Abstract
Questo protocollo descrive come disattivare temporaneamente e in remoto l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre gli animali sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L'approccio combina farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-droga) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) che è stato progettato per distinguere tra le diverse forme di apprendimento. In particolare, la consegna virale-mediata è usato per esprimere un recettore G-proteina inibitrice geneticamente modificata accoppiata (Progettazione Receptor) in una regione del cervello discreta nei roditori. Tre settimane più tardi, quando i livelli di espressione del recettore del progettista sono alti, un agente farmacologico (Designer Drug) viene somministrato per via sistemica 30 minuti prima di una sessione specifica del comportamento. Il farmaco ha affinità per il recettore progettista e pertanto provoca l'inibizione di neuroni che esprimono il recettore progettista, ma è altrimenti biologicamente inerte. La regione del cervello rimane a tacere per 2-5 ore (Depending dalla dose e via di somministrazione). Al termine del paradigma comportamentale, tessuto cerebrale viene valutata per il corretto posizionamento e l'espressione del recettore. Questo approccio è particolarmente utile per determinare il contributo di regioni cerebrali singoli componenti specifici di comportamento e può essere utilizzato in qualsiasi numero di paradigmi comportamentali.
Introduction
Una sfida emozionante nel campo delle neuroscienze del comportamento è quello di determinare i substrati neurali di comportamenti complessi. Un certo numero di tecniche come lesioni permanenti, inattivazione cervello temporaneo tramite impianti cannule e optogenetics sono stati impiegati per identificare i contributi di regioni cerebrali discreti per sottocomponenti di comportamenti complessi. Mentre questi approcci informano la nostra comprensione della specificità regionale durante l'apprendimento, ogni tecnica non è senza limiti. In particolare, le lesioni permanenti sono tipicamente condotte prima della prova comportamentale, quindi sono presenti in tutta la durata del paradigma loro effetti. Studi Incannulazione che comportano la presentazione di un inattivatore neurali a breve termine (ad esempio, la tetrodotossina) in grado di produrre danni rilevanti al tessuto cerebrale e possono indurre lo stress in soggetti appena prima del test comportamentali. Inoltre, inattivazione tramite cannulazione è limitata alla regione di tessuto che circonda lapunta delle cannule. Infine, mentre optogenetics offre una gamma di flessibilità per il controllo temporale dell'attività in regioni specifiche del cervello, è costo proibitivo e tecnicamente esigenti.
Queste limitazioni possono essere superate con un approccio farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-Farmaci, DREADDs) 1,2. È importante sottolineare che, mentre il concetto di farmacogenetica è sofisticata, l'esecuzione della tecnica è semplice. Simili metodi chirurgici stereotassica tradizionali che prevedono l'infusione di tossina (ad esempio, NMDA, ibotenico) in regioni cerebrali discrete, questa tecnica comporta infondendo un virus adeno-associato (AAV) che contiene un frammento di DNA per un recettore G-proteina inibitoria modificato accoppiato (hM4Di; il recettore designer) nella regione di interesse di roditori di laboratorio standard (vedi Figura 1). Il vettore virale contiene anche un reporter fluorescente (mcitrine). Una volta costituita inalle cellule, il recettore designer (e proteina reporter) sono massimamente espressi ~ 3 settimane post-infusione e possono essere selettivamente attivati per 2-5 ore dalla somministrazione sistemica del farmaco progettista altrimenti biologicamente inerte, clozapina-N-ossido (CNO) 1 , 3. Poiché lo sperimentatore è dotato di preciso, ma a distanza di controllo temporale su attività neurale in specifiche regioni del cervello, farmacogenetica abbina particolarmente bene con paradigmi comportamentali che si svolgono in più fasi. In questo esempio, il contributo della corteccia retrosplenial (RSC) a stimolo-stimolo di apprendimento viene confrontato con il suo ruolo nell'apprendimento pavloviano, ma questa combinazione di approcci ben si adatta a qualsiasi numero di domande che cercano di identificare come specifiche regioni del cervello contribuiscono a comportamento complesso.
Inoltre, pur non descritto nel presente protocollo, approcci virali e transgeniche possono essere utilizzati per ottenere specifici tipi cellulari espressione DREADD 2. Come hos inerente a paradigmi comportamentali che coinvolgono farmacologici e / o di altri tipi di manipolazioni sperimentali, un attento esame del disegno sperimentale e la successiva analisi quantitativa è necessaria quando si impiega il metodo DREADD. Sperimentatori nuovi all'approccio DREADD si riferiscono a una rassegna completa delle attuali tecnologie DREADD 2.
