Abstract
Этот протокол описывает, как временно, так и удаленно заглушить нейронную активность в дискретных областях головного мозга, а животные занимаются обучения и памяти задач. Подход сочетает в себе фармакогенетика (Дизайнер-Рецепторы-Эксклюзивно-активированный-на-Designer-препараты) с поведенческой парадигмы (сенсорной) предварительной, которая предназначена для дифференциации между различными формами обучения. В частности, вирусной опосредованной доставки используется, чтобы выразить генетически модифицированных тормозящее G-белком рецептор (рецептор конструктор) в дискретной области головного мозга в грызуна. Через три недели, когда уровни экспрессии рецепторов дизайнер высоки, фармакологический агент (наркотика) вводят системно 30 мин до определенной поведенческой сессии. Препарат обладает сродством к рецептору дизайнера и, таким образом, приводит к ингибированию нейронов, которые экспрессируют рецептор конструктора, но в остальном биологически инертным. Область мозга остается замолчать в течение 2-5 ч (висимостьдинь от дозы и пути введения). После завершения поведенческой парадигмы, ткани мозга оценивали для правильного размещения и экспрессии рецепторов. Этот подход особенно полезен для определения вклада отдельных областей мозга в конкретных компонентов поведения и может быть использован в любом числе поведенческих парадигм.
Introduction
Захватывающая задача в области поведенческой неврологии является определение нейронных субстратов сложным поведением. Количество таких методов, как постоянных поражений, временный инактивации мозга через канюли имплантатов и оптогенетика были использованы для идентификации вклад дискретных областей мозга, чтобы подкомпонентами сложным поведением. Хотя эти подходы наше понимание региональной специфики в ходе обучения, каждый метод не без ограничений. В частности, постоянные поражения, как правило, проводиться до поведенческим тестированием, таким образом, их действие присутствует в течение всего периода парадигмы. Катетеризация исследования, которые включают представление краткосрочной нервной инактиватора (например, тетродотоксин) может производить значительный ущерб ткани мозга и могут вызвать стресс у субъектов только до поведенческого тестирования. Кроме того, инактивации через канюлю ограничено области ткани, которая окружаетКончик канюли. Наконец, в то время как оптогенетика предлагает широкий выбор гибкости для временной контроля деятельности в конкретных областях мозга, она является экономически и технически непомерно требовательных.
Эти ограничения могут быть преодолены с помощью фармакогенетический подход (дизайнер-рецепторов-Исключительно активированные-на-Designer-наркотики, DREADDs) 1,2. Важно отметить, что в то время как концепция фармакогенетики является сложной, выполнение техники проста. Подобно традиционным стереотаксических хирургических методов, которые включают вливание токсина (например, NMDA, иботеновой кислоты) в дискретных областях головного мозга, этот метод включает привнесение в аденоассоциированный вирус (AAV), который содержит ДНК-фрагмент, модифицированный ингибирующее G-белком рецептор (hM4Di; дизайнер-рецептор) в области интереса стандартных лабораторных грызунов (рисунок 1). Вирусный вектор также содержит флуоресцентный репортер (mcitrine). После того, как включены вк клеткам, проектировщик рецепторов (и репортерный белок) максимально выражены ~ 3 недели после инфузии, и может быть избирательно активированы в течение 2-5 ч при системном введении в противном случае биологически инертного наркотика, клозапин-N-оксида (CNO) 1 3. Потому что экспериментатор наделен точной, но удаленной временной контроль над нервной деятельности в конкретных областях мозга, фармакогенетика сочетает особенно хорошо с поведенческими парадигмами, которые проводятся в несколько этапов. В этом примере, вклад ретроспленальной коры (РКК) на стимул-раздражитель обучение по сравнению с его ролью в павловской обучения, однако это сочетание подходов, хорошо подходит для любого количества вопросов, которые стремятся определить, каким образом конкретные области мозга способствуют сложное поведение.
Кроме того, в то время как не описано в данном протоколе, вирусные и трансгенные подходы могут быть использованы для достижения типа клеток конкретных DREADD выражение 2. Как и яс присущ поведенческих парадигм, которые включают фармакологические и / или другие типы экспериментальных манипуляций, тщательного рассмотрения эксперимента и последующего количественного анализа требуется при использовании подход DREADD. Экспериментаторы новые для подхода DREADD называют всеобъемлющего обзора современных технологий DREADD 2.
