Abstract
Denne protokol beskriver, hvordan man midlertidigt og eksternt tavshed neuronal aktivitet i diskrete hjerneregioner mens dyrene er engageret i indlæring og hukommelse opgaver. Tilgangen kombinerer farmakogenetik (Designer-receptorer-Udelukkende-Aktiveret-by-Designer-Drugs) med en adfærdsmæssig paradigme (sensorisk konditionering), der er designet til at skelne mellem forskellige former for læring. Specifikt viral-medieret levering anvendes til at udtrykke en genetisk modificeret inhiberende G-protein-koblet receptor (Designer Receptor) i et diskret område af hjernen hos gnavere. Tre uger senere, når designer receptor ekspressionsniveauer er høje, er et farmakologisk middel (Designer Drug) administreres systemisk 30 min før en bestemt adfærdsmæssige session. Lægemidlet har affinitet for designeren receptoren og således resulterer i inhibering af neuroner, som udtrykker designeren receptoren, men er ellers biologisk inert. Hjernen regionen forbliver tavshed for 2-5 timer (DEPENding af dosis og administrationsvej). Ved afslutning af det adfærdsmæssige paradigme, er hjernevæv vurderet for korrekt placering og receptorekspression. Denne tilgang er særlig nyttig til bestemmelse af bidraget fra individuelle hjerneregioner til specifikke komponenter i adfærd og kan anvendes på tværs af ethvert antal adfærdsmæssige paradigmer.
Introduction
En spændende udfordring inden for adfærdsmæssige neurovidenskab er at bestemme de neurale substrater af komplekse adfærd. En række teknikker såsom permanente læsioner, midlertidig hjerne inaktivering via kanyler implantater og optogenetics har været anvendt til at identificere de bidrag diskrete hjerneområder til underkomponenter komplekse adfærd. Mens disse tilgange informere vores forståelse af regional specificitet under læring, hver teknik er ikke uden begrænsninger. Specifikt permanente læsioner typisk før adfærdsmæssig testning, således deres virkninger er til stede under hele varigheden af paradigme. Kanylering undersøgelser, der involverer præsentationen af en kortsigtet neurale inaktivator (f.eks tetrodotoxin) kan producere betydelig skade på hjernevæv og kan fremkalde stress hos individer lige inden adfærdsmæssige test. Endvidere er inaktivering gennem kanylering begrænset til området af væv, der omgiverspidsen af kanyler. Endelig mens optogenetics tilbyder en række fleksibilitet for den tidsmæssige styring af aktivitet i bestemte områder af hjernen, det er omkostningseffektivt uoverkommelige og teknisk krævende.
Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af en farmakogenetisk tilgang (Designer-Receptorer-Udelukkende-Aktiverede-by-Designer-Drugs, DREADDs) 1,2. Vigtigere er det, mens begrebet farmakogenetik er sofistikeret, udførelsen af teknikken er ligetil. Lig traditionelle stereotaksiske kirurgiske metoder, som involverer infusion af toksin (f.eks NMDA, ibotensyre) i diskrete hjerneområder involverer denne teknik infusion en adeno-associeret virus (AAV), som indeholder et DNA-fragment til et ændret inhiberende G-protein-koblet receptor (hM4Di; designeren receptor) i området af interesse af standard laboratorie gnavere (se figur 1). Den virale vektor indeholder også en fluorescerende reporter (mcitrine). Når indarbejdet itil celler, er designeren receptor (og reporter protein) maksimalt udtrykt ~ 3 uger efter infusion og kan aktiveres selektivt i 2-5 timer ved systemisk administration af den ellers biologisk inert Designerdrug, clozapin-N-oxid (CNO) 1 3. Fordi forsøgslederen er udstyret med præcise, men remote tidsmæssig kontrol over neurale aktivitet i bestemte områder af hjernen, farmakogenetik kombinerer særdeles godt med adfærdsmæssige paradigmer, der er gennemført i flere faser. I dette eksempel, at bidraget fra retrospenialis cortex (RSC) stimulus-stimulus læring i forhold til sin rolle i pavlovsk læring, men denne kombination af metoder er velegnet til et vilkårligt antal spørgsmål, der søger at identificere, hvordan specifikke hjerneområder bidrager til kompleks adfærd.
Hertil kommer, mens der ikke er beskrevet i denne protokol, virale og transgene metoder kan bruges til at opnå celletype-specifik DREADD udtryk 2. Som jegs iboende adfærdsmæssige paradigmer, der involverer farmakologiske og / eller andre typer af eksperimentelle manipulationer, nøje overvejelse af eksperimentel design og efterfølgende kvantitativ analyse er påkrævet, når ansætte de DREADD tilgang. Eksperimentatorer nye til DREADD tilgang henvises til en omfattende gennemgang af nuværende DREADD teknologi 2.