Ogni giorno, gli organismi conoscere nuovi stimoli e gli eventi e le loro relazioni gli uni agli altri. Anche in un ambiente familiare, come la casa, uno è rapido per rilevare alterazioni nei rapporti tra stimoli perché questi cambiamenti possono essere predittivi di eventi significativi. Tale stimolo-stimolo (ad esempio, relazionale) apprendimento implica la congiunzione di stimoli multipli ed è stato tradizionalmente associato con l'ippocampo, che risiede in posizione centrale all'interno del lobo temporale mediale 4. Tuttavia, l'ippocampo non esiste nè agire isolatamente; regioni corticali sia all'interno e fuorilato del lobo temporale mediale fornire informazioni critiche sensoriali alla formazione dell'ippocampo 5-7. Tradizionali studi lesioni permanenti forniscono prove del coinvolgimento di un certo numero di regioni corticali (ad esempio, le cortecce retrosplenial, postrhinal e entorinale) nell'apprendimento ippocampo-dipendente, ma sono limitate nella loro capacità di discernere il ruolo di una regione particolare durante le fasi discrete di apprendimento 8-10.
Il presente protocollo verifica l'ipotesi che la RSC è necessaria per l'apprendimento stimolo-stimolo silenziando RSC durante una singola fase di un 3-fase di precondizionamento sensoriale paradigma 11,12. Brevemente, ratti ricevono infusioni di un AAV che contiene il recettore progettista e ~ 3 settimane dopo sono somministrato il farmaco designer (CNO) 30 min prima dell'inizio della prova comportamentale. Nel presente protocollo, i topi sperimentali ricevono CNO durante la prima fase di test (quando stimolo-stimolo learning si verifica) e ricevono veicolo durante i prossimi 2 fasi di test. Per controllare gli effetti involontari di CNO sul comportamento, infondere ratti con il recettore designer (hM4Di) e iniettare con veicolo al posto del CNO. Per tenere conto di effetti generali di infusione virale e l'espressione del recettore, infondere un virus di controllo che non contiene il recettore designer e amministrare CNO.
Un certo numero di differenti sierotipi di AAV sono usati per fornire materiale genetico. Le attuali linee guida NIH per la ricerca coinvolgimento ricombinante o molecole sintetiche sostiene che AAV (tutti i sierotipi) e costrutti AAV ricombinanti o sintetici, in cui il transgene non codifica sia un prodotto del gene potenzialmente cancerogeno o una molecola di tossina e sono prodotti in assenza di un virus helper, richiedono BSL-1 precauzioni (Gruppo Appendice B-1. rischio 1 (RG1) agenti) 13. Un numero di recensioni relative alla struttura AAV, l'utilità e la sicurezza sono disponibili 14,15. In particolare, anche se, A causa delle preoccupazioni relative a possibili riproduttivi 16,17 e meccanismi potenziali cancerogeni 18-20 nei roditori, alcuni istituti richiedono l'uso di BSL-2 precauzioni quando si lavora con AAV. Verificare il BSL appropriata prima dell'uso attraverso la consultazione con i comitati di sorveglianza a singole istituzioni dove la ricerca sarà condotta, i Centers for Disease Control e le Linee Guida NIH per la ricerca che coinvolge DNA ricombinante Molecole 13 quando si utilizza vettori virali per la manipolazione genetica negli Stati Uniti. Protezione personale, formazione investigatore, vettore di contenimento, di decontaminazione, di smaltimento dei materiali decontaminati, e animali post-iniezione esigenze abitative sono specificati da queste linee guida. Inoltre, consultare e seguire appropriate Animal Care istituzionali e utilizzare le linee guida del comitato o orientamento equivalente di Vigilanza istituzionali per garantire la manipolazione, somministrazione e lo smaltimento di AAV.
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Protocol
L'uso di animali sono approvati dalla Oberlin College Istituzionale Animal Care and Use Committee e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio 21.
1. Preparazione per Infusione virale
Nota: Questo protocollo utilizza BSL-1 precauzioni. Quando si impiegano BSL-2 precauzioni, un camice da laboratorio e getta, guanti, copriscarpe, protezioni oculari e un respiratore per particolati (tipo N95) sono obbligatori. Tutte le persone manipolazione BSL-2 composti devono essere adatti testato per un respiratore per particolati da un'agenzia sanitaria locale. Fare riferimento a Lowery & Majewska (2010) 22 per ulteriori dettagli sulla movimentazione e lo stoccaggio di vettori virali.
- Al primo utilizzo, aliquota e conservare virus inutilizzata in 20 provette da microcentrifuga microlitri per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti.
- Preparare la superficie di lavoro, eliminando tutti gli oggetti inutili e sterilizzare la superficie con il 70% di etanolo. Preparare una 1Soluzione di candeggina 0% per la decontaminazione dei rifiuti AAV. Posizionare un bicchiere pieno di soluzione di candeggina e siringa sterile 10 microlitri sulla superficie di lavoro. Collocare la provetta con la AAV in un contenitore con ghiaccio tritato durante il set up.