Каждый день, организмы узнать о новых стимулов и событий и их отношений друг к другу. Даже в знакомой среде, такие как дом, один быстро обнаружить изменения в отношениях между стимулами, потому что эти изменения могут быть предиктором значимых событий. Такой стимул-раздражитель (т.е., реляционная) обучения включает в себя conjoining нескольких стимулов и традиционно ассоциируется с гиппокампе, который находится в центре в медиальной височной доле 4. Тем не менее, гиппокамп не существует ни действовать в одиночку; области коры как в пределах и внесторона медиальной височной доле обеспечить критическую сенсорную информацию к гиппокампа 5-7. Традиционные постоянные исследования поражения убедительно доказательства причастности ряда корковых областей (например, ретроспленальной, postrhinal и энторинальной коры) в гиппокампе зависит от обучения, но ограничены в своей способности различать роль конкретного региона в дискретных фаз обучение 8-10.
Настоящий протокол проверяет гипотезу о том, что РКК необходимо для стимула стимула обучения по замолчать RSC во время одной фазы в 3-фазных сенсорная предварительной подготовки парадигмы 11,12. Вкратце, крысам настои из AAV, который содержит конструктор рецептор и ~ 3 недели вводят дизайнер наркотиков (CNO) за 30 мин до начала поведенческого тестирования. В настоящем протоколе, экспериментальные крысы получали CNO в ходе первого этапа тестирования (когда стимул-раздражитель ЛирНин происходит), и они получают автомобиль в течение следующих 2 фазы тестирования. Для контроля непреднамеренных последствий CNO на поведение, настоять крыс с дизайнером рецептора (hM4Di) и ввести с автомобиля, а не CNO. Для учета общего влияния вирусной инфузии и экспрессии рецепторов, настоять вирус управления, не содержит конструктор рецептор и управлять CNO.
Ряд различных серотипов AAV используются для доставки генетического материала. Текущие NIH Руководство для исследований с участием рекомбинантных или синтетических молекул утверждает, что AAV (всех серотипов) и рекомбинантных или синтетических AAV конструкции, в которых трансген не кодирует либо потенциально онкогенного генный продукт или молекулы токсина и производятся в отсутствие помощник вирус, требуют BSL-1 предосторожности (Приложение B-1. Группа риска 1 (Rg1) Агенты) 13. Количество отзывов, относящихся к структуре AAV, полезности и безопасности доступны 14,15. Примечательно, хотя, Из-за проблем, связанных с возможными репродуктивных 16,17 и потенциальных канцерогенных механизмов 18-20 у грызунов, некоторые учреждения требуют использования BSL-2 меры предосторожности при работе с AAV. Убедитесь в правильности BSL до использования путем консультаций с комитетами по надзору в отдельных учреждениях, где проводятся такие исследования, Центры по контролю за заболеваниями и НИЗ Руководства для исследований с участием рекомбинантных ДНК Молекулы 13 при использовании вирусных векторов для манипуляции генов в Соединенных Штатах. Личная защита, следователь подготовки, вектор сдерживания, обезвреживание, размещение в очищенных материалов, и после инъекции животных требования на жилье указаны в этих руководящих принципов. Кроме того, консультации и следуйте соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета руководящие принципы или эквивалентные руководящие организационные Комитет по надзору для обеспечения безопасной обработки, управления и распоряжения AAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных утверждаются Оберлин колледжа Уходу за животными и использованию комитета и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных 21.
1. Подготовка к вирусным инфузии
Примечание: Этот протокол использует BSL-1 меры предосторожности. При использовании BSL 2-предосторожности, одноразовый халат, перчатки, бахилы, глаз защиты и респиратор частиц (типа N95) требуется. Все лица обработки BSL-2 соединения должны быть проверены на соответствовать респиратор частиц местным агентством общественного здравоохранения. Обратитесь к Лоури и Majewska (2010) 22 для получения дополнительной информации по обращению с и хранению вирусных векторов.
- После первого использования, аликвоты и хранить неиспользованные вируса в 20 мкл микропробирок, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания.
- Подготовьте рабочую поверхность, удалив ненужные объекты и стерилизации поверхности 70% -ным этанолом. Подготовьте 10% раствор хлорной для обеззараживания отходов AAV. Поставьте стакан, полный решения отбеливателя и стерильной 10 мкл шприц на рабочую поверхность. Поместите трубку микроцентрифужных с AAV в контейнере с колотым льдом во время установки.