Hver dag, lære organismer om nye stimuli og begivenheder og deres relationer til hinanden. Selv i et velkendt miljø, såsom hjem, den ene er hurtig til at opdage ændringer i forholdet mellem stimuli, fordi disse ændringer kan være prædiktiv for meningsfulde begivenheder. Sådan stimulus-stimulus (dvs. relationelle) læring involverer konjunktion af multiple stimuli og har traditionelt været forbundet med hippocampus, som er placeret centralt inden i mediale tindingelappen 4. Men hippocampus ikke eksisterer heller handle i isolation; kortikale regioner både inden for og udside af den mediale tindingelappen tilvejebringes en kritisk sensorisk information til hippocampusformationen 5-7. Traditionelle permanente læsion undersøgelser leverer overbevisende dokumentation for inddragelse af en række kortikale regioner (f.eks, de retrospenialis, postrhinal og entorhinal cortex) i hippocampus-afhængig læring, men er begrænset i deres evne til at skelne rollen som en bestemt region under diskrete faser af learning 8-10.
Den nuværende protokol tester den hypotese, at RSC er nødvendig for stimulus-stimulus læring ved tavshed RSC i løbet af en enkelt fase af et 3-faset sensorisk konditionering paradigme 11,12. Kort beskrevet rotter modtager infusioner af et AAV, der indeholder designeren receptoren og ~ 3 uger senere indgives den Designerdrug (CNO) 30 min før starten af adfærdsmæssige test. I nærværende protokol, eksperimentelle rotter modtager CNO under den første fase af test (når stimulus-stimulus learning sker), og de modtager køretøjet i løbet af de næste 2 faser i test. For at kontrollere for utilsigtede virkninger af CNO på adfærd, indgyde rotter med designeren receptoren (hM4Di) og injicere med bilen i stedet for CNO. At tage højde for generelle virkninger af viral infusion og receptorekspression, indgyde en kontrol virus, der ikke indeholder designeren receptoren og administrere CNO.
Et antal forskellige serotyper af AAV anvendes til at levere genetisk materiale. De nuværende NIH retningslinjer for forskning med rekombinante eller syntetiske molekyler anført, at AAV (alle serotyper) og rekombinante eller syntetiske AAV-konstruktioner, i hvilke transgenet ikke koder enten en potentielt tumorigene genprodukt eller et toksinmolekyle og fremstilles i fravær af en hjælpervirus, kræver BSL-1 forholdsregler (Appendiks B-1. Risk Group 1 (RG1) Agenter) 13. En række anmeldelser vedrørende AAV struktur, bryggers og sikkerhed er til rådighed 14,15. Navnlig, men, På grund af bekymringer vedrørende mulige reproduktive 16,17 og potentielle kræftfremkaldende mekanismer 18-20 i gnavere, nogle institutioner kræver brug af BSL-2 forholdsregler, når du arbejder med AAV. Kontroller den korrekte BSL før brug ved at rådføre sig med tilsyn udvalg på de enkelte institutioner, hvor vil blive udført forskning, Centers for Disease Control og NIH retningslinjer for forskning med rekombinant DNA-molekyler 13 ved brug af virale vektorer for genmanipulation i USA. Personlige værnemidler, investigator uddannelse, vektor indeslutning, dekontaminering, bortskaffelse af dekontamineres materialer, og efter injektion dyr boliger krav specificeres af disse retningslinjer. Desuden høre og følge passende Institutional Animal Care og Brug retningslinjer udvalgsmøder eller tilsvarende institutionelle retningslinier tilsyn udvalgsmøder for at sikre en sikker håndtering, administration og bortskaffelse af AAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelse af dyr godkendes af Oberlin College Institutional Animal Care og brug udvalg og er i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr 21.
1. Forberedelse til Viral Infusion
Bemærk: Denne protokol bruger BSL-1 forholdsregler. Når der anvendes BSL-2 sikkerhedsforanstaltninger, en engangs kittel, handsker, skoovertræk, øje beskyttelse og et åndedrætsværn (type N95) skal udfyldes. Alle personer, der håndterer BSL-2-forbindelser skal passe testes for en åndedrætsværn af en lokal offentlig sundhed agentur. Se Lowery & Majewska (2010) 22 for yderligere oplysninger om håndtering og opbevaring af virale vektorer.
- Ved første brug, portion og opbevare ubrugt virus i 20 pi mikrocentrifugerør at undgå gentagen nedfrysning og optøning.
- Forbered arbejdsfladen ved at fjerne alle unødvendige genstande og sterilisering overfladen med 70% ethanol. Forbered en 10% blegeopløsning til dekontaminering AAV affald. Placer et bæger fyldt med blegemiddel løsning og en steril 10 pi sprøjte på arbejdsfladen. Placer mikrocentrifugerør med AAV i en beholder med knust is under opsætning.