- Collocare la provetta con il virus in una morsa da banco standard. Caricare una siringa da 10 microlitri con almeno 4 ml di AAV. Fare attenzione a non piegare la punta della siringa contro il fondo della provetta durante il caricamento. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nei 4 ml di soluzione di AAV nella siringa.
- Smaltire il tubo virus vuoto nel bicchiere contenente il 10% di candeggina. Conservare parti non utilizzate del virus, come specificato dal fornitore.
- Aggiungere ulteriore 10% di candeggina al contenitore dei rifiuti, e lasciare i rifiuti a riposare per 30 minuti prima di smaltire i rifiuti liquidi decontaminato.
- Smaltire tutti i dispositivi di protezione e rifiuti di plastica in un contenitore di rischio biologico, come indicato dalle linee guida istituzionali. Decontaminate qualsiasi apparecchiatura o superfici che è venuto in contatto con il virus utilizzando 10% di candeggina.
2. Chirurgia
- Preparare la zona chirurgica posizionando carta assorbente panchina sotto l'apparato stereotassico e su uno spazio adiacente designato come area di gestione dei virus dedicata.
- Posizionare un contenitore per rifiuti candeggiante 10% nella zona di gestione dei virus dedicata prossimità dell'apparecchiatura chirurgica.
- Indurre un livello costante di anestesia e preparare il ratto per un intervento chirurgico.
- Posizionare il ratto in una camera di induzione che contiene una miscela di gas isoflurano (nell'intervallo da 1 a 3%) e l'ossigeno (100% a circa 1 L / min) fino ad ottenere una perdita di coscienza e la mancanza di movimento intenzionale lordo. Mantenere l'anestesia isoflurano durante tutta la procedura chirurgica.
- Dopo 6 anestesia profonda è raggiunto, radere il ratto di tra gli occhi per un po 'dietro le orecchie.
- Posizionare il topo nuovamente nella camera di induzione per unulteriore 1-3 min.
- Assicurarsi che il sistema di anestesia isoflurano è collegato al naso cono della chirurgia stereotassica. Aprire il rubinetto sul tubo isoflurano per iniziare il flusso di isoflurano al stereotax. Mantenere la isoflurano e ossigeno ai livelli sopra indicati.
- Posizionare il topo in un apparato stereotassico assicurando bocca sulla barra morso e fissare le barre orecchio.
- Applicare occhio del lubrificante per gli occhi e betadine al sito chirurgico prima di incisione.
- Fare un 2,4 centimetri linea mediana incisione della pelle sulla superficie dorsale del cranio di partenza di circa due millimetri caudali per gli occhi. Ritrarre la pelle per esporre il cranio. Periodicamente instillare sterile allo 0,9% soluzione salina sterile ai margini del sito chirurgico per impedire tessuti da essiccazione.
- Tessuto membranoso Cancellare dal cranio fino bregma e lambda sono chiaramente visibili.
- Assicurarsi che il cranio è di livello misurando le coordinate dorso-ventrale abregma e al lambda. Regolare il dispositivo stereotassico di conseguenza fino a coordinate dorso-ventrale a bregma e lambda differiscono di non più di 0,04 mm.
- A questo punto, ridurre il gas isoflurano tra 2 e 2,5%.
- Riportare il trapano per bregma, riazzerare le coordinate e quindi spostare il trapano per la desiderata medio-laterale e antero-posteriore coordinate.
- Praticare un foro nella parte coordinata con una punta 0,9 millimetri in quanto produce un foro adeguato per dimensioni una siringa per infusione 28 G.
- Impostare la pompa di infusione per fornire virus ad una velocità di 0,2 ml / min. Inserire la siringa nel braccio infusione del dispositivo stereotassico e abbassare siringa nel desiderato coordinate. Somministrare la quantità desiderata di virus (gamma 0,1-0,8 ml). Ad esempio, consegnare 0,8 ml di AAV oltre 4 min.
Nota: condurre studi pilota per determinare il volume di infusione ideale e la diffusione tipico del virus in ogni regione di interesse.- Dopo la consegna di virus è complete lasciare la siringa in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso nel tratto ago. Lentamente sollevare la siringa ad una velocità di circa 5 mm / min. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le coordinate sono stati infusi con AAV.
- Chiudere la ferita con punti chirurgici e rivestire la ferita con attualità pomata antibiotica.
- Seguire le linee guida istituzionali per la gestione del dolore post-operatorio.
- Posizionare il ratto in una gabbia con biancheria da letto, un coperchio e segnaletica adeguata e restituire il ratto alla stabulario.
- Se si lavora sotto BSL-2 precauzioni, raccogliere la biancheria per il periodo di tempo (in genere 48-72 ore) specificata da linee guida istituzionali. Mettere biancheria da letto in un contenitore per rifiuti biologici.
- Smaltire tutti i materiali AAV-contaminate, come specificato dalle linee guida per la loro smaltimento sicuro.