- Поместите трубку микроцентрифужных с вирусом в стандартной тисках. Загрузка 10 мкл шприц с по крайней мере 4 мкл AAV. Позаботьтесь, чтобы не согнуть кончик шприца против нижней части трубки микроцентрифужных во время загрузки. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков в 4 мкл AAV раствора в шприце.
- Утилизацию пустой трубы вируса в химический стакан, содержащий 10% хлорной извести. Храните неиспользованные вируса, как указано поставщиком.
- Добавить дополнительную 10% отбеливателя контейнер для отходов, и позволяют отходы сидеть в течение 30 мин перед утилизацией Очищенное жидких отходов.
- Утилизировать все защиты и пластиковых отходов в контейнер для биологически опасных по поручению институциональных принципов. Декоntaminate любое оборудование или поверхности, которые пришли в контакт с вирусом, используя 10% отбеливатель.
2. Хирургическое
- Подготовка хирургического области путем размещения абсорбирующего скамейке бумагу под стереотаксической аппарата и околоземного космического пространства назначенного в качестве специальной области обработки вирус.
- Поставьте контейнер 10% отбеливателя отходов в специальном районе обработки вирус возле хирургического аппарата.
- Вызвать устойчивый уровень анестезии и подготовить крысу к операции.
- Поместите крысу в индукционной камере, содержащей смесь изофлуран газа (от 1 до 3%) и кислорода (100% примерно 1 л / мин) до тех пор, пока не будет потеря сознания и отсутствие грубой целенаправленное движение. Поддержание анестезии Isoflurane всей хирургической процедуры.
- После 6 глубоко анестезия достигается, брить крысу от между глазами слегка позади ушей.
- Поместите крысу обратно в индукции камеры длядополнительная 1-3 мин.
- Убедитесь, что система ИФ анестезии подключен к носовой конус стереотаксической хирургии. Откройте кран на изофлурана трубки, чтобы начать поток изофлураном к stereotax. Поддерживать изофлурана и кислорода на уровнях, указанных выше.
- Поместите крысу в стереотаксической аппарата по обеспечению рот на панели укуса и обеспечения уха баров.
- Применить глаз смазку для глаз и бетадин к хирургическому сайте до разреза.
- Сделать 2,4 см срединный разрез кожи на спинной поверхности черепа, начиная примерно 2 мм хвостовой глаз. Уберите кожу, чтобы выставить череп. Периодически привить стерильный 0,9% стерильного физиологического раствора на полях хирургического сайта, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
- Ясно мембранной ткани из черепа до темени и лямбда четко видны.
- Убедитесь, что череп уровень путем измерения спинной-вентральной координат вбрегма и в лямбда. Отрегулируйте стереотаксической устройства, соответственно, до тех пор, спинной-вентральной координаты в темени и лямбда не отличаются не более чем на 0,04 мм.
- В это время, уменьшить изофлуран газа в диапазоне от 2 до 2,5%.
- Вернуться дрель для брегмы, rezero координат, а затем перейти на сверло желании медиальной-боковой и передне-задней координат.
- Тренировка отверстие в координации с использованием 0,9 мм сверла, как он производит дырки соответствующего размера для инфузии 28 г шприца.
- Установка инфузионного насоса для доставки вируса в размере 0,2 мкл / мин. Поместите шприц в руку вливания стереотаксической устройства и снизить шприц в желаемый координат. Доставит желаемое количество вируса (в диапазоне от 0,1 до 0,8 мкл). Например, поставить 0,8 мкл AAV более 4 мин.
Примечание: провести экспериментальные исследования для определения идеального объема инфузионной и типичные распространение вируса в каждой области интереса.- После доставки вируса совместноmplete оставить шприц на месте в течение 10 мин для предотвращения обратного потока в ходу иглы. Медленно поднять шприц со скоростью около 5 мм / мин. Повторяйте, пока все координаты не были проникнуты AAV.
- Закройте рану, используя хирургические скобы и пальто рану антибактериальной мазью.
- Следуйте институциональные руководящие принципы для послеоперационной боли.
- Поместите крысу в клетке с постельными принадлежностями, крышкой и надлежащего вывесок и вернуть крысу на объект животного.
- При работе под BSL-2 Меры, собирать кроватях для количества времени (как правило, 48-72 ч), указанного институциональных принципов. Поместите кроватях в контейнер для биологически опасных отходов.
- Утилизируйте все AAV-загрязненных материалов, как указано в руководящих принципах для их безопасной утилизации.
