Abstract
Detta protokoll beskriver hur man tillfälligt och distans tysta neuronal aktivitet i diskreta hjärnregioner medan djur är engagerade i inlärnings- och minnesuppgifter. Tillvägagångssättet kombinerar farmakogenetik (Designer-receptorer-Exklusivt-aktiverad-by-Designer-droger) med en beteendevetenskaplig paradigm (sensorisk prekonditionering) som är utformad för att skilja mellan olika former av lärande. Närmare bestämt är viralt medierad leverans används för att uttrycka en genetiskt modifierad hämmande G-proteinkopplad receptor (Designer Receptor) till en diskret hjärnregion hos gnagare. Tre veckor senare, när designer receptorexpressionsnivåerna är höga, är en farmakologiskt medel (Designer Drug) administreras system 30 minuter före ett visst beteende session. Drogen har affinitet för designern receptom och sålunda resulterar i hämning av neuroner som uttrycker formgivaren receptom, men är i övrigt biologiskt inert. Hjärnan regionen förblir tystas för 2-5 timmar (depending på dos och administreringssätt). Efter avslutad beteende paradigmet, är hjärnvävnad bedömas för korrekt placering och receptoruttryck. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för att bestämma bidraget från enskilda hjärnregioner till specifika komponenter i beteende och kan användas över valfritt antal beteende paradigm.
Introduction
En spännande utmaning inom området beteende neurovetenskap är att fastställa de neurala substrat av komplexa beteenden. Ett antal tekniker såsom permanenta skador, tillfälliga hjärninaktive via kanyler implantat och optogenetik har använts för att identifiera bidragen från diskreta hjärnregioner för delkomponenterna i komplexa beteenden. Även om dessa metoder informera vår förståelse av regional selektivitet under lärande, är varje teknik inte utan begränsningar. Närmare bestämt är permanenta skador typiskt före beteendetestning, alltså deras effekter är närvarande under hela paradigm. Kanyle studier som involverar presentationen av en kortsiktig neurala inaktivator (t.ex. tetrodotoxin) kan producera betydande skada på hjärnvävnaden och kan framkalla stress i ämnen strax före beteendetestning. Vidare är inaktivering genom kanylering begränsas till området av vävnad som omgerspetsen av kanyler. Slutligen, medan optogenetik erbjuder ett utbud av flexibilitet för den tidsmässiga kontroll av verksamheten i specifika delar av hjärnan, är det kostnadseffektivt oöverkomliga och tekniskt krävande.
Dessa begränsningar kan övervinnas med hjälp av en farmakogen metod (Designer-receptorer-exklusivt aktiverade-by-Designer-droger, DREADDs) 1,2. Viktigt medan begreppet farmakogenetik är sofistikerad, är utförandet av tekniken okomplicerad. Liknar traditionella stereotaktiska kirurgiska metoder som involverar infusion av toxin (t.ex. NMDA, ibotensyra) i diskreta hjärnregioner, innebär denna teknik infusion en adeno-associerat virus (AAV) som innehåller ett DNA-fragment för en modifierad hämmande G-proteinkopplad receptor (hM4Di; designern receptorn) i det intressanta området av standard laboratoriegnagare (se figur 1). Den virala vektorn innehåller också en fluorescerande reporter (mcitrine). Som införlivats itill celler, är formgivaren receptorn (och rapportörprotein) maximalt uttryckt ~ 3 veckor efter infusion och kan selektivt aktiveras för 2-5 h genom systemisk administrering av den annars biologiskt inert designern drogen, klozapin-N-oxid (CNO) 1 , 3. Eftersom försöks är utrustad med exakt, men fjärrtemporal kontroll över neural aktivitet i specifika delar av hjärnan, kombinerar farma särskilt väl med beteende paradigm som genomförs i flera faser. I det här exemplet, att bidraget från retrosplenial cortex (RSC) stimulus-stimulus lärande jämfört med dess roll i Pavlovsk lärande, men denna kombination av metoder är väl lämpad för ett obegränsat antal frågor som syftar till att identifiera hur specifika hjärnregioner bidrar till komplext beteende.
Dessutom, även om de inte beskrivs i det nuvarande protokollet, virala och transgena metoder kan användas för att uppnå celltyp-specifik DREADD uttryck 2. Som jaginneboende i beteende paradigm som involverar farmakologiska och / eller andra typer av experimentella manipulationer, noggrann genomgång av experimentell design och efterföljande kvantitativ analys krävs vid användning av DREADD tillvägagångssätt. Praktiker nya till DREADD tillvägagångssätt hänvisas till en omfattande översyn av nuvarande DREADD teknik 2.