- Placer mikrocentrifugerør med virus i en standard bænk skruestik. Indlæse en 10 pi sprøjte med mindst 4 pi AAV. Pas på ikke at bøje spidsen af sprøjten mod bunden af mikrocentrifugerør under lastning. Sikre, at der ikke er luftbobler i de 4 pi AAV opløsning i sprøjten.
- Bortskaf den tomme virus rør i bægerglas, der indeholder 10% blegemiddel. Opbevar ubrugte dele af virus som angivet af leverandøren.
- Tilsæt yderligere 10% blegemiddel til affaldscontaineren, og tillade affald at sidde i 30 minutter før anbringelse af dekontaminerede flydende affald.
- Bortskaf alt værnemidler og plastaffald i en biologisk beholder som angivet af institutionelle retningslinier. Decontaminate et udstyr eller overflader, der kom i kontakt med virussen ved anvendelse af 10% blegemiddel.
2. Kirurgi
- Forbered kirurgiske område ved at placere absorberende bænk papir under stereotaktisk apparat og på et tilstødende rum betegnet som en dedikeret virus håndtering område.
- Placer en blegemiddel affaldsbeholder på 10% i det dedikerede virus håndtering område nær kirurgiske apparater.
- Inducere et stabilt niveau af anæstesi og forberede rotten til operation.
- Placer rotte i en induktion kammer, der indeholder en blanding af isofluran gas (fra 1 til 3%) og oxygen (100% ved ca. 1 l / min), indtil der er et tab af bevidsthed og manglende brutto målrettet bevægelse. Opretholde isofluran anæstesi hele den kirurgiske procedure.
- Efter 6 dyb anæstesi er opnået, barbere rotten fra mellem øjnene til lidt bag ørerne.
- Placer rotten tilbage i induktion kammer til enyderligere 1-3 min.
- Sikre, at isofluran anæstesi er forbundet til næsekeglen af stereotaktisk kirurgi. Der åbnes for hanen på isofluran slange til at begynde strømmen af isofluran til stereotax. Opretholde isofluran og ilt på de niveauer, der er specificeret ovenfor.
- Placer rotte i en stereotaktisk apparat ved at fastgøre munden på bid bar og fastgøre øre barer.
- Anvend øjet smøremiddel for øjnene og betadine til det kirurgiske sted før incision.
- Foretag en 2,4 cm midtlinie incision i huden på den dorsale overflade af kraniet startende ca. 2 mm caudale for øjnene. Tilbagetrække huden for at blotlægge kraniet. Periodisk indgyde steril 0,9% sterilt saltvand i udkanten af det kirurgiske sted for at forhindre væv fra tørring.
- Klart membranøs væv fra kraniet indtil bregma og lambda er klart synlige.
- Sørg for, at kraniet er niveauet ved at måle dorsale-ventrale koordinater påbregma og lambda. Juster stereotaktisk anordning i overensstemmelse hermed, indtil dorsal-ventral koordinater på bregma og lambda afviger højst 0,04 mm.
- På dette tidspunkt, reducere isofluran gas til mellem 2 og 2,5%.
- Boret Retur til bregma, nulstilles igen koordinaterne og derefter flytte boret til den ønskede mediale-laterale og anterior-posterior koordinat.
- Bor et hul i koordinatsystemet under anvendelse af et 0,9 mm bor som det frembringer en passende størrelse hul til en 28 G infusion sprøjte.
- Indstil infusionspumpen at afgive virus ved en hastighed på 0,2 ul / min. Placer sprøjten i infusionen arm stereotaktisk apparat og sænk sprøjten til den ønskede koordinat. Levere den ønskede mængde af virus (spænder fra 0,1 til 0,8 pi). For eksempel leverer 0,8 pi AAV løbet af 4 minutter.
Bemærk: at gennemføre pilotundersøgelser for at bestemme den ideelle infusion volumen og den typiske spredning af virus i hver region af interesse.- Efter levering af virussen er complete forlade sprøjten på plads i 10 min for at forhindre tilbagestrømning ind i nålen tarmkanalen. Langsomt hæve sprøjten med en hastighed på ca. 5 mm / min. Gentag, indtil alle koordinater er blevet tilført AAV.
- Lukke såret ved hjælp af kirurgiske hæfteklammer og pels såret med aktuelt antibiotisk salve.
- Følg institutionelle retningslinier for postoperativ smertebehandling.
- Placer rotte i et bur med sengetøj, et låg og korrekt skiltning og returnere rotten til dyret facilitet.
- Hvis arbejder under BSL-2 forholdsregler, indsamle strøelse for mængden af tid (typisk 48-72 timer) er angivet af institutionelle retningslinier. Placer strøelse i en biologisk affaldsbeholder.