3. Поведенческие Аппарат
Примечание: сенсорная предварительная установка состоит из стандартного инструментального кондиционирования ChamBER (12 "Д х 9,5" Ш х 11,5 "H) из нержавеющей стали сетки этаж, 2 боковые стенки из оргстекла и 2 металлические стенки.
- Установите 2,8 Вт свет на одну из алюминиевых стен служат дома свет и в качестве визуального стимула, когда вспыхнули с частотой 2 Гц. Установите динамик на камеру, чтобы доставить слуховые раздражители (10 сек, 1500 Гц, 78 дБ чистый тон и дБ белый шум 10 сек 78).
- Используйте пищевой бункер, чтобы доставить 45 мг пищевых гранул в пищевой чашку. В пищевой чашку, инфракрасные фотоэлементы обнаруживают общее время, проведенное в пищевой чашку до, во время и после презентации раздражителей и пищевых наград.
- Дом камеры в звуковых-ослабления шкафов (22 "Ш х 22" H х 16 "D), оснащенные вытяжными вентиляторами (~ 68 дБ).
- Используйте компьютер с программным обеспечением Med Associates для управления оперантного камеры и приобрести данные. Во время сессий кондиционирования, собирать данные об общем времени, проведенного с головой в пищевой чашку во время презение в (сек эпохи 5) световой раздражитель и во время презентации пищевого подкрепления (5 сек) эпохи. Во время тестовой сессии, собирать данные об общем времени, проведенного в пищевой чашку в ответ на презентации слуховых раздражителей (10 сек начало эпохи, когда слуховые раздражители прекращается).
4. Обзор сенсорной предобусловливания Paradigm
- После восстановления после операции, постепенно ограничивают пищи крыс на 85% от их массы тела свободной подачи. Обратитесь ветеринарный персонал для соответствующей парадигмы ограничение пищи.
Примечание: 3-фазный сенсорная предварительная парадигма показано на рисунке 2. - Предварительная Сессии (Фаза 1; Ежедневные 64 мин тренинги проводятся в 4 дня подряд):
- Нынешние крысы с 12 смешанных испытаний, которые состоят из поставки слуховых и зрительных раздражителей. Включить между пробные интервалы, средний 4,5 мин (диапазон от 4,0 до 5,0 мин) после каждого аuditory презентация.
- На 6 испытаний, присутствует тон (стимул) выдержано в течение 10 сек, затем сразу 5 сек презентации мигающий световой раздражитель в.
- На других 6 испытаниях, представить белый шум (непарный стимул) в одиночку в течение 10 сек.
- Сессии Кондиционер (Фаза 2; Ежедневно 64 мин тренинги, проводимые через 5 дней подряд):
- Нынешние крыс с 8 испытаний, которые состоят из родов визуального стимула (мигающий свет стимула) в течение 5 сек сразу после родов двух пищевых гранул 45 мг. Включить между пробные интервалы, которые в среднем 7 мин (диапазон от 6,0 до 8,0 мин) после каждого испытания. Иногда крысы требуют больше, чем 5 сеансов кондиционирования, чтобы узнать свет ассоциацию пищи.
- Тест сессия (Фаза 3; один сеанс 78 мин):
- Представьте крыс с 12 смешанных испытаний, которые состоят из поставки только слуховых раздражителей. Включить между пробные интервалы, AVEярости 4.5 мин (диапазон от 4,0 до 5,0 мин) после каждого слухового представления.
- На 6 испытаний, представляют стимул тона (выдержано стимул) в одиночку в течение 10 сек.
- На других 6 испытаниях, представить белый шум (непарный стимул) в одиночку в течение 10 сек.
- Уравновесить стимулы от завершения исследования со вторым набором крыс, которые получают белый шум в качестве стимула и выдержано тон как непарного стимула.
5. Фармакологические и поведенческие процедуры
- Включите питание в поведенческой аппарата и загрузить код Med-PC для соответствующего поведения сессии. Провод и программы поведенческой аппарат таким образом, что поклонники, которые установлены на звуковых ослабления шкафов включается при включении питания.
- Чтобы приготовить 1 мг / мл раствора клозапин N-оксида (CNO), вес 5,0 мг CNO в 15 мл коническую пробирку и добавляют 5 мл стерильной воды или 5 мл стерильной 0,9% SalIсеверо-восток Вихревые до решения ясна.