Varje dag, organismer lära sig om nya stimulanser och händelser och deras relationer till varandra. Även i en bekant miljö, såsom hem, är en snabb att upptäcka förändringar i relationerna mellan stimuli eftersom dessa förändringar kan vara prediktiva för meningsfulla händelser. En sådan stimulans-stimulus (dvs, relations) innebär lärandet conjoining av flera stimuli och har traditionellt förknippats med hippocampus, som är bosatt centralt inom mediala tinningloben 4. Men inte existerar hippocampus eller agera på egen hand; kortikala regioner både inom och utanförsidan av mediala temporalloben ge kritisk sensorisk information till hippocampusformationen 5-7. Traditionella permanenta skade studier ger övertygande bevis för inblandning av ett antal kortikala regioner (t.ex. de retrosplenial, postrhinal och entorhinal cortex) i hippocampus beroende lärande, men är begränsade i sin förmåga att urskilja vilken roll en viss region under diskreta faser av learning 8-10.
Den nuvarande protokollet testar hypotesen att RSC är nödvändig för stimulus-stimulus lärande genom tysta RSC under en enda fas av ett 3-fas sensorisk prekonditionering paradigm 11,12. I korthet, råttor får infusioner av en AAV som innehåller designern receptorn och ~ 3 veckor senare administreras formgivaren läkemedlet (CNO) 30 min före starten av beteendetestning. I det nuvarande protokollet, försöksråttor får CNO under den första fasen av testning (när stimulus-stimulus learning sker) och de får fordonet under de närmaste 2 faser av att testa. För att kontrollera för oavsiktliga effekter av CNO på beteende, ingjuta råttor med designern receptorn (hM4Di) och injicera med fordon i stället för CNO. Att redogöra för generella effekter av virus infusion och receptoruttryck, ingjuta en kontrollvirus som inte innehåller designern receptorn och administrera CNO.
Ett antal olika serotyper av AAV används för att leverera genetiskt material. De nuvarande NIH riktlinjer för forskning som avser rekombinanta eller syntetiska molekyler bibehåller att AAV (alla serotyper) och rekombinanta eller syntetiska AAV-konstruktioner, i vilka transgenen inte kodar för antingen ett potentiellt tumorigen genprodukt eller en toxinmolekyl och produceras i frånvaro av en hjälparvirus kräver BSL-1 försiktighetsåtgärder (Bilaga B-1. Risk Group 1 (RG1) Agenter) 13. Ett antal betyg rör AAV struktur, nytta och säkerhet finns 14,15. Notably, fast, På grund av oro rörande eventuella reproduktions 16,17 och potentiella cancerframkallande mekanismerna 18-20 i gnagare, vissa institutioner kräver användning av BSL-2 försiktighetsåtgärder när du arbetar med AAV. Kontrollera lämplig BSL före användning genom att samråda med tillsynskommittéer på enskilda institutioner där forskningen kommer att genomföras, Centers for Disease Control and NIH riktlinjer för forskning som utförs på rekombinanta DNA-molekyler 13 vid användning av virala vektorer för genmanipulation i USA. Personliga skyddsåtgärder, utredare utbildning, vektor inneslutning, sanering, omhändertagande av sanerade material, och efter injektion djur bostäder krav specificeras av dessa riktlinjer. Dessutom, samråda med och följa lämplig Institutional Animal Care och använda riktlinjer kommitté eller motsvarande riktlinjer institutionella tillsynskommittén för att säkerställa hantering, administration och bortskaffande av AAV säker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av djur godkänns av Oberlin College Institutional Animal Care och användning kommittén och är i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur 21.
1. Förberedelse för Viral Infusion
Obs! Detta protokoll använder BSL-1 försiktighetsåtgärder. Vid användning av BSL-2 försiktighetsåtgärder, en engångslabbrock, handskar, skoskydd, ögonskydd och en partikel andningsskydd (typ N95) krävs. Alla individer som hanterar BSL-2 föreningar måste passa testas för en speciell respirator av en lokal folkhälsoorganet. Se Lowery & Majewska (2010) 22 för ytterligare information om hantering och lagring av virala vektorer.
- Vid första användningen, portion och förvara oanvända virus i 20 pl mikrocentrifugrör för att undvika upprepad frysning och upptining.
- Förbered arbetsytan genom att ta bort eventuella onödiga föremål och sterilisering av ytan med 70% etanol. Förbered en 10% blekmedelslösning för sanering av AAV avfall. Placera en bägare full av blekmedelslösningen och en steril spruta 10 | il på arbetsytan. Placera mikrocentrifugrör med AAV i en behållare med krossad is under uppsättning upp.