3. Apparecchiatura comportamentale
Nota: L'apparato sensoriale precondizionamento consiste di un condizionamento operante cham di serieber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) con un pavimento griglia in acciaio inox, 2 pareti laterali in plexiglass e 2 pareti metalliche.
- Montare una luce 2.8 W su una delle pareti di alluminio per servire come la luce casa e come stimolo visivo quando fé 2 Hz. Montare un altoparlante sulla camera di fornire gli stimoli uditivi (10 sec, 1500 Hz, 78 dB tono puro e un dB di rumore bianco 10 sec 78).
- Utilizzare una tramoggia alimentare di offrire 45 pellet cibo mg nella tazza cibo. All'interno della coppa cibo, fotocellule a raggi infrarossi rilevano il tempo totale trascorso in coppa cibo prima, durante e dopo le presentazioni degli stimoli e ricompense alimentari.
- Casa le camere in armadi di attenuazione del suono (22 "L x 22" x 16 "D) attrezzati con ventilatori (~ 68 dB).
- Utilizzare un computer PC con software Med Associates per il controllo della camera di operante e acquisire i dati. Durante le sessioni di condizionamento, raccogliere i dati sul tempo totale speso con la testa nella tazza cibo durante Presentazione dello stimolo luminoso (5 sec epoca) e durante la presentazione del premio cibo (5 sec epoca). Durante la sessione di test, raccogliere i dati sul tempo totale trascorso in coppa cibo in risposta alla presentazione di stimoli uditivi (10 sec epoca inizio quando gli stimoli uditivi sono terminati).
4. Panoramica del Sensory precondizionamento Paradigm
- Dopo il recupero da un intervento chirurgico, a poco a poco cibo limitare i ratti al 85% del loro peso corporeo alimentazione gratuito. Consultare il personale veterinario per un adeguato paradigma restrizione alimentare.
Nota: Il 3-fase di precondizionamento sensoriale paradigma è illustrato in figura 2. - Precondizionamento Sessions (Fase 1; giornalieri sessioni di formazione 64 min condotto su 4 giorni consecutivi):
- Ratti presenti con 12 studi mescolati che consistono di consegna di stimoli uditivi e visivi. Includere gli intervalli tra le prove che media 4,5 minuti (range 4,0-5,0 min) dopo ogni unpresentazione uditory.
- Il 6 delle prove, presenti un tono (stimolo condizionato) per 10 sec, seguito immediatamente da una presentazione 5 secondi della luce stimoli lampeggiante.
- Sulle altre 6 prove, presenterà il rumore bianco (stimolo spaiato) solo per 10 secondi.
- Sessioni di condizionamento (Fase 2; giornaliera allenamenti 64 min condotti in 5 giorni consecutivi):
- Ratti presenti con 8 prove che consistono di consegna dello stimolo visivo (la luce lampeggiante di stimolo) per 5 sec, immediatamente seguita da consegna di due palline di cibo 45 mg. Includere gli intervalli tra le prove che media 7 minuti (range 6,0-8,0 min) dopo ogni prova. Di tanto in tanto i ratti richiedono più di 5 sessioni di condizionamento per imparare l'associazione cibi leggeri.
- Test di sessione (fase 3, una singola sessione 78 min):
- Presentare i ratti con 12 studi mescolati che consistono di consegna dei soli stimoli uditivi. Includere gli intervalli tra le prove che avecollera 4,5 minuti (range 4,0-5,0 min) dopo ogni presentazione uditiva.
- Il 6 delle prove, presentare lo stimolo tono (lo stimolo condizionato) solo per 10 secondi.
- Sulle altre 6 prove, presenterà il rumore bianco (lo stimolo spaiato) solo per 10 secondi.
- Controbilanciare gli stimoli completando lo studio con un secondo gruppo di ratti che ricevono il rumore bianco come stimolo precondizionato e il tono come stimolo spaiato.
5. farmacologica e comportamentale Procedura
- Accendere all'apparato comportamentale e caricare il codice Med-PC per la sessione del comportamento appropriato. Wire e programmare l'apparato comportamentale tale che i ventilatori che sono montati sul armadi suono attenuando accende quando l'alimentazione è accesa.
- Per preparare una soluzione 1 mg / ml di clozapina N-ossido (CNO), pesare 5,0 mg di CNO in un tubo da 15 ml e aggiungere 5 ml di acqua sterile o 5 ml di sterile 0,9% saline. Vortex fino a quando la soluzione è limpida.
- Se CNO non si dissolve in soluzione o se soluzioni più concentrate di CNO si desidera aggiungere un agente solubilizzante, come DMSO 23. In particolare, per preparare una soluzione di 1 mg / ml di CNO con 0,5% DMSO, peso 5,0 mg di CNO e aggiungere 25 ml di DMSO in una provetta da 15 ml. Flick delicatamente garantendo che il contenuto rimanga alla base del tubo. Quando la soluzione diventa chiara, aggiungere 5 ml di acqua sterile o 5 ml di soluzione sterile salina allo 0,9%. Ulteriori istruzioni per la preparazione di soluzioni di CNO sono disponibili nella pagina di risorsa DREADD wiki 25.