- Если CNO не растворяется в растворе или, если более концентрированные растворы CNO желательно добавить солюбилизирующий агент, такой как ДМСО 23. В частности, для получения 1 мг / мл раствора CNO с 0,5% ДМСО, вес 5,0 мг CNO и добавить 25 мкл ДМСО в 15 мл коническую пробирку. Щелчок аккуратно, что содержимое остается в основании трубы. Когда раствор становится прозрачным, добавить 5 мл стерильной воды или 5 мл стерильного 0,9% физиологического раствора. Дальнейшие инструкции по подготовке решений CNO доступны на странице ресурсов DREADD вики 25.
- Подготовьте новое решение Cno каждый день, что его вводят.
- Вводят CNO внутрибрюшинно в дозе 1 мг / кг приблизительно за 30 мин до тестирования поведения. Например, вводят в 200 г крыс с 0,2 мл 1 мг / мл раствора CNO. Доза и время курс администрации СМО были отобраны на основе ранее опубликованных докладов 2,12.
- Вводите Cno за 30 мин до каждого предварительной подготовки сессии (Фаза 1; в общей сложности 4 дня инъекций), но управлять транспортным средством до всех последующих сессиях поведенческих.
- Через 30 мин крыс поместить в поведенческих испытаний камер и инициировать компьютерный код для соответствующего поведенческого сессии.
- После завершения поведенческой задачи, немедленно удалить крыс из камер и вернуть крыс колонии животных.
6. Анализ поведенческих данных
Примечание: зависимой переменной для всех поведенческих сессий является количество времени, что голова крысы внутри пищевой чашки, как обнаружено прерывание инфракрасных фотоэлементов в пищевой чашку. Данные (в сек) собраны и записаны с помощью компьютерной программы.
- Не проводить анализы на данных, полученных в ходе стадии предварительного.
- Для сессий кондиционирования: анализировать каждый крыс Aность, чтобы узнать свет ассоциацию пищевых продуктов путем сравнения пищевое поведение чашки во время презентации визуального стимула через 5 поведенческих сессий. В частности, вычислить среднее время, проведенное в пищевой чашку в 5 сек света эпохи для каждого из 8 испытаний / сессии (т.е., в среднем 8 испытаний, каждый из которых 5 сек в продолжительности / крысы). Сравните среднюю контроль и экспериментальные значения для каждого из 5 ежедневных сеансов (рис 3а).
- Анализ мотивации крыс, чтобы получить награду пищи путем сравнения пищевое поведение чашки во время доставки пищевого подкрепления (5 сек) через эпохи 5 поведенческих сессий, используя тот же расчет, как указано на 5 сек света эпохи выше. Эти значения будут всегда выше, чем те, приобрела во время презентации визуального стимула (рис 3B).
- Для тестовой сессии: вычислить отношение дискриминации, которая описывает поведение еда чашка крыс в ответ на настentations каждого звукового раздражителя.
- В частности, для каждой крысы, разделите среднее время, проведенное в пищевой чашку после каждого 6 презентаций сенсорной выдержано стимула (например, тон) на сумму среднего времени, проведенного в пищевой чашку после каждого из 6 презентаций сенсорная выдержано раздражитель (т.е. стимул тона) плюс средняя от общего времени, проведенного в пищевой чашку после каждого из 6 презентаций непарного стимула (т.е. белый шум стимула). Каждая эпоха 10 сек продолжительности.
Примечание: оценка дискриминация 0,5 или больше показывает, что крысы научились ассоциации, заложенные в сенсорной предварительной подготовки парадигмы.
- В частности, для каждой крысы, разделите среднее время, проведенное в пищевой чашку после каждого 6 презентаций сенсорной выдержано стимула (например, тон) на сумму среднего времени, проведенного в пищевой чашку после каждого из 6 презентаций сенсорная выдержано раздражитель (т.е. стимул тона) плюс средняя от общего времени, проведенного в пищевой чашку после каждого из 6 презентаций непарного стимула (т.е. белый шум стимула). Каждая эпоха 10 сек продолжительности.
7. Проверка AAV размещения и выражения
- Обезболить и заливать крыс транскардиально используя 4% параформальдегида. В связи с использованием флуоресцентных меток, не превышают время после фиксации 2 ч до минПотеря imize антигенности и сохранить флуоресцентный сигнал.
- Высушить перфузированных мозги путем передачи их в банку мозга, содержащего 30 мл 20% раствора сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе (1x) в течение как минимум 2 дней или до мозга опускается на дне сосуда головного мозга.
- Используйте замораживание раздвижные микротом сделать разделы корональной мозга (20-40 мкм) в течение всего рострокаудального степени интересующей области.