- Placera mikrocentrifugrör med viruset i en vanlig bänk vice. Ladda en spruta 10 l med minst 4 il AAV. Se till att inte böja spetsen på sprutan mot botten av mikrocentrifugrör under lastning. Se till att det inte finns några luftbubblor i de 4 ul av AAV-lösning i sprutan.
- Ta hand om den tomma viruset röret i bägaren innehållande 10% blekmedel. Förvara oanvända delar av viruset som anges av leverantören.
- Lägg till ytterligare 10% blekmedel till avfallsbehållaren och låta avfall att sitta i 30 minuter innan du kasserar den sanerade flytande avfall.
- Ta hand om all skyddsutrustning och plastavfall i en biologiskt behållare enligt instruktionen från institutionens riktlinjer. Decontaminate någon utrustning eller ytor som kom i kontakt med viruset med användning av 10% blekmedel.
2. Kirurgi
- Förbered operationsområdet genom att placera absorberande bänkpapper enligt stereotaxic apparater och ett angränsande utrymme betecknas som en särskild virushantering område.
- Placera en 10% blekmedel avfallsbehållare i den särskilda virus hantering område nära kirurgiska apparater.
- Framkalla en jämn nivå av anestesi och förbereda råttan för operation.
- Placera råttan i en induktionskammare som innehåller en blandning av isofluran gas (intervallet 1 till 3%) och syre (100% vid ungefär 1 liter / min) tills det finns en förlust av medvetandet och brist på brutto målmedveten rörelse. Behåll isoflurananestesi hela det kirurgiska ingreppet.
- Efter 6 djup anestesi uppnåtts raka råttan från mellan ögonen till strax bakom öronen.
- Placera råttan tillbaka in i induktionskammaren på enytterligare 1-3 min.
- Kontrollera att isoflurananestesi systemet är anslutet till noskonen av stereotaxic kirurgi. Öppna kranen på isofluran slang för att starta flödet av isofluran till stereotax. Behåll isofluran och syre vid de nivåer som anges ovan.
- Placera råttan i en stereotaxisk apparat genom att säkra munnen på bettet bar och säkra örat barer.
- Applicera ögat smörjmedel till ögonen och Betadine till den kirurgiska platsen före snittet.
- Gör en 2,4 cm mittlinjesnitt av huden på den dorsala ytan av skallen med start ca 2 mm kaudalt om ögonen. Dra in i huden för att exponera skallen. Periodvis ingjuta steril 0,9% steril saltlösning i utkanten av operationsområdet för att förhindra vävnader från torkning.
- Klar membranös vävnad från skallen tills bregma och lambda är tydligt synliga.
- Se till att skallen är nivån genom att mäta rygg-ventrala koordinater påbregma och vid lambda. Justera stereotaxic enheten i enlighet med dess rygg-ventrala koordinater på bregma och lambda avviker med högst 0,04 mm.
- Vid denna tid, minska isofluran gas till mellan 2 och 2,5%.
- Återgå borren till bregma, nollställa koordinaterna och sedan flytta borren till den önskade mediala-laterala och främre-bakre koordinat.
- Borra ett hål på koordinat med hjälp av en 0,9 mm borr, eftersom det ger en lämplig storlek hål för en 28 G infusionsspruta.
- Ställ infusionspumpen att leverera virus vid en hastighet av 0,2 | j, l / min. Placera sprutan i infusions arm stereotaxic enheten och sänk sprutan till den önskade koordinaten. Leverera den önskade mängden virus (intervall 0,1-0,8 l). Till exempel, leverera 0,8 pl AAV under 4 min.
Obs: genomföra pilotstudier för att bestämma den ideala infusionsvolymen och den typiska spridningen av virus i varje region av intresse.- Efter är leverans virus complete lämna sprutan på plats under 10 min för att förhindra återflöde in nålen tarmkanalen. Sakta höja sprutan med en hastighet av ca 5 mm / minut. Upprepa tills alla koordinater har getts den sista med AAV.
- Stäng såret med hjälp av kirurgiska häftklamrar och belägga lindade med aktuell antibiotika salva.
- Följ institutionens riktlinjer för postoperativ smärtbehandling.
- Placera råttan i en bur med strö, ett lock och ordentlig skyltning och återgå råttan till djuret anläggning.
- Om man arbetar enligt BSL-2 försiktighetsåtgärder, samla sängkläder för den tid (normalt 48-72 timmar) anges av institutionens riktlinjer. Placera sängar i ett biologiskt avfallsbehållare.