- Aflever alle AAV-kontamineret materiale som angivet af retningslinjer for sikker bortskaffelse.
3. Behavioral Apparatur
Bemærk: Den sensoriske konditionering Apparatet består af en standard operant konditionering chamber (12 "L x 9.5" W x 11,5 "H) med en rustfri stål gitter etage, 2 plexiglas sidevægge og 2 metalvægge.
- Montere en 2,8 W lys på en af aluminium vægge til at tjene som huset lys og den visuelle stimulus når flashed på 2 Hz. Montere en højttaler på kammeret til at levere de auditive stimuli (en 10 sek, 1500 Hz, 78 dB ren tone og en 10 sek 78 dB hvid støj).
- Brug en fødevare tragt til at levere 45 mg foderpiller til fødevaren kop. Inden maden kop, infrarøde fotoceller registrerer den samlede tid brugt i maden cup før, under og efter præsentationer af de stimuli og fødevarer belønninger.
- House kamrene i lyd-formildende kabinetter (22 "W x 22" H x 16 "D) udstyret med udsugnings (~ 68 dB).
- Brug en PC computer med Med Associates software til at styre operant kammer og erhverve data. Under Conditioning sessioner, indsamle data om den samlede tid brugt med hovedet i maden cup under Presentaning af lyset stimulus (5 sek epoke) og under præsentationen af fødevarer belønning (5 sek epoke). Under Test session, indsamle data om den samlede tid brugt i maden cup som reaktion på præsentationer af de auditive stimuli (10 sek epoke begyndelsen, når de auditive stimuli afsluttes).
4. Oversigt over Sensory Forkonditionering Paradigm
- Efter genvinding fra kirurgi, efterhånden fødevarer begrænse rotterne til 85% af deres fri fodring kropsvægt. Konsultere veterinære personale for en passende mad begrænsning paradigme.
Bemærk: 3-faset sensorisk forkonditionering paradigme er illustreret i figur 2. - Forkonditionering Sessions (fase 1; Daily 64 min træning udført på 4 dage i træk):
- Nuværende rotter med 12 sammenblandede forsøg, der består af levering af auditive og visuelle stimuli. Medtag mellemrum mellem forsøg, at gennemsnit 4,5 min (interval 4,0 til 5,0 minutter) efter hver enuditory præsentation.
- Den 6. af de forsøg, til stede en tone (prækonditioneret stimulus) til 10 sek, umiddelbart efterfulgt af en 5 sek præsentation af blinkende lys stimulus.
- På den anden 6 forsøg, præsentere den hvide støj (uparret stimulus) alene i 10 sek.
- Conditioning sessioner (fase 2; Daily 64 min træning udført på 5 på hinanden følgende dage):
- Nuværende rotter med 8 forsøg, der består af levering af den visuelle stimulus (det blinkende lys stimulus) i 5 sek umiddelbart efterfulgt af levering af to 45 mg foderpiller. Medtag mellemrum mellem forsøg, at gennemsnit 7 min (interval 6,0-8,0 min) efter hvert forsøg. Lejlighedsvis rotter kræver mere end 5 conditioning sessioner at lære let mad foreningen.
- Test Session (fase 3, en enkelt 78 min session):
- Præsenter rotterne med 12 sammenblandede forsøg, der består af levering af de auditive stimuli alene. Omfatter inter-forsøg intervaller, der average 4,5 min (interval 4,0 til 5,0 minutter) efter hver auditiv præsentation.
- Præsenterer Den 6. af forsøgene tonen stimulus (det klargjort stimulus) alene i 10 sek.
- På den anden 6 forsøg, præsentere den hvide støj (den uparrede stimulus) alene i 10 sek.
- Opveje de stimuli ved at afslutte undersøgelsen med et andet sæt rotter, der modtager den hvide støj som den prækonditionerede stimulus og tonen som den uparrede stimulus.
5. Farmakologiske og adfærdsmæssige Procedure
- Tænd for strømmen til adfærdsmæssige apparat og indlæse Med-PC kode for passende adfærdsmæssige session. Wire og program den adfærdsmæssige apparat, således at fans, der er monteret på lyddæmpende kabinetter tændes, når strømmen er tændt.
- For at fremstille en ml opløsning af clozapin N-oxid (CNO) 1 mg / afvejes 5,0 mg CNO til et 15 ml konisk rør, og der tilsættes 5 ml sterilt vand eller 5 ml sterilt 0,9% saline. Vortex indtil opløsningen er klar.