- Проведение иммуногистохимии, направленное против меченого рецептора или репортерного белка, чтобы установить местонахождение и экспрессию рецептора дизайнера и / или репортера 12. Протокол окрашивания иммуногистохимии предоставляется на странице ресурсов DREADD вики 25.
- Установите секции на SuperFrost плюс слайды и покровного используя 100-200 мкл водного монтажа среды.
- Выполните флуоресцентной микроскопии на ткани головного мозга, чтобы проверить размещение AAV и белка выражение 12,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поведенческие результаты
По окончании эксперимента, эффективность области конкретных временной инактивации должно быть количественно и качественно оценить. Настоящий пример предполагает 3-фазный поведения парадигму (сенсорная предобусловливания), в котором CNO вводили для ослабления нервной деятельности в RSC процессе предварительной сессий, чтобы проверить гипотезу, что РКК необходимо для формирования ассоциаций среди нейтральных стимулов 12. Важно отметить, что экспериментаторы не ограничиваются поведенческой парадигмы или эксперимента, описанного в данном документе как фармакогенетический подход может использоваться в сочетании с большинством поведенческих парадигм.
В то время как анализы обычно не выполняются на данных, полученных в ходе предварительной подготовки сессий (Фаза 1), важно, чтобы количественно крысы научились ли свет ассоциацию пищи во время сессий кондиционирования (этап 2). Как показано в Интернетфигура 3А, и экспериментальные (Expt) и Control (Ctrl) крысы демонстрируют увеличение пищевое поведение чашки во время презентации световой раздражитель (рис 3а), указывающих, что крысы приобрели Павлова связь между визуальным стимулом (свет) и пищевой наградой. Кроме того, обе группы демонстрируют повышение пищевое поведение чашки во время презентации пищевого подкрепления (рис 3B) с указанием эквивалентной мотивацию, чтобы получить награду. В критический тестовой сессии, когда слуховые стимулы представлены в отсутствие других стимулов, контрольных крыс иметь счет дискриминации, которое значительно отличается от подопытных крыс (фиг.3С). Визуальный осмотр графика показывает, что среднее соотношение дискриминация контрольных крыс больше, чем 0,5, что свидетельствует о большей пищевого поведения чашки в ответ на презентации слуховой стимул, который был в паре со светом (в течение предобусловливания) по сравнению с их пищевой чашкуповедение в ответ на презентации слуховой стимул, который был непарных (во время предварительного выдерживания). В отличие от подопытных крыс не выявили разницы счет, который находится выше шанс. Таким образом, 3С показывает, что контроль, но не экспериментальные крысы показали сенсорный эффект предобусловливания.
Проверка AAV размещения
По завершении тестирования поведения, анализировать ткани мозга крыс для правильного размещения и выражения дизайнера рецептора. Проведение иммуногистохимии 12,25 использованием первичных антител, направленных против рецептора метки (например, первичным антителом анти-HA) или флуоресцентного репортера (в данном примере, mcitrine которое обнаруживается антитела к зеленого флуоресцентного белка (GFP)). Схема корональной разрезе мозга крыс показано на фиг.4А. 4В иллюстрирует надежную флуоресцентного иммунологического репортерного прот. Эйн в RSC в представительной подопытной крысы с не флуоресцентной метки, обнаруженной в окружающих регионах Цифры 4C - D иллюстрируют представитель флуоресцентный маркировки репортер белков в экспериментальной (EXPT; крысы вводили с AAV конструкции, содержащей ген рецептора дизайнер и гена mcitrine ) и контроль (CTRL; крыс вводили с аналогичной AAV конструкции, содержащей ген GFP, но не последовательность для дизайнера рецептора) крыс, соответственно. Уровни рецепторов может также отображаться как минимум, представитель и максимальной экспрессии 24. Если маркировка обнаружена в регионах за пределами области, представляющей интерес, включают те данные из поведенческих анализов.
Рисунок 1:. Принципиальная схема конструкции AAV схема hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV используются для ехрССГ тормозящее дизайнер рецептор (hM4Di) под нейронов определенного synapsin промоутер (hSyn) в RSC нейронов. Иммунофлуоресцентного репортеры (HA-тегов и / или mcitrine) может быть использован для визуализации экспрессии белка и репортера, соответственно. hSyn, промоутер synapsin человек; определяет выражение в нейронах. HA, hemagluttinin тег; этот тег слит с дизайнером рецептора и служит эпитопной тега позволяет обнаружить экспрессии рецептора. hM4Di, ген для дизайнера ингибирующее G-белком рецептор. IRES, вход на сайте внутренняя рибосомы; позволяет репортер (mcitrine) должны быть переведены. mcitrine, люминесцентные репортер, который вариант GFP, но более устойчив к фотообесцвечивания.