- Gör dig av med alla AAV-kontaminerat material som specificerats av riktlinjer för säker slutförvaring.
3. Behavioral Apparat
Obs: Den sensoriska prekonditionering Utrustningen består av en standard operant beting chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) med en rostfritt stålnät våningen, 2 plexiglas sidoväggar och 2 metallväggar.
- Montera en 2,8 W ljus på en av aluminiumväggarna för att tjäna som huset ljus och som den visuella stimuli när blixtrade vid 2 Hz. Montera en högtalare på kammaren för att leverera de auditiva stimuli (10 sek, 1500 Hz, 78 dB ren ton och en 10 sek 78 dB vitt brus).
- Använd ett livsmedel tratt för att leverera 45 mg matpellets i maten koppen. Inom livsmedels cup, infraröda fotoceller upptäcker den totala tid som tillbringas i livsmedel cup före, under och efter presentationer av stimuli och livsmedels belöningar.
- Hus kamrarna i ljuddämpande skåp (22 "W x 22" H x 16 "D) utrustade med frånluftsfläktar (~ 68 dB).
- Använd en PC-dator med Med Associates programvara för att styra operant kammaren och skaffa data. Under konditione sessioner, samla in uppgifter om den totala tid som tillbringas med huvudet i livsmedel cup under presentaning av Ijusstimulus (5 sek epok) och under presentation av livsmedel belöning (5 sek epok). Under testsessionen, samla in data om den totala tid som tillbringas i livsmedels cup som svar på presentationer av de auditiva stimuli (10 sek epok början när de auditiva stimuli avslutas).
4. Översikt över Sensory Förkonditionering Paradigm
- Efter återhämtning från kirurgi, gradvis mat begränsa råttorna till 85% av deras fria utfodring kroppsvikt. Rådgör veterinär personalen under en lämplig mat begränsning paradigm.
Anm: 3-fas sensorisk förkonditionering paradigmet illustreras i figur 2. - Förkonditionering Sessions (Fas 1, Daily 64 min träningspass genomförs över 4 dagar i följd):
- Nuvarande råttor med 12 blandade studier som består av leverans av auditiva och visuella stimuli. Inkludera inter rättegång intervall som i genomsnitt 4,5 minuter (intervall 4,0 till 5,0 min) efter varje enuditory presentationen.
- Den 6 av försöken, närvarande en ton (förkonditionerad stimulans) för 10 sekunder, omedelbart följt av en 5 sek presentation av blinkande ljus stimulans.
- Å andra 6 försök presentera vitt brus (oparade stimulus) enbart för 10 sek.
- Luftkonditionering sessioner (Fas 2; Daily 64 min träningspass som genomförs över 5 dagar i följd):
- Nuvarande råttor med 8 studier som består av leverans av den visuella stimulus (det blinkande ljuset stimulans) under 5 sekunder omedelbart följt av leverans av två 45 mg matpellets. Inkludera inter rättegång intervall som i genomsnitt 7 minuter (intervall 6.0 till 8.0 min) efter varje försök. Ibland råttor kräver mer än 5 konditione sessioner för att lära sig lätt mat föreningen.
- Test Session (Fas 3, en enda 78 min session):
- Presentera råttorna med 12 blandade prövningar som består av leverans av auditiva stimuli ensam. Inkludera inter rättegång intervall som Averaseri 4,5 min (intervall 4,0 till 5,0 min) efter varje hörsel presentation.
- Den 6 av försöken, presentera tonen stimulans (den kondition stimulus) enbart för 10 sek.
- Å andra 6 försök presentera vitt brus (den oparade stimulus) enbart för 10 sek.
- Motverka stimuli genom att fylla i studien med en andra uppsättning råttor som får vitt brus som kondition stimulans och tonen som oparade stimulans.
5. Farmakologiska och Behavioral ordningen
- Slå på strömmen till beteendeapparaten och ladda Med-PC kod för lämplig beteendevetenskaplig sessionen. Tråd och program beteendeapparaten så att fans som är monterade på ljuddämpande skåp slås på när strömmen slås på.
- För att framställa en 1 mg / ml lösning av klozapin N-oxid (CNO), väger 5,0 mg CNO i en 15 ml koniska rör och tillsätt 5 ml sterilt vatten eller 5 ml steril 0,9% saline. Vortex tills lösningen är klar.
