergave van de AAV construct Een diagram van de hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV gebruikt expruk op de remmende ontwerper receptor (hM4Di) onder een specifieke neuronale synapsin promotor (hSyn) bij RSC neuronen. Immunofluorescentie reporters (HA-tag en / of mcitrine) kunnen worden gebruikt om expressie van het eiwit en reporter visualiseren, respectievelijk. hSyn menselijke synapsin promotor; specificeert expressie in neuronen. HA, hemagluttinin tag; Deze tag gefuseerd aan de ontwerper receptor en dient als een epitoop tag waardoor detectie van receptor expressie. hM4Di, het gen voor de ontwerper remmende G-proteïne gekoppelde receptor. IRES, interne ribosoom ingang site; laat de verslaggever (mcitrine) te vertalen. mcitrine, een fluorescerende reporter die een variant van GFP maar is beter bestand tegen fotobleken.
Figuur 2: Schematische weergave van de zintuiglijke preconditionering paradigma (A) Tijdens de voorbereiding sess.ionen worden 12 vermengd trials gepresenteerd. Bij 6 van de proeven, is een auditieve stimulus gepresenteerd voor 10 sec onmiddellijk gevolgd door een knipperend huis licht stimulus (2 Hz, gedurende 5 sec). Tijdens de overige 6 onderzoeken wordt een tweede auditieve stimulus aangeboden zonder een visuele stimulus. (B) Tijdens de Conditioning sessies wordt de eerder gekoppelde visuele stimulus gecombineerd met voedsel beloning. (C) Tijdens de testsessie, zijn er 12 vermengd presentaties van de twee auditieve stimuli in de afwezigheid van visuele stimuli of voedsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Behavioral resultaten Gemiddeld eten cup reageert tijdens de (A) Licht en (B) Eten tijdperken during de Conditioning sessies (fase 2). Gegevens werden geanalyseerd met herhaalde metingen variantieanalyse. (C) Discriminatie verhoudingen tijdens de testsessie (fase 3). De stippellijn geeft gelijke hoeveelheden geconditioneerd voedselkop reageren op elke auditieve stimulus (dwz zonder sensorische preconditionering) Gegevens werden geanalyseerd middels onafhankelijke T-toets. Expt; experimentele ratten (n = 17) toegediend met een AAV-construct dat de DNA-sequentie voor de remmende G-eiwit gekoppelde receptor designer (hM4Di) en de DNA-sequentie voor een fluorescerende reporter (mcitrine). Ctrl; controleratten (n = 6) toegediend met hM4Di en toegediend tesamen met controleratten (n = 4) toegediend met een AAV virus dat de ontwerper receptor bevat en die toegediend CNO. Controle groepen verschilden niet significant van elkaar (p> 0,05). Error bars geven ± SEM.
Figuur 4: Histologische verificatie van eiwitexpressie (A) een schematische illustratie van de locatie van de RSC in een coronale doorsnede door de rattenhersenen.. (B) Representatieve beelden van immunohistochemisch gelabeld rat hersenweefsel van een experimentele rat (Expt) die is doordrenkt met een AAV-construct dat de DNA-sequentie voor de remmende G-eiwit gekoppelde receptor designer (hM4Di) en de DNA-sequentie voor een fluorescerende reporter ( mcitrine). mcitrine is een zeer fade-resistente variant van groen fluorescerend eiwit. (C) representatief beeld van een experimentele rat toont de locatie van de reporter fluorescente label (mcitrine). (D) representatief beeld van een controle-rat (Ctrl) doordrenkt met een AAV-construct dat de DNA-sequentie voor een fluorescerende reporter (enhanced GFP). Schaal bars: B, 500 micrometer; C en D, 10081, m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe een farmacogenetische benadering (DREADD) zijn van toepassing om te onderzoeken hoe een specifieke regio hersenen draagt bij aan een multi-fase complexe leertaak. Met de mogelijkheid om tijdelijke neurale activiteit op afstand zwijgen in discrete hersengebieden over leerfasen combinatie van deze benaderingen is een platform waarop een verschillende gedragingen, zoals meer genuanceerd of gemaskeerde vormen van leren onderzoeken. In de in dit protocol beschreven voorbeeld controle ratten en ratten die de ontwerper receptor in de retrospleniale cortex (RSC) tot expressie werden getest in een 3-fasen gedragstaak 12. De eerste fase van de betrokken taak voorstelling van meerdere neutrale stimuli waarbij wordt verondersteld dat controleratten zou een stimulus-stimulus associatie tussen twee stimuli te verkrijgen. De werkhypothese is dat RSC noodzakelijk voor stimulus-stimulus leren dus op elk van 4 dagen conditionering, 30 minuten voor aanvang van gedragstesting, controle en experimentele ratten kregen systemische toediening van ofwel de designer drug (CNO) of voertuig. Wanneer gebonden aan de ontwerper receptor, CNO vermindert de activiteit van neuronen waarin deze receptor tot expressie wordt gebracht. Gedurende de overige fasen van gedragsconditionering en testen, wanneer het RSC niet wordt verondersteld te beïnvloeden leren, werd CNO niet toegediend en dus neurale activiteit niet gestoord.