- Preparare una nuova soluzione CNO ogni giorno che viene somministrato.
- Iniettare il CNO via intraperitoneale alla dose di 1 mg / kg a circa 30 minuti prima del test comportamentale. Ad esempio, iniettare un 200 g ratto con 0,2 ml di / soluzione CNO ml 1 mg. Il corso della dose e il tempo di somministrazione CNO sono stati selezionati sulla base delle relazioni precedentemente pubblicati 2,12.
- Iniettare CNO 30 minuti prima di ogni sessione di precondizionamento (fase 1; totale di 4 giorni di iniezioni), ma di amministrare il veicolo prima di tutte le sessioni del comportamento successive.
- Dopo 30 minuti, mettere i topi nelle camere di test comportamentali e avviare il codice di calcolo per la sessione del comportamento appropriato.
- Al completamento del compito comportamentale, rimuovere immediatamente i ratti dalle camere e restituire i ratti alla colonia animale.
6. Analisi dei dati comportamentali
Nota: La variabile dipendente per tutte le sessioni comportamentali è la quantità di tempo che la testa del ratto è all'interno della tazza dell'alimento rilevate tramite l'interruzione delle fotocellule infrarossi nella tazza dell'alimento. I dati (in secondi) sono raccolti e registrati dal software del computer.
- Non eseguire le analisi sui dati generati durante la fase di precondizionamento.
- Per le sessioni di condizionamento: analizzare un reciproche rattibilità per imparare l'associazione cibi leggeri confrontando comportamento tazza cibo durante la presentazione dello stimolo visivo attraverso le 5 sedute comportamentali. In particolare, il calcolo del tempo medio trascorso in coppa cibo durante la luce all'epoca 5 sec per ciascuna delle 8 prove / sessione (cioè una media di 8 studi clinici che sono ogni 5 secondi di durata / rat). Confronta Controllo media e valori sperimentali per ognuna delle 5 sessioni giornaliere (vedi Figura 3A).
- Analizzare la motivazione dei ratti per procurarsi il cibo ricompensa confrontando comportamento tazza di cibo durante la consegna del premio cibo (5 sec epoca) attraverso le 5 sedute comportamentali che utilizzano lo stesso calcolo, come specificato per la luce all'epoca 5 secondi sopra. Questi valori saranno più elevati di quelli acquisiti durante la presentazione dello stimolo visivo (vedere Figura 3B).
- Per la sessione di test: calcola un rapporto di discriminazione che descrive il comportamento coppa cibo dei ratti in risposta alle presentations di ogni stimolo uditivo.
- In particolare, per ogni ratto, dividere il tempo medio di permanenza nella tazza cibo dopo ciascuna di 6 presentazioni dello stimolo sensoriale precondizionato (cioè, il tono) per la somma del tempo medio di permanenza nella tazza cibo dopo ciascuna di 6 presentazioni della sensoriali stimolo precondizionato (cioè, lo stimolo tono) più la media del tempo totale trascorso nella tazza dell'alimento segue ciascuna di 6 presentazioni dello stimolo spaiato (cioè, lo stimolo rumore bianco). Ogni epoca è di 10 secondi di durata.
Nota: Un punteggio discriminazione di 0,5 o superiore dimostra che i topi hanno imparato le associazioni insite nel paradigma precondizionamento sensoriale.
- In particolare, per ogni ratto, dividere il tempo medio di permanenza nella tazza cibo dopo ciascuna di 6 presentazioni dello stimolo sensoriale precondizionato (cioè, il tono) per la somma del tempo medio di permanenza nella tazza cibo dopo ciascuna di 6 presentazioni della sensoriali stimolo precondizionato (cioè, lo stimolo tono) più la media del tempo totale trascorso nella tazza dell'alimento segue ciascuna di 6 presentazioni dello stimolo spaiato (cioè, lo stimolo rumore bianco). Ogni epoca è di 10 secondi di durata.
7. Verifica di AAV posizionamento e di espressione
- Anestetizzare e profumato ratti transcardiaca con paraformaldeide al 4%. Grazie all'uso di etichette fluorescenti, non superare un tempo di post-fissazione 2 hr a minperdita sarà ottimizzata di antigenicità e per preservare il segnale fluorescente.
- Disidratare cervelli perfusi trasferendoli in un vaso cerebrale contenente 30 ml di una soluzione di saccarosio al 20% in tampone fosfato isotonico (1x) per un minimo di 2 giorni o fino al cervello scende sul fondo del vaso cerebrale.