- Hvis CNO ikke opløses i opløsning eller hvis der ønskes mere koncentrerede opløsninger af CNO tilføje et solubiliseringsmiddel, såsom DMSO 23. Specifikt for at fremstille en opløsning af CNO 1 mg / ml med 0,5% DMSO, vejer 5,0 mg CNO og tilsættes 25 pi DMSO til et 15 ml konisk rør. Flick forsigtigt sikre, at indholdet forbliver i bunden af røret. Når opløsningen bliver klar, tilsættes 5 ml sterilt vand eller 5 ml sterilt 0,9% saltvand. Yderligere anvisninger til fremstilling af opløsninger af CNO findes på DREADD wiki ressource side 25.
- Forbered en ny CNO løsning hver dag, at det administreres.
- Injicer CNO intraperitonealt i en dosis på 1 mg / kg ca. 30 minutter før adfærdsmæssig testning. For eksempel indsprøjte en 200 g rotte med 0,2 ml af 1 mg / ml CNO opløsning. Dosis og tidsforløbet af CNO administration blev valgt ud fra tidligere publicerede rapporter 2,12.
- Injicere CNO 30 min før hver forkonditionering session (fase 1; i alt 4 dage med injektioner), men administrere bilen forud for alle efterfølgende adfærdsmæssige sessioner.
- Efter 30 min placere rotterne i de adfærdsmæssige test kamre og indlede computerkode til den relevante adfærdsmæssige session.
- Ved afslutning af det adfærdsmæssige opgave, straks at fjerne de rotter fra kamrene og returnere rotterne til dyret koloni.
6. Analyser af Behavioral data
Bemærk: Den afhængige variabel for alle adfærdsmæssige sessioner er den mængde tid, som rottens hoved er inde foderskålen som påvist ved afbrydelse af de infrarøde fotoceller i foderskålen. Dataene (i sek) indsamles og registreres af computersoftware.
- Må ikke foretage analyser på data genereret under forkonditioneringsfasen.
- For conditioning sessioner: analysere hver rotter 'enhed for at lære den let mad association ved at sammenligne mad cup opførsel under præsentationen af den visuelle stimulus på tværs af de 5 adfærdsmæssige sessioner. Konkret beregne den gennemsnitlige tid brugt i maden cup under 5 sek lys epoke for hver af 8 forsøg / session (dvs. i gennemsnit 8 forsøg, der hver 5 sek i varighed / rotte). Sammenlign gennemsnitlige kontrol og eksperimentelle værdier for hver af 5 daglige sessioner (se figur 3A).
- Analyser rotterne motivation for at opnå mad belønning ved at sammenligne mad cup opførsel under leveringen af den mad belønning (5 sek epoke) på tværs af de 5 adfærdsmæssige sessioner ved hjælp af den samme beregning som angivet for 5 sek lys epoke ovenfor. Disse værdier vil være konsekvent højere end dem, der erhverves under præsentationen af den visuelle stimulus (se figur 3B).
- Til testen session: beregne en diskrimination ratio, der beskriver rotternes mad cup adfærd som reaktion på presentations af hver auditive stimulus.
- Specifikt for hver rotte, opdele den gennemsnitlige tid brugt i maden cup efter hver af 6 præsentationer af den sensoriske prækonditioneret stimulus (dvs. tonen) med summen af den gennemsnitlige tid brugt i maden cup efter hver af 6 præsentationer af sensorisk prækonditioneret stimulus (dvs. tonen stimulus) plus gennemsnittet af den samlede tid tilbragt i foderskålen efter hver af 6 præsentationer af den uparrede stimulus (dvs. den hvide støj stimulus). Hver epoke er 10 sek varighed.
Bemærk: En diskrimination score på 0,5 eller derover, viser, at rotter lært foreninger der ligger i den sensoriske konditionering paradigme.
- Specifikt for hver rotte, opdele den gennemsnitlige tid brugt i maden cup efter hver af 6 præsentationer af den sensoriske prækonditioneret stimulus (dvs. tonen) med summen af den gennemsnitlige tid brugt i maden cup efter hver af 6 præsentationer af sensorisk prækonditioneret stimulus (dvs. tonen stimulus) plus gennemsnittet af den samlede tid tilbragt i foderskålen efter hver af 6 præsentationer af den uparrede stimulus (dvs. den hvide støj stimulus). Hver epoke er 10 sek varighed.
7. Verifikation af AAV Placering og Expression
- Bedøver og perfundere rotterne transkardialt anvendelse af 4% paraformaldehyd. På grund af anvendelsen af fluorescerende mærker, ikke overstiger en post-fiksering på cirka 2 timer til minimize tab af antigenicitet og bevare det fluorescerende signal.
- Dehydrere perfunderet hjerner ved at overføre dem til en hjerne beholder indeholdende 30 ml af en 20% saccharose-opløsning i phosphatbufret saltvand (1x) i mindst 2 dage, eller indtil hjernen synker til bunden af hjernen jar.
- Brug en indefrysning glidende mikrotom at gøre koronale hjernen sektioner (20-40 um) i hele rostrocaudal udstrækning af området af interesse.