Рисунок 2: Принципиальная схема сенсорного предварительной подготовки парадигмы () В процессе предварительной Sess.ионы, 12 перемешаны испытания представлены. Во время 6 испытаний, звуковой раздражитель представлены в течение 10 сек и сразу мигающим дом световой раздражитель (2 Гц, в течение 5 сек). В других исследованиях 6, второй слуховой раздражитель представлены без визуального стимула. (Б) Во время сессий кондиционирования, ранее в паре визуального стимула в паре с пищевой наградой. (С) Во время тестовой сессии, есть 12 перемешаны презентации двух слуховых раздражителей при отсутствии зрительных стимулов или продуктов питания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Поведенческие результаты Средняя чашка пищевой отвечать в (А) Свет и (B) Пищевые эпохи дикольцо сессий кондиционирования (фаза 2). Данные были проанализированы с использованием повторных измерений дисперсионного анализа. отношения (С) Дискриминация во время тестовой сессии (этап 3). Пунктирная линия указывает равное количество условного пищевого чашку отвечая на каждого звукового раздражителя (то есть, не сенсорные предобусловливания) Данные были проанализированы с использованием независимых выборок т-тест. Expt; подопытных крыс (N = 17) придают с AAV конструкции, содержащей ДНК-последовательность для ингибирующее G-белком рецептор (дизайнер hM4Di) и последовательности ДНК, флуоресцентным репортером (mcitrine). Ctrl; контрольных крыс (п = 6) переплетаются с hM4Di и вводить автомобиль в сочетании с контрольными крысами (п = 4) переплетаются с вирусом AAV, который не содержит конструктора рецептор и вводили CNO. Контрольные группы существенно не отличаются друг от друга (р> 0,05). Усы означают ± SEM.
Рисунок 4: Гистологическое подтверждение экспрессии белка (А) схему, иллюстрирующую расположение RSC в корональной разрезе головного мозга крыс.. (Б) Типичные изображения иммуногистохимическое меченого ткани мозга крыс с экспериментальной крысы (эксп), который был переплетаются с AAV конструкции, содержащей ДНК-последовательность для ингибирующее G-белком рецептор (дизайнер hM4Di) и последовательность ДНК, флуоресцентным репортером ( mcitrine). mcitrine является очень выцветанию вариант зеленого флуоресцентного белка. (С) представитель изображений из подопытной крысы, иллюстрирующий расположение флуоресцентного репортера метки (mcitrine). (D), представитель изображение с контрольной крысы (Ctrl) проникнуты с AAV конструкции, содержащей последовательность ДНК, флуоресцентным репортером (расширенная GFP). Масштабные бары: В, 500 мкм; С и D, 10081; м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, как применять подход фармакогенетический (DREADD), чтобы исследовать, как конкретного региона мозга способствует многофазной задачи комплексно обучения. С возможностью временно, так и удаленно заглушить нейронной активности в отдельных областях мозга в фазах обучения, это сочетание подходов обеспечивает платформу для расследования широкий спектр поведения, в том числе более тонкий и прикрытые формы обучения. В примере, описанном в данном протоколе, контрольных крыс и крыс, которые экспрессируют рецептор конструктора в ретроспленальной коре (RSC) были испытаны в 3-фазных поведенческой задачи 12. Первый этап задачи участвуют презентацию нескольких нейтральных стимулов с предположения, что у контрольных крыс приобретет стимул-стимул связь между двумя стимулами. Рабочей гипотезой является то, что РСК необходимо стимул-стимула обучения, таким образом, на каждом из 4 кондиционирования дней, за 30 мин до начала поведенческого тестаING, контроль и экспериментальные крысам системное администрирование либо наркотика (СМО) или транспортного средства. При связывании с рецептором конструктора, CNO снижает активность нейронов, в которой, что рецептор экспрессируется. В течение оставшихся фаз поведенческой кондиционирования и испытаний, когда РКК не гипотетического влиять обучения, CNO не вводили и, таким образом, нейронная активность не была нарушена.