Kritische Stappen binnen het Protocol
Veilig hanteren van verbindingen AAV: Chirurgische procedures die bij de farmacogenetische benadering niet technisch veeleisender dan een eenvoudige stereotaxische infusie, is het gebruik van AAV bij sommige instellingen vereist dat onderzoekers zich aan BSL-2 voorzorgsmaatregelen. Het is cruciaal dat de onderzoekers volgen de door de Centers for Disease Control, financiers, thuis instellingen en andere commissies van toezicht specifiek zijn voor hun onderzoeksprogramma richtlijnen. Informatie over the veilig hanteren van AAVs is direct beschikbaar 13.
Bereiding en toediening van de designer drug: CNO, de designer drug, bindt aan de receptor en designer stiltes neurale activiteit, maar is verder biologisch inert 1,3. Overbrenging van CNO van leveranciers kunnen variëren in consistentie. De verbinding moet komen als een poeder dat niet is gehecht aan de zijden van de container.
Belangrijke controlegroepen te overwegen: Om te bepalen voor niet-specifieke effecten van de ontwerperdrug vóór gedragstesten, trekken een andere reeks experimentele ratten (dat wil zeggen, die de ontwerper receptor tot expressie) injecties met drager in plaats van CNO. Bovendien, om controle voor niet-specifieke effecten van de ontwerper receptor omvatten een groep ratten die zijn doordrenkt met een controle virus dat een fluorescerende reporter maar niet de gewijzigde designer receptor bevat en injecteer deze ratten met ontwerperdrug (dwz CNO) . Ensure adequate experimenteel ontwerp door tegenwicht tegenover groepen.
Het verifiëren van expressie van het construct: Er zijn een aantal manieren om de expressie en detectie van de ontwerper receptor maximaliseren. Voorafgaand aan infusie, controleren of de virale titer in de buurt 10 12 deeltjes / ml. Vaak visualisatie van de fluorescente reporter laag en derhalve verdient het aanbeveling immunohistochemie worden uitgevoerd op het gebied van belang met behulp van antilichamen gericht tegen de reporter (s) in het virale construct 25. In dit voorbeeld, anti-GFP immunoreactiviteit verschaft een sterk signaal (figuur 4B - D). Belangrijk is, vanwege de aard van fluorescente labels, beperken de duur van fixatie tijd 2 uur.
Voordelen van de Technieken
Eens de virale construct naar de hersenen via stereotaxische chirurgie is geleverd, de farmacogenetische aanpak maakt het mogelijk voor de tijdelijke inactivatie hersenactiviteit in discrete gebieden met behulp van een minimaal invasieve systemische injectie van het ontwerperdrug. Geneesmiddeltoediening kan herhaaldelijk optreden, wat gunstig is voor behavioral taken die zich voordoen over opeenvolgende dagen of weken 12,24,26. Verder bewijsmateriaal wijst erop dat de designer drug (CNO) niet interfereert met motorische gedrag of eetlust 27,28. Aldus verschaft de werkwijze de mogelijkheid om neurale activiteit verzwakken gedurende een korte tijd (2-5 uur), maar vermijdt de stressoren inherent zijn andere werkwijzen voor tijdelijke inactivering. Met name in canulatie studies, wordt tijdelijk inactivatie bereikt door levering van neurotoxins door middel van canules die permanent worden bevestigd aan de schedel. Deze benadering is beperkt in dat het houden van de canule vrij van afval en beschermd is uitdagend. Bovendien inactiviteit veroorzaken, dieren worden uitgebreid behandeld (om de toxine door de canules te beheren) net voor gedrags testen, which legt de nadruk op het dier verhoogt ook de kans dat canules kan losraken van de schedel. Omdat de effecten van CNO relatief korte termijn de mogelijkheid van compenserende mechanismen langdurige (zoals die waargenomen na permanente laesies of genetisch gemodificeerde muizen) geminimaliseerd 29,30.
Beperkingen van de Technieken
DREADD is een relatief nieuwe werkwijze niet-invasief verzwakkende neuronale activiteit. Als zodanig onderzoekers geneigd om zelfstandig te controleren of neuronale silencing optreedt in hun voorbereiding. Verificatie kan worden uitgevoerd onder toepassing van elektrofysiologische methodes, maar deze experimenten zijn tijdrovend, kostbaar en vereisen specifieke deskundigheid. Bovendien, terwijl chemogenetic technieken minder kostbaar dan optogenetics, de benadering is duurder dan traditionele inactivering farmacologische middelen zoals TTX. Een andere beperking van de DREADD benadering is dat Infusion van de virale constructen niet tot 100% infectie van neuronen in het interessegebied, noch inactivering via CNO leiden tot 100% reductie van neuronale activiteit. Ten slotte kan een aantal AAV serotypen retrogradely worden vervoerd die kunnen bemoeilijken de interpretatie van de experimentele resultaten 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken de auteurs van Robinson et al. 12 voor hun bijdragen aan het manuscript van waaruit dit protocol is gedeeltelijk afgeleid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