- Utilizzare un microtomo scorrevole congelamento fare sezioni di cervello coronale (20-40 micron) durante l'intera estensione rostrocaudale della regione di interesse.
- Effettuare immunoistochimica diretto contro il recettore etichettato o la proteina reporter per accertare la posizione e l'espressione del recettore progettista e / o giornalista 12. Un protocollo di colorazione immunoistochimica sono presenti sulla pagina di risorsa DREADD wiki 25.
- Montare sezioni su vetrini SuperFrost-plus e coprioggetto utilizzando 100-200 ml di un mezzo di montaggio acquoso.
- Eseguire microscopia a fluorescenza su tessuto cerebrale per verificare il posizionamento AAV e proteine espressione 12,24.
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Representative Results
Risultati comportamentali
Al termine dell'esperimento, l'efficacia della inattivazione temporanea regione specifica deve essere valutata quantitativamente e qualitativamente. Il presente esempio riguarda un paradigma 3 fasi comportamentale (precondizionamento sensoriale), in cui è stato somministrato CNO attenuare attività neurale nel RSC durante le sessioni di precondizionamento per verificare l'ipotesi che la RSC è necessario per la formazione di associazioni tra stimoli neutro 12. È importante sottolineare che, sperimentatori non sono limitati al paradigma comportamentale o disegno sperimentale descritto come approccio farmacogenetica può essere accoppiato con la maggior parte paradigmi comportamentali.
Considerando che le analisi non sono in genere eseguite su dati generati durante le sessioni di precondizionamento (Fase 1), è importante quantificare sia i ratti hanno appreso la luce associazione cibo durante le sessioni di condizionamento (fase 2). Come mostrato in Fifigura 3A, sia sperimentali (Esperimento) e di controllo (Ctrl) ratti dimostrano crescente comportamento tazza cibo durante le presentazioni dello stimolo luminoso (figura 3A) che indicano che i ratti acquisito un'associazione pavloviano tra lo stimolo visivo (luce) e la ricompensa cibo. Inoltre, entrambi i gruppi dimostrano crescente comportamento tazza di cibo durante la presentazione del premio cibo (Figura 3B) indicando la motivazione equivalente per ottenere ricompensa. Durante la sessione di prova critica, quando gli stimoli uditivi sono presentati in assenza di altri stimoli, ratti di controllo hanno un punteggio discriminazione che è significativamente diversa da ratti sperimentali (Figura 3C). Controllo visivo del grafico rivela che il rapporto medio discriminazione di ratti di controllo è superiore a 0,5, indicativa di una maggiore comportamento tazza di cibo in risposta alle presentazioni dello stimolo uditivo che è stato accoppiato con la luce (durante Precondizionamento) rispetto a loro tazza di cibocomportamento in risposta alle presentazioni dello stimolo uditivo che è stato spaiato (durante Precondizionamento). Al contrario, i topi sperimentali non riescono a dimostrare un punteggio differenza che è al di sopra caso. Così, Figura 3C dimostra che il controllo, ma non i topi sperimentali hanno dimostrato l'effetto precondizionamento sensoriale.
La verifica di AAV Placement
Al completamento della prova comportamentale, analizzare ratto tessuto cerebrale per un corretto posizionamento e l'espressione del recettore designer. Condotta immunoistochimica 12,25 utilizzando anticorpi primari diretti contro un tag recettore (ad esempio, un anticorpo primario anti-HA) o il reporter fluorescente (in questo esempio, mcitrine che viene rilevato da un anticorpo Green Fluorescent Protein (GFP)). Uno schema di una sezione coronale attraverso il cervello di ratto è mostrato in Figura 4A. Figura 4B illustra immunolocalizzazione fluorescente robusta della prot giornalista. Ein nella RSC in un ratto rappresentante sperimentale senza etichetta fluorescente rilevata nelle regioni circostanti figure 4C - D illustrano marcatura fluorescente rappresentante di proteine reporter a sperimentale (Expt; ratti sono stati infusi con un costrutto AAV contenente il gene del recettore progettista e il gene mcitrine ) e controllo (Ctrl; ratti sono stati iniettati con un costrutto AAV analogo contenente il gene GFP ma nessuna sequenza per il recettore designer) ratti rispettivamente. Livelli di recettore può anche essere visualizzate come minimo, rappresentante e l'espressione massima 24. Se l'etichettatura è rilevato nelle regioni al di fuori della zona di interesse, escludere tali dati dalle analisi comportamentali.