- Gennemføre immunhistokemi rettet mod det mærkede receptor eller reporterproteinet at fastslå, hvor og ekspression af designeren receptoren og / eller reporter 12. En immunhistokemisk farvning protokol findes på DREADD wiki ressource side 25.
- Monter afsnittene onto SuperFrost-plus dias og dækglas bruger 100-200 pi af en vandig montering medium.
- Udfør fluorescensmikroskopi på hjernevæv at verificere AAV placering og proteinekspression 12,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adfærdsmæssige resultater
Ved afslutningen af forsøget, bør effektiviteten af områdespecifikke midlertidig inaktivering kvantitativt og kvalitativt vurderet. Det foreliggende eksempel involverer en 3-faset adfærdsmæssige paradigme (sensorisk forkonditionering), hvori CNO blev administreret til at dæmpe neurale aktivitet i RSC Under forkonditioneringen sessioner til at teste den hypotese, at RSC er nødvendigt for dannelsen af foreninger blandt neutrale stimuli 12. Vigtigere er eksperimentatorer ikke begrænset til den adfærdsmæssige paradigme eller eksperimentelt design beskrevet heri som farmakogenetiske fremgangsmåde kan kobles med de fleste adfærdsmæssige paradigmer.
Hvorimod analyser ikke udføres typisk på data genereret i løbet af konditionering sessioner (fase 1), er det vigtigt at kvantificere, om rotter lærte let mad forening under Conditioning sessioner (fase 2). Som vist i figur 3A, både eksperimentelle (Eksp) og Kontrol (Ctrl) rotter demonstrerer stigende mad cup opførsel under præsentationer af lys stimulus (figur 3A) indikerer, at rotter erhvervet en pavlovsk sammenhæng mellem det visuelle stimulus (lys) og fødevarer belønning. Desuden demonstrere begge grupper stigende mad cup opførsel under præsentationen af fødevarer belønning (figur 3B) angiver tilsvarende motivation til at opnå belønning. Under den kritiske Test session, når de auditive stimuli er præsenteret i fravær af andre stimuli, kontrolrotter har en diskrimination score, der er signifikant forskellig fra eksperimentelle rotter (figur 3C). Visuel inspektion af grafen viser, at det gennemsnitlige forhold diskrimination af kontrolrotter er større end 0,5, indikerer større fødevarer cup adfærd som reaktion på præsentationer af den auditive stimulus, som blev parret med lys (Under forbehandlingen) i forhold til deres fødevarer cupadfærd som reaktion på præsentationer af den auditive stimulus, som blev pardannelsen (under Forkonditionering). I modsætning hertil forsøgsrotter undlader at påvise en forskel score, der er over chance. Således Figur 3C viser, at kontrol- men ikke eksperimentelle rotter viste den sensoriske forkonditionering virkning.
Verifikation af AAV Placering
Ved afslutningen af adfærdsmæssige test, analysere rottehjerne væv til korrekt placering og ekspression af designeren receptoren. Adfærd immunhistokemi 12,25 med primære antistoffer rettet mod en receptor tag (f.eks et anti-HA-primært antistof) eller fluorescerende reporter (i dette eksempel, mcitrine som detekteres af et antistof til grønt fluorescerende protein (GFP)). En skematisk gengivelse af et koronale snit gennem rottehjernen er vist i figur 4A. Figur 4B illustrerer robust fluorescerende immundetektion af reporter prot. Ein i RSC i et repræsentativt eksperimentel rotte uden fluorescerende mærke detekteret i omkringliggende regioner figurerne 4C - D illustrerer repræsentative fluorescerende mærkning af reporter-proteiner i eksperimentel (Eksp; rotter blev infunderet med en AAV-konstruktion indeholdende designeren receptor genet og mcitrine genet ) og kontrol (Ctrl; rotter blev infunderet med en lignende AAV-konstruktion indeholdende GFP-genet, men ingen sekvens for designeren receptor) rotter, henholdsvis. Receptor-niveauer kan også vises som minimum, repræsentativ og maksimal udtryk 24. Hvis der registreres mærkning i områder uden for det område af interesse, udelukke disse data fra de adfærdsmæssige analyser.
Figur 1:. Skematisk diagram af AAV konstruere et diagram over hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV plejede at express den hæmmende designer receptor (hM4Di) under en neuronal specifik synapsin promotor (hSyn) i RSC neuroner. Immunfluorescerende reportere (HA-tag og / eller mcitrine) kan anvendes til at visualisere ekspression af proteinet og reporter hhv. hSyn, humant synapsin promotor; specificerer ekspression i neuroner. HA, hemagluttinin tag; dette mærke fusioneres til designeren receptoren og tjener som et epitopmærke muliggør påvisning af receptorekspression. hM4Di, genet for designeren inhibitoriske G-protein-koblet receptor. IRES, internt ribosom entry site; gør det muligt for journalisten (mcitrine) der skal oversættes. mcitrine, en fluorescerende reporter, som er en variant af GFP men er mere resistente over for fotoblegning.