- Om CNO inte upplösas i lösning eller om mer koncentrerade lösningar av CNO önskas lägga ett solubiliseringsmedel, såsom DMSO 23. Specifikt, för att framställa en 1 mg / ml lösning av CNO med 0,5% DMSO, väger 5,0 mg CNO och tillsätt 25 | il DMSO till en 15 ml koniskt rör. Flick försiktigt säkerställa att innehållet förblir vid basen av röret. När lösningen blir klar, tillsätt 5 ml sterilt vatten eller 5 ml steril 0,9% saltlösning. Ytterligare instruktioner för framställning av lösningar av CNO finns på DREADD wiki resurs sidan 25.
- Förbered en ny CNO lösning varje dag som det administreras.
- Injicera CNO intraperitonealt vid en dos av 1 mg / kg ca 30 minuter före beteendetestning. Till exempel injicera en 200 g råtta med 0,2 ml av 1 mg / ml CNO lösning. Dosen och tidsförloppet för CNO administration valdes baserat på tidigare publicerade rapporter 2,12.
- Spruta CNO 30 minuter före varje konditione session (Fas 1, totalt 4 dagar av injektioner) men administrera fordonet före alla efterföljande beteendesessioner.
- Efter 30 minuter, placera råttorna i beteendetestkammare och initiera datorkod för lämplig beteendevetenskaplig sessionen.
- Efter avslutad beteende uppgift, omedelbart ta bort råttorna från kamrarna och åter råttorna till djuret kolonin.
6. Analyser av beteendedata
Obs: Den beroende variabeln för alla beteende sessioner är den mängd tid som råttans huvud är inuti maten koppen såsom detekteras av avbrott i de infraröda fotoceller i livsmedels koppen. Uppgifterna (i sek) samlas och registreras av datorprogram.
- Inte utföra analyser på data som genereras under konditioneringsfasen.
- För sessionerna konditione: analysera varje råttornas enheten att lära sig lätt mat föreningen genom att jämföra mat kopp beteende under presentationen av den visuella stimuli över 5 beteendesessioner. Specifikt beräkna den genomsnittliga tiden i livsmedel cup under 5 sek ljus epok för varje 8 försök / session (dvs i genomsnitt 8 försök som var och 5 sekunder i längd / råtta). Jämföra genomsnittlig kontroll och experimentella värden för var och en av fem dagliga sessioner (se figur 3A).
- Analysera råttornas motivation att få mat belöning genom att jämföra mat kopp beteende under leverans av mat belöning (5 sek epok) över 5 beteende sessioner med samma beräkning som anges för 5 sek ljus epok ovan. Dessa värden kommer att vara genomgående högre än de som förvärvats under presentation av visuella stimuli (se figur 3B).
- För testsession: beräkna ett förhållande diskriminering som beskriver råttornas mat kopp reaktioner på presentations hos varje auditiva stimulus.
- Specifikt för varje råtta, dela den genomsnittliga tid som tillbringas i livsmedels kopp efter varje 6 presentationer av sensoriska kondition stimulus (dvs tonen) av summan av den genomsnittliga tid som tillbringas i livsmedels kopp efter varje 6 presentationer av sensorisk kondition stimulus (dvs tonen stimulans) plus genomsnittet av den totala tid som tillbringas i livsmedels kopp efter varje 6 presentationer av oparade stimulus (dvs vitt brus stimulans). Varje epok är 10 sekunder i varaktighet.
Obs: En diskriminering poäng 0,5 eller högre visar att råttor lärde sig föreningar som ingår i den sensoriska prekonditionering paradigm.
- Specifikt för varje råtta, dela den genomsnittliga tid som tillbringas i livsmedels kopp efter varje 6 presentationer av sensoriska kondition stimulus (dvs tonen) av summan av den genomsnittliga tid som tillbringas i livsmedels kopp efter varje 6 presentationer av sensorisk kondition stimulus (dvs tonen stimulans) plus genomsnittet av den totala tid som tillbringas i livsmedels kopp efter varje 6 presentationer av oparade stimulus (dvs vitt brus stimulans). Varje epok är 10 sekunder i varaktighet.
7. Kontroll av AAV placering och uttryck
- Söva och BEGJUTA råttorna transkardiellt med 4% paraformaldehyd. På grund av användningen av fluorescerande markörer, inte överskrider ett efter fixering tid av 2 timmar till minimize förlust av antigenicitet och för att bevara den fluorescerande signalen.
- Dehydratisera perfunderade hjärnor genom att överföra dem i en hjärna burk innehållande 30 ml av en 20% sackaroslösning i fosfatbuffrad saltlösning (1x) i minst två dagar eller tills hjärnan sjunker till botten av hjärnan burken.