Figura 1:. Schema del costrutto AAV Un diagramma del hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV usato per expPremete il recettore progettista inibitorio (hM4Di) sotto un neuronale specifica promotore sinapsina (hSyn) nei neuroni RSC. Reporter immunofluorescenza (HA-tag e / o mcitrine) possono essere utilizzati per visualizzare espressione della proteina e giornalista, rispettivamente. hSyn, promotore sinapsina umana; specifica espressione nei neuroni. HA, etichetta hemagluttinin; questo tag è fusa al recettore progettista e serve come un epitopo abilitare l'individuazione di espressione del recettore. hM4Di, il gene per il recettore accoppiato inibitorio Designer G-proteine. IRES, voce sito ribosoma interno; permette al giornalista (mcitrine) da tradurre. mcitrine, un reporter fluorescente che è una variante di GFP ma è più resistente alla photobleaching.
Figura 2: Schema del paradigma precondizionamento sensoriale (A) Durante il precondizionamento sess.ioni, 12 studi mescolati sono presentati. Durante 6 delle prove, uno stimolo uditivo è presentato per 10 secondi seguita immediatamente da una casa di luce lampeggiante stimolo (2 Hz, per 5 sec). Durante le altre 6 prove, un secondo stimolo uditivo è presentato senza uno stimolo visivo. (B) Nel corso delle sessioni di condizionamento, lo stimolo visivo precedentemente associato è accoppiato con il cibo ricompensa. (C) Nel corso della sessione di test, ci sono 12 presentazioni mescolati dei due stimoli uditivi in assenza di stimoli visivi o cibo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. I risultati comportamentali tazza cibo nella media di rispondere durante la (A) e della luce (B) epoche alimentari dusuonare le sessioni di condizionamento (fase 2). I dati sono stati analizzati utilizzando misure ripetute analisi della varianza. rapporti (C) discriminazione durante la sessione di prova (fase 3). La linea tratteggiata indica la stessa quantità di cibo condizionata tazza rispondono ad ogni stimolo uditivo (vale a dire, senza precondizionamento sensoriale) I dati sono stati analizzati utilizzando campioni indipendenti t-test. Expt; ratti sperimentali (n = 17) infusi con un costrutto AAV contenente la sequenza di DNA per il G-proteina inibitrice del recettore accoppiato progettista (hM4Di) e la sequenza del DNA per un reporter fluorescente (mcitrine). Ctrl; ratti di controllo (n = 6) infuso con hM4Di e veicolo somministrato combinato con ratti di controllo (n = 4) infuso con un virus AAV che non contiene il recettore progettista e che sono stati somministrati CNO. I gruppi di controllo non differivano significativamente tra loro (p> 0.05). Le barre di errore indicano ± SEM.
Figura 4: verifica istologica di espressione proteica (A) A schematica illustrante la posizione del RSC in una sezione coronale attraverso il cervello di ratto.. (B) Immagini rappresentative di tessuto cerebrale di ratto immunoistochimica etichettato da un topo sperimentale (Esperimento) che è stato infuso con un costrutto AAV contenente la sequenza di DNA per il G-proteina inibitrice del recettore accoppiato progettista (hM4Di) e la sequenza del DNA per un reporter fluorescente ( mcitrine). mcitrine è una variante altamente resistenti allo sbiadimento di proteina verde fluorescente. (C) l'immagine rappresentativa da un ratto sperimentale che illustra la posizione dell'etichetta reporter fluorescente (mcitrine). (D) Immagine rappresentativa da un ratto di controllo (Ctrl) infuso con un costrutto AAV contenente la sequenza di DNA di un reporter fluorescente (GFP potenziato). Bar Scala: B, 500 micron; C e D, 10081;. M Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive come applicare un approccio farmacogenetica (DREADD) per studiare come una regione del cervello specifica contribuisce ad un più fasi compito di apprendimento complesso. Con la possibilità di disattivare temporaneamente e in remoto attività neurale in regioni cerebrali distinte attraverso fasi di apprendimento, questa combinazione di approcci fornisce una piattaforma per indagare su una vasta gamma di comportamenti, tra cui forme più sfumate o mascherate di apprendimento. Nell'esempio descritto in questo protocollo, controllare ratti e topi che esprimono il recettore progettista nella corteccia retrosplenial (RSC) sono stati testati in un compito comportamentale 3 fasi 12. La prima fase del compito coinvolto presentazione di stimoli multipli neutri con il presupposto che controllano ratti acquisterebbe un'associazione stimolo-stimolo tra due degli stimoli. L'ipotesi di lavoro è che RSC è necessaria per l'apprendimento stimolo-stimolo, dunque, su ciascuno dei 4 giorni di condizionamento, 30 min prima dell'inizio della prova comportamentalevoce, controllo e ratti sperimentali sono stati dati somministrazione sistemica di una droga designer (CNO) o di un veicolo. Quando è legato al recettore progettista, CNO riduce l'attività di neuroni in cui tale recettore è espresso. Durante le restanti fasi di condizionamento e test comportamentali, quando il RSC, non è ipotizzato di influenzare l'apprendimento, CNO non è stato somministrato e, quindi, l'attività neurale non è stato disturbato.