Figur 2: Skematisk diagram af den sensoriske konditionering paradigme (A) I Forkonditionering sess.ioner, er 12 sammenblandede forsøg fremlagt. I løbet af 6 af forsøgene, er en auditiv stimulus præsenteret i 10 sek umiddelbart efterfulgt af en blinkende hus lys stimulus (2 Hz, i 5 sek). I løbet af de øvrige 6 forsøg er en anden auditiv stimulus præsenteres uden en visuel stimulus. (B) I de Conditioning sessioner, er den tidligere parrede visuelle stimulus parret med mad belønning. (C) Under Test session, er der 12 blandet præsentationer af de to auditive stimuli i mangel af visuelle stimuli eller mad. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Adfærdsmæssige resultater Gennemsnitlige fødevarer cup svare under (A) Lys og (B) Food epoker DUring de Conditioning sessioner (fase 2). Data blev analyseret ved anvendelse af gentagne målinger variansanalyse. (C) Forskelsbehandling nøgletal under testen session (fase 3). Den stiplede linje angiver lige store mængder af konditioneret fødevarer cup reagerer på hver auditive stimulus (dvs. ingen sensorisk konditioneringsmetoder) Data blev analyseret under anvendelse af uafhængige prøver t-test. Expt; eksperimentelle rotter (n = 17) infunderes med en AAV-konstruktion indeholdende DNA-sekvensen for den inhibitoriske G-protein-koblet receptor designer (hM4Di) og DNA-sekvensen for et fluorescerende reporter (mcitrine). Ctrl; kontrolrotter (n = 6) infused med hM4Di og administreret bærer kombineret med kontrolrotter (n = 4) infunderes med en AAV-virus, der ikke indeholder designeren receptoren, og der er blevet indgivet CNO. Kontrolgrupper afveg ikke signifikant fra hinanden (p> 0,05). Fejlsøjler angiver ± SEM.
Figur 4: Histologisk verifikation af protein-ekspression (A) En skematisk illustrerer placeringen af RSC i en koronal snit gennem rottehjernen.. (B) Repræsentative billeder af immunhistokemisk mærket rotte hjernevæv fra en eksperimentel rotte (Eksp), der blev infunderet med en AAV-konstruktion indeholdende DNA-sekvensen for den inhibitoriske G-protein-koblet receptor designer (hM4Di) og DNA-sekvensen for et fluorescerende reporter ( mcitrine). mcitrine er et meget lysægte variant af grønt fluorescerende protein. (C) Repræsentativ billede fra en eksperimentel rotte illustrerer placeringen af det fluorescerende reporter etiket (mcitrine). (D) Repræsentativ billede fra en kontrolrotte (Ctrl) infunderes med en AAV-konstruktion indeholdende DNA-sekvensen for et fluorescerende reporter (udvidet GFP). Scale barer: B, 500 um; C og D, 10081;. M Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man anvender en farmakogenetisk tilgang (DREADD) at undersøge, hvordan en bestemt område af hjernen bidrager til en multi-fase kompleks læring opgave. Med evnen til midlertidigt og eksternt tavshed neurale aktivitet i diskrete områder af hjernen tværs faser af læring, denne kombination af metoder giver en platform til at undersøge en bred vifte af adfærd, herunder mere nuancerede eller maskerede former for læring. I den beskrevne i denne protokol eksempel styre rotter og rotter, som udtrykker designeren receptoren i cortex retrospenialis (RSC) blev testet i et 3-faset adfærdsmæssige opgave 12. Den første fase af opgaven involverede præsentation af flere neutrale stimuli med den antagelse, der styrer rotter ville erhverve en stimulus-stimulus association mellem to af de stimuli. Arbejdsgruppen hypotese er, at RSC er nødvendig for stimulus-stimulus læring således på hver af 4 conditioning dage, 30 min før starten af adfærdsmæssige testmaterialer, kontrol og eksperimentelle rotter blev givet systemisk administration af enten Designerdrug (CNO) eller vehikel. Når de bindes til designeren receptoren, CNO nedsætter aktiviteten af neuroner, hvor denne receptor udtrykkes. I de resterende faser af adfærdsmæssig condition og afprøvning, når RSC ikke antages at påvirke læring, blev CNO ikke administreret og derfor neurale aktivitet var ikke forstyrres.