- Använd en frysning glidande mikrotom för att göra koronal hjärnsektioner (20-40 pm) genom hela rostrocaudal utsträckningen av regionen av intresse.
- Genomför immunohistokemi riktad mot den märkta receptorn eller den rapportproteinet för att fastställa platsen och expression av formgivaren receptom och / eller reporter 12. En immunohistokemi färgningsprotokollet tillhandahålls på DREADD wiki resurs sidan 25.
- Montera delarna till Superfrost-plus diabilder och täck använder 100-200 il av en vattenmonteringsmedium.
- Utför fluorescensmikroskopi på hjärnvävnad att kontrollera AAV placering och proteinuttryck 12,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beteenderesultat
Efter avslutad experimentet bör effektiviteten i regionspecifika tillfälligt inaktive kvantitativt och kvalitativt. Föreliggande exempel involverar en 3-fas beteendeparadigm (sensor förkonditionering), där CNO administrerades till dämpa neural aktivitet i RSC Under prekonditioneringen sessioner för att testa hypotesen att RSC är nödvändig för bildningen av föreningar bland neutrala stimuli 12. Viktigt är praktiker inte begränsad till den beteendeparadigm eller experimentell design beskrivs häri som den farmakogen tillvägagångssätt kan kopplas med de flesta beteendeparadigm.
Med beaktande av följande analyser inte är vanligtvis utförs på data som genereras under konditioneringssessioner (Fas 1), är det viktigt att kvantifiera om råttor lärde sig lätt mat sammanslutningen under konditione sessioner (fas 2). Såsom visas i Figur 3A, både experimentella (Exp) och kontroll (Ctrl) råttor demonstrerar öka livsmedels kopp beteende under presentationer av Ijusstimulus (Figur 3A) indikerar att råttor fick en Pavlovsk association mellan den visuella stimulus (ljus) och maten belöning. Dessutom demonstrerar båda grupperna öka livsmedels kopp beteende under presentation av livsmedel belöning (Figur 3B) som anger motsvarande motivation att få belöning. Under den kritiska testsessionen, när auditiva stimuli presenteras i frånvaro av andra stimuli, kontrollråttor har en diskriminering betyget som skiljer sig mycket från försöksråttor (figur 3C). Visuell kontroll av grafen visar att det genomsnittliga förhållandet diskriminering av kontrollråttor är större än 0,5, vilket indikerar större livsmedels kopp beteende som svar på presentationer av hörsel stimulans som kopplas ihop med ljus (under prekonditionering) jämfört med deras mat cupbeteende som svar på presentationer av auditiva stimulus som bort parkopplingen (under prekonditionering). Däremot experimentella råttor inte uppvisar en skillnad betyget som ligger över en slump. Således, Figur 3C visar att kontroll men inte försöksråttor visade den sensoriska prekonditionering effekt.
Kontroll av AAV Placering
Vid slutförandet av beteendetestning, analysera råtthjärnvävnad för korrekt placering och expression av formgivaren receptom. Uppförande immunohistokemi 12,25 att använda primära antikroppar riktade mot en receptor tagg (t.ex., en anti-HA-primär antikropp) eller den fluorescerande reporter (i detta exempel, mcitrine som detekteras av en antikropp till grönt fluorescerande protein (GFP)). En schematisk bild av en koronal sektion genom råtthjärnan visas i figur 4A. Figur 4B illustrerar robusta fluorescerande immundetektering av reporter prot. ein i RSC i en representativ försöks råtta utan fluorescerande etikett detekteras i omgivande regioner Figurerna 4C - D illustrerar representativa fluorescerande märkning av reporter proteiner i experimentell (Expt, råttor infunderades med en AAV-konstruktion innehållande designer receptorgenen och mcitrine genen ) och kontroll (Ctrl, råttor infunderades med en liknande AAV konstruktion innehållande GFP-genen, men ingen sekvens för designern receptorn) råttor, respektive. Receptornivåer kan också visas som minimum, representant och maximal uttryck 24. Om märkning detekteras i regioner utanför området av intresse, utesluta dessa uppgifter från de beteendeanalyser.
Figur 1:. Schematiskt diagram av AAV-konstruktionen Ett diagram över hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV brukade expTryck på den hämmande designer receptorn (hM4Di) under en neuronal specifik synapsin promotor (hSyn) i RSC neuroner. Immunofluorescerande reportrar (HA-tag och / eller mcitrine) kan användas för att visualisera uttryck av proteinet och reportern, respektive. hSyn, mänsklig synapsin promotor; specificerar uttryck i neuroner. HA, hemagluttinin tag; denna tagg fuseras till formgivaren receptom och fungerar som en epitopmärkning möjliggör detektering av receptorexpression. hM4Di, genen för designern hämmande G-proteinkopplad receptor. IRES, inre ribosominträdesställe; gör reportern (mcitrine) som ska översättas. mcitrine, en fluorescerande reporter som är en variant av GFP men är mer resistent mot fotoblekning.