Fasi critiche all'interno del protocollo
Utilizzo sicuro dei composti AAV: Le procedure chirurgiche coinvolte nell'approccio farmacogenetica non sono tecnicamente più esigente di una semplice infusione stereotassico, tuttavia, l'uso di AAV in alcuni istituti richiede che sperimentatori aderire alla BSL-2 precauzioni. E 'fondamentale che gli investigatori seguono le linee guida stabilite dai Centers for Disease Control, agenzie di finanziamento, istituzioni per la casa e altri comitati di sorveglianza specifiche per il loro programma di ricerca. Informazioni sul the la sicurezza d'impiego di AAV è prontamente disponibile 13.
Preparazione e somministrazione del farmaco Designer: CNO, il farmaco progettista, si lega al recettore progettista e silenzi attività neurale, ma è altrimenti biologicamente inerte 1,3. Le spedizioni di CNO da fornitori possono variare in consistenza. Il composto dovrebbe arrivare come una polvere che non aderisce ai lati del contenitore.
Gruppi di controllo importanti da considerare: Per controllare gli effetti non specifici del farmaco progettista, prima del test comportamentale, infondono un diverso insieme di ratti sperimentali (cioè, quelli che esprimono il recettore designer) con iniezioni di veicoli invece di CNO. Inoltre, per controllare gli effetti non specifici del recettore progettista comprendono un gruppo di ratti che hanno respirato un virus controllo che contiene un reporter fluorescente, ma non il recettore progettista modificato e iniettare questi ratti con il farmaco designer (cioè, CNO) . Ensuri adeguato disegno sperimentale controbilanciando tra i gruppi.
Verifica espressione del costrutto: Ci sono un certo numero di modi per massimizzare l'espressione e il rilevamento del recettore progettista. Prima dell'infusione, verificare che il titolo virale è vicina 10 12 particelle / ml. Spesso visualizzazione del reporter fluorescente è bassa e, quindi, si raccomanda di immunoistochimica eseguita sulla regione di interesse utilizzando anticorpi diretti contro il reporter (s) incluso nel costrutto virale 25. In questo esempio, immunoreattività anti-GFP fornisce un segnale più forte (Figure 4B - D). È importante sottolineare che, a causa della natura di etichette fluorescenti, limitare la lunghezza del tempo di fissazione per 2 hr.
Vantaggi delle tecniche
Una volta che il costrutto virale è stato consegnato al cervello attraverso la chirurgia stereotassica, l'approccio di farmacogenetica consente l'inattivazione temporaneazione di attività cerebrale in regioni discrete mediante una iniezione sistemica minimamente invasiva del farmaco designer. Drug Administration può verificarsi più volte, che è vantaggioso per le attività comportamentali che si verificano in tutta giorni consecutivi o settimane 12,24,26. Inoltre, prove indicano che il farmaco designer (CNO) non interferisce con il comportamento locomotorio o appetito 27,28. Così, il metodo prevede la possibilità di attenuare attività neurale per un breve periodo di tempo (2-5 ore), evitando gli stress inerenti altri metodi di inattivazione temporanea. In particolare, negli studi incannulamento, inattivazione temporanea si ottiene con la consegna di neurotossine attraverso cannule che vengono apposti in modo permanente al cranio. Questo approccio è limitato in quanto mantenere la cannula prive di detriti e protetta è impegnativo. Inoltre, per indurre l'inattività, gli animali sono trattati ampiamente (per amministrare la tossina attraverso le cannule) appena prima del test comportamentali, WHIch impone stress sul animale e aumenta anche la probabilità che cannule può staccare dal cranio. Poiché gli effetti della CNO sono relativamente a breve termine, la possibilità di meccanismi di compensazione a lungo termine (ad esempio quelli osservati a seguito di lesioni permanenti o in topi geneticamente modificati) sono ridotti al minimo 29,30.
Limitazioni Tecniche
DREADD è un metodo relativamente nuovo di non invasivo attenuazione attività neuronale. Poiché tali sperimentatori possono essere inclini a verificare in modo indipendente che silenziamento neuronale si verifica nella loro preparazione. La verifica può essere eseguita utilizzando approcci elettrofisiologici, ma questi esperimenti sono richiede tempo, costoso e richiede competenze specifiche. Inoltre, mentre le tecniche chemogenetic sono meno costose di optogenetics, l'approccio è più costoso di inattivazione tradizionale con agenti farmacologici come TTX. Un altro limite dell'approccio DREADD è che infusione dei costrutti virali non comporta 100% infezione dei neuroni nella regione di interesse, né inattivazione tramite CNO portano alla riduzione del 100% dell'attività neuronale. Infine, alcuni sierotipi AAV possono essere trasportati retrograda che possono complicare l'interpretazione dei risultati sperimentali 2.
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Acknowledgments
Ringraziamo di Robinson et al. 12 gli autori per il loro contributo il manoscritto da cui questo protocollo è parzialmente derivato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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