Kritiske trin i protokollen
Sikker håndtering af AAV forbindelser: De kirurgiske procedurer er involveret i farmakogenetiske tilgang er ikke mere teknisk krævende end en simpel stereotaktisk infusion, men brugen af AAV på nogle institutioner kræver, at eksperimentatorer overholde BSL-2 forholdsregler. Det er afgørende, at efterforskerne følger de retningslinjer, som Centers for Disease Control, finansieringsorganer, hjem institutioner og andre tilsynsudvalg specifikke for deres forskningsprogram. Oplysninger om the sikker håndtering af AAV'er er let tilgængelige 13.
Forberedelse og administration af Designerdrug: CNO, designeren lægemiddel binder til designeren receptoren og tavshed neurale aktivitet, men er ellers biologisk inaktivt 1,3. Overførsel af CNO fra leverandører kan variere i konsistens. Forbindelsen skulle ankomme som et pulver, der ikke er klæbet til siderne af beholderen.
Vigtige kontrolgrupper at overveje: For at kontrollere for ikke-specifikke virkninger af Designerdrug, før adfærdsmæssige test, indgyde et andet sæt eksperimentelle rotter (dvs. dem, der udtrykker designeren receptor) med køretøjets injektioner i stedet for CNO. Derudover, for at kontrollere for ikke-specifikke effekter af designeren receptoren omfatter en gruppe rotter, der er infunderet med en kontrol-virus, som indeholder en fluorescerende reporter, men ikke den modificerede designer receptoren og injicere disse rotter med Designerdrug (dvs. CNO) . Ensure tilstrækkelig eksperimentel design ved modvægt tværs grupper.
Verificere ekspression af konstruktionen: Der er en række måder at maksimere ekspressionen og påvisning af designeren receptoren. Før infusion, kontrollere, at den virale titer er nær 10 12 partikler / ml. Ofte visualisering af fluorescerende reporter er lav og dermed det anbefales, at immunohistokemi udføres på området af interesse under anvendelse af antistoffer rettet mod reporter (er), der indgår i den virale konstruktion 25. I dette eksempel anti-GFP immunoreaktivitet giver et stærkt signal (figur 4B - D). Vigtigt er det, på grund af arten af fluorescerende mærker, begrænse længden af fiksering tid til 2 timer.
Fordele ved Techniques
Når den virale konstruktion er blevet leveret til hjernen via stereotaktisk kirurgi, den farmakogenetiske metode giver mulighed for midlertidig inactirelse af hjerneaktivitet i diskrete områder ved hjælp af en minimalt invasiv systemisk injektion af Designerdrug. Lægemiddeladministration kan forekomme flere gange, hvilket er fordelagtigt for adfærdsmæssige opgaver, der forekommer på tværs af successive dage eller uger 12,24,26. , Beviser indikerer endvidere, at Designerdrug (CNO) ikke forstyrrer bevægeapparatet adfærd eller appetit 27,28. Fremgangsmåden giver mulighed for at dæmpe neurale aktivitet i et kort tidsrum (2-5 timer), og samtidig undgå de stressfaktorer forbundet med andre metoder til midlertidig inaktivering. Konkret i kanylering undersøgelser, er midlertidig inaktivering opnås ved levering af nervegifte gennem kanyler, der er permanent fastgjort til kraniet. Denne fremgangsmåde er begrænset ved, at holde kanylen fri for snavs og beskyttes, er udfordrende. Desuden at inducere inaktivitet dyrene håndteres udstrakt grad (til administration af toksinet gennem kanyler) lige før adfærdsmæssig testning, which pålægger stress på dyret og øger også sandsynligheden for, at kanyler kan løsne fra kraniet. Fordi virkningerne af CNO er relativt kort sigt er mulighed for langsigtede kompenserende mekanismer (såsom dem, der observeres efter permanente læsioner eller i gensplejsede mus) minimeres 29,30.
Begrænsninger af de teknikker
DREADD er en relativt ny metode til ikke-invasivt svækkende neuronal aktivitet. Som sådan eksperimentatorer kan være tilbøjelig til selvstændigt kontrollere, at neuronal nedregulering sker i deres forberedelse. Verifikation kan udføres ved hjælp af elektrofysiologiske metoder, men disse forsøg er tidskrævende, dyrt og kræver særlig ekspertise. Hertil kommer, mens chemogenetic teknikker er billigere end optogenetics, tilgangen er dyrere end traditionelle inaktivering med farmakologiske midler, såsom TTX. En anden begrænsning af DREADD tilgang er, at infusion af de virale konstruktioner ikke resulterer i 100% infektion af neuroner i området af interesse, og heller ikke inaktivering via CNO føring til 100% reduktion af neuronal aktivitet. Endelig kan nogle AAV serotyper være retrogradt transporteres som kan komplicere fortolkning af eksperimentelle resultater 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker forfatterne af Robinson et al. 12 for deres bidrag til manuskriptet, hvorfra denne protokol er delvist afledt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