Figur 2: Schematisk beskrivning av sensoriska prekonditionering paradigm (A) Under Förkonditionering sess.joner är 12 blandade studier presenteras. Under 6 av försöken, är en auditiv stimulus presenteras i 10 sekunder omedelbart följt av en blinkande hus Ijusstimulus (2 Hz, 5 sek). Under de övriga 6 försök, är en andra auditiva stimulus presenteras utan en visuell stimulans. (B) Under konditione sessioner, är den tidigare parade visuell stimulans paras med mat belöning. (C) Under testsession, det finns 12 blandas presentationer av de två auditiva stimuli i frånvaro av visuella stimuli eller mat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Beteende resultat Genomsnittliga mat kopp svara under (A) Ljus och (B) Livsmedels epoker DUring Konditione sessioner (fas 2). Data analyserades med användning av upprepade mätningar av variansanalys. (C) Diskriminering förhållanden under testsessionen (fas 3). Den streckade linjen anger lika mängder rade livsmedel kopp som svarar på varje auditiva stimulus (dvs., ingen sensorisk prekonditionering) Data analyserades med användning av oberoende urval t-test. Expt; experimentella råttor (n = 17) infunderades med en AAV-konstruktion innehållande DNA-sekvensen för den hämmande G-proteinkopplad designern receptor (hM4Di) och DNA-sekvensen för en fluorescerande reporter (mcitrine). Ctrl; kontrollråttor (n = 6) infunderas med hM4Di och administrerades vehikel i kombination med kontrollråttor (n = 4) infunderas med en AAV-virus som inte innehåller designern receptorn och som administrerades CNO. Kontrollgrupper skilde sig inte signifikant från varandra (p> 0,05). Felstaplar betecknar ± SEM.
Figur 4: Histologisk verifiering av proteinexpression (A) En schematisk illustrerande placeringen av RSC i ett koronalt snitt genom råtthjärnan.. (B) Representativa bilder av immunhistokemiskt märkt råtthjärnvävnad från en experimentell råtta (Expt) som infuserades med en AAV-konstruktion innehållande DNA-sekvensen för den hämmande G-proteinkopplad designern receptor (hM4Di) och DNA-sekvensen för en fluorescerande reporter ( mcitrine). mcitrine är en mycket färgbeständigt variant av grönt fluorescerande protein. (C) Representant bild från en experimentell råtta som illustrerar placeringen av den fluorescerande reporter etikett (mcitrine). (D) representant bild från en kontrollråtta (Ctrl) infunderas med en AAV-konstruktion innehållande DNA-sekvensen för en fluorescerande reporter (förstärkt GFP). Skalstrecken: B, 500 | j, m; C och D, 10081,. M klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man tillämpar ett farmakogen strategi (DREADD) att undersöka hur en viss hjärna region bidrar till en fler fas komplex inlärning uppgift. Med möjligheten att tillfälligt och på distans tysta neural aktivitet i diskreta hjärnregioner över faser av lärande, denna kombination av metoder ger en plattform för att undersöka ett brett spektrum av beteenden, inklusive mer nyanserad eller maskerade former av lärande. I exemplet som beskrivs i detta protokoll, kontrollråttor och råttor som uttrycker designer receptorn i retrosplenial cortex (RSC) testades i en 3-fas beteende uppgift 12. Den första fasen av uppgiften inblandade presentation av flera neutrala stimuli med antagandet att kontrollera råttor skulle förvärva en stimulus-stimulus samband mellan två av stimuli. Arbetshypotesen är att RSC är nödvändigt för stimulus-stimulus lärande, alltså, på var och en av fyra konditione dagar 30 minuter före starten av beteendetestetIng, kontroll och försöksråttor gavs systemisk administrering av antingen designern drogen (CNO) eller fordon. När bunden till formgivaren receptorn minskar CNO aktiviteten av neuroner där denna receptor uttrycks. Under de återstående faserna i beteendekonditionering och provning, när RSC inte en hypotes att påverka lärande, CNO inte administreras och därmed nervaktivitet inte stördes.