Критические Шаги в протоколе
Безопасное обращение с AAV соединений: The хирургических процедур, вовлеченных в фармакогенетического подхода являются не более технически сложных, чем простое вливание стереотаксической, однако, использование AAV в некоторых учреждениях не требуется, что экспериментаторы придерживаться BSL-2 меры предосторожности. Очень важно, чтобы следователи следовать руководящие принципы, установленные Центрами по контролю и профилактике заболеваний, финансирующих учреждений, домашних и других учреждений надзорных комитетов, относящихся к их научно-исследовательской программы. Информация о гое безопасное обращение AAVs легко доступны 13.
Подготовка и введение наркотика: CNO, дизайнер наркотиков, связывается с рецептором дизайнера и отключает нейронной активности, но в противном случае биологически инертным 1,3. Поставки CNO от поставщиков может меняться в последовательности. Соединение должно прибыть в виде порошка, который не привязан к сторонам контейнера.
Важные контрольные группы, чтобы рассмотреть: Для контроля неспецифических эффектов наркотика, до поведенческого тестирования, настоять различный набор экспериментальных крыс (т.е. те, которые выражают рецептор дизайнер) с транспортных средств инъекций вместо CNO. Кроме того, для контроля неспецифических эффектов дизайнера рецептора включают группу крыс, которые придают с контрольным вирусом, который содержит флуоресцентный репортера, но не модифицированный дизайнер рецептора и ввести эти крысы с наркотика (т.е. CNO) , Ensuповторно адекватную экспериментальную конструкцию с противовесом по группам.
Проверка выражение конструкта: Есть несколько способов, чтобы максимизировать выражение и обнаружение дизайнера рецептора. До вливания, убедитесь, что вирусная титр рядом 10 12 частиц / мл. Часто визуализация флуоресцентного репортера низка и, таким образом, рекомендуется, что иммуногистохимии быть выполнена на интересующей области с использованием антител, направленных против репортера (S) включены в вирусной конструкции 25. В этом примере, анти-GFP иммунореактивности обеспечивает надежную сигнал (фиг 4B - D). Важно отметить, что из-за природы флуоресцентных меток, ограничивать длину времени фиксации до 2 ч.
Преимущества техники
После того, как вирусная конструкция была доставлена в мозг через стереотаксической хирургии, фармакогенетический подход позволяет для временного АКТИВНОканцами активности мозга в дискретных областей с помощью минимально инвазивной системной инъекции наркотика. Применение препарата может произойти несколько раз, что является выгодным для поведенческих задач, которые возникают через последовательные дней или недель 12,24,26. Кроме того, данные показывают, что дизайнер наркотиков (CNO) не мешает поведения опорно-двигательного аппарата или аппетита 27,28. Таким образом, способ дает возможность ослаблять нейронную активность в течение короткого периода времени (2-5 ч), избегая при этом стресс, присущие другим способам временной инактивации. В частности, в исследованиях катетеризации, временное инактивации достигается путем доставки нейротоксинов через канюли, которые постоянно прикреплены к черепу. Этот подход ограничивается тем, что сохраняя канюли мусора, защищенную является сложной задачей. Кроме того, чтобы побудить бездействие, животные обрабатываются широко (управлять токсин через канюли) только до поведенческого тестирования, бееч накладывает стресс на животное, а также увеличивает вероятность того, что может выбить канюли из черепа. Потому что последствия CNO относительно короткий срок, возможность долгосрочных компенсационных механизмов (например, тем, которые наблюдаются следующие постоянные поражения или в генной инженерии мышей) сведены к минимуму 29,30.
Ограничения по методам
DREADD это относительно новый метод неинвазивного ослабления активность нейронов. Поскольку такие экспериментаторы могут быть склонны самостоятельно проверить, что нейронная молчание происходит в их подготовке. Проверка может быть выполнена с использованием электрофизиологических подходов, но эти эксперименты времени, дорогостоящими и требуют специальных знаний. Кроме того, в то время как chemogenetic методы являются менее дорогостоящими, чем оптогенетика, подход является более дорогим, чем традиционные инактивации с фармакологическими агентами, такими как ТТХ. Другим ограничением подхода является то, что DREADD Infusион вирусных конструкций не приводит к 100% поражения нейронов в области, представляющей интерес, и не инактивацию посредством CNO привести к снижению активности нейронов 100%. Наконец, некоторые AAV серотипов может быть ретроградно транспортируются, которые могут осложнить интерпретацию экспериментальных результатов 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим авторов Робинсон и др. 12 за их вклад в рукописи, из которых этот протокол частично получены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