Kritiska steg i protokollet
Säker hantering av AAV föreningar: De kirurgiska ingrepp som är involverade i farmakogen strategi är mer tekniskt krävande än en enkel stereotaktisk infusion kräver emellertid användning av AAV vid vissa institutioner som praktiker följer BSL-2 försiktighetsåtgärder. Det är viktigt att utredarna följer de riktlinjer som fastställts av Centers for Disease Control, finansiärer, hemmainstitutioner och andra tillsynskommittéer som är specifika för deras forskningsprogram. Information på the säker hantering av AAV är lätt tillgänglig 13.
Upprättande och administration av designern drogen: CNO, designern drogen, binder till formgivaren receptorn och tystar neural aktivitet men är i övrigt biologiskt inert 1,3. Transporter av CNO från leverantörer kan variera i konsistens. Föreningen bör anlända som ett pulver, som inte vidhäftar till sidorna av behållaren.
Viktiga kontrollgrupper att tänka på: För att kontrollera för icke-specifika effekter av designern drogen, före beteendetestning, ingjuta en annan uppsättning försöksråttor (dvs de som uttrycker designer receptor) med vehikelinjektioner stället för CNO. Dessutom, för att kontrollera icke-specifika effekter av konstruktören receptom innefattar en grupp av råttor som är infunderade med en kontrollvirus som innehåller en fluorescerande reporter men inte den modifierade designern receptom och injicera dessa råttor med designern drogen (dvs., CNO) . Ensure tillräcklig experimentell design genom att motverka över grupper.
Verifiera uttryck av konstruktionen: Det finns ett antal sätt för att maximera expression och detektering av designern receptom. Före infusion, kontrollera att den virala titern är nära 10 12 partiklar / ml. Ofta visualisering av fluorescerande reporter är låg och således, är det rekommenderat att immunohistokemi utföras på regionen av intresse med användning av antikroppar riktade mot reportern (er) som ingår i det virala konstruktet 25. I detta exempel ger anti-GFP-immunreaktivitet en robust signal (figurerna 4B - D). Viktigt är på grund av arten av fluorescensmärkningar, begränsa längden på fixeringstiden till 2 h.
Fördelar med de tekniker
När virus konstruktionen har levererats till hjärnan via stereotaktisk kirurgi tillåter farmakogentillvägagångssättet för tillfälliga inactiveringen av hjärnaktivitet i diskreta områden med hjälp av en minimalt invasiv systemisk injektion av formgivare läkemedlet. Läkemedelsbehandling kan förekomma flera gånger, vilket är fördelaktigt för beteende uppgifter som förekommer över successiva dagar eller veckor 12,24,26. Vidare uppgifter tyder på att designern drogen (CNO) inte stör rörelsebeteende eller aptit 27,28. Sålunda tillhandahåller metoden möjlighet att dämpa neural aktivitet under en kort tidsperiod (2-5 h), samtidigt som man undviker stressorer är inneboende i andra metoder för tillfällig inaktivering. Speciellt i kanyle studier, är tillfälligt inaktive uppnås genom leverans av neurotoxiner via kanyler som är permanent fästa vid skallen. Detta tillvägagångssätt begränsas genom att hålla kanylen fri från skräp och skyddas är utmanande. Vidare att inducera inaktivitet djuren hanteras i stor utsträckning (för att administrera toxinet genom kanyler) strax före beteendetestning, WHIch ålägger stress på djuret och ökar också sannolikheten för att kanylen kan rubba från skallen. Eftersom effekterna av CNO är relativt kort sikt, är risken för långsiktiga kompensationsmekanismer (såsom de som observerats efter permanenta skador eller genetiskt modifierade möss) minimeras 29,30.
Begränsningar av de tekniker
DREADD är en relativt ny metod för att icke-invasivt dämpa neuronal aktivitet. Som sådana praktiker kan vara benägna att verifiera att neuronal tysta sker i deras framställning. Kontroll kan utföras med elektrofysiologiska metoder, men dessa försök är tidskrävande, dyrt och kräver särskild sakkunskap. Dessutom, medan chemogenetic tekniker är billigare än optogenetik, är tillvägagångssättet dyrare än traditionella inaktive med farmakologiska medel, såsom TTX. En annan begränsning hos den DREADD tillvägagångssätt är att Infusjon av de virala konstruktionerna inte resulterar i 100% infektion i neuroner i regionen av intresse, inte heller inaktivering via CNO ledning till 100% reduktion av neuronal aktivitet. Slutligen kan vissa AAV serotyper vara retrograd transporteras som kan försvåra tolkningen av experimentella resultat 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar författarna et al. Robinson 12 för deras bidrag till manuskriptet från vilken detta protokoll delvis kommer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
