Abstract
Denne protokollen beskriver hvordan du midlertidig og tele taushet neuronal aktivitet i diskrete områder av hjernen mens dyrene er engasjert i læring og hukommelse oppgaver. Tilnærmingen kombinerer Farmakogenetikk (Designer-reseptor-Eksklusivt-Aktivert-by-Designer-Drugs) med en atferds paradigmet (sensorisk preconditioning) som er utviklet for å skille mellom ulike former for læring. Spesifikt blir viral-mediert levering brukt for å uttrykke en genetisk modifisert inhiberende G-proteinkoblet reseptor (designeren Receptor) inn i en diskret hjerneregionen i gnagere. Tre uker senere, da designer reseptor uttrykk nivåer er høy, er en farmakologisk agent (Designer Drug) administreres systemisk 30 min før en bestemt atferds økt. Stoffet har affinitet for designeren reseptoren og dermed resulterer i hemming av nevroner som uttrykker designer reseptoren, men er ellers biologisk inert. Hjernen regionen forblir stille på tribunen i 2-5 timer (DEPENding av dose og administrasjonsveien). Ved ferdigstillelse av atferds paradigme, er hjernevev vurderes for riktig plassering og reseptor uttrykk. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig for å bestemme bidraget av de enkelte områder av hjernen til bestemte komponenter i oppførsel og kan brukes på tvers av hvilket som helst antall av atferds paradigmer.
Introduction
En spennende utfordring innen biologisk psykologi er å bestemme nevrale substrater av komplekse atferd. En rekke teknikker som permanente skader, midlertidig hjernen inaktivering via kanyler implantater og optogenetics har blitt ansatt for å identifisere innsatsen til diskrete områder av hjernen til subkomponenter av komplekse atferd. Mens disse tilnærmingene informere vår forståelse av regional spesifisitet under læring, er hver teknikk ikke uten begrensninger. Spesielt er permanente skader typisk utført før adferdstesting, og dermed deres virkninger er til stede under hele paradigmet. Kanylering studier som involverer fremstilling av en kortvarig neural inaktivator (for eksempel tetrodotoksin) kan gi betydelig skade på vev i hjernen og kan forårsake stress hos personer like før adferdstesting. Videre er inaktivering ved kanylering begrenset til det område av vev som omgirspissen av kanyler. Til slutt, mens optogenetics tilbyr et utvalg av fleksibilitet for den tidsmessige kontroll av aktivitet i bestemte områder av hjernen, er det kostnadene prohibitive og teknisk krevende.
Disse begrensningene kan overvinnes ved hjelp av en farmakogenetiske tilnærming (Designer-reseptor-Eksklusivt-Aktivert-by-Designer-Drugs, DREADDs) 1,2. Viktigere, mens begrepet Pharmacogenetics er sofistikert, er utførelsen av teknikken ukomplisert. I likhet med tradisjonelle stereotaksiske kirurgiske metoder som involverer tilførsel av toksin (for eksempel, NMDA, ibotensyre) i diskrete hjerneområder, innebærer denne teknikk å tilføre et adeno-assosiert virus (AAV) som inneholder et DNA-fragment for en modifisert inhiberende G-proteinkoblet reseptor (hM4Di; konstruktøren reseptor) inn i området av interesse av standard laboratorie gnagere (se figur 1). Den virale vektoren inneholder også et fluorescerende reporter (mcitrine). Når innlemmet itil celler, er den designer reseptor (og reporter protein) maksimalt uttrykt ~ 3 uker post-infusjon og kan aktiveres selektivt i 2-5 timer ved systemisk administrering av den ellers biologisk inert designer medikament, Clozapine-N-oksyd (CNO) 1 3. Fordi eksperimentator er utstyrt med presis, men fjerntemporal kontroll over nevrale aktiviteten i bestemte områder av hjernen, og kombinerer Farmakogenetikk spesielt godt med atferds paradigmer som er gjennomført i flere faser. I dette eksemplet til bidraget fra den retrosplenial cortex (RSC) stimulus-stimulus læring i forhold til sin rolle i Pavlovian læring, men denne kombinasjonen av metodene er godt egnet til en rekke spørsmål som søker å identifisere hvordan spesifikke områder av hjernen bidra til kompleks oppførsel.
I tillegg, selv om det ikke er beskrevet i den foreliggende protokoll, virale og transgene metoder kan brukes for å oppnå celletype-spesifikk ekspresjon DREADD 2. Som jegs iboende i adferds paradigmer som omfatter farmakologiske og / eller andre typer eksperimentelle manipulasjoner, en nøye vurdering av eksperimentell design og påfølgende kvantitativ analyse er nødvendig når man anvender den DREADD tilnærming. Experimenters nye til DREADD tilnærming blir henvist til en omfattende gjennomgang av dagens DREADD teknologi 2.
Hver dag, organismer lære om nye stimuli og hendelser og deres forhold til hverandre. Selv i et kjent miljø, for eksempel hjemme, er en rask til å oppdage endringer i relasjonene mellom stimuli fordi disse endringene kan være prediktiv for meningsfulle hendelser. Slik stimulus-stimulus (dvs. relasjons) innebærer læring på conjoining av flere stimuli og har tradisjonelt vært forbundet med hippocampus, som ligger sentralt i den mediale tinninglappen fire. Imidlertid ikke hippocampus eksisterer heller ikke opptre isolert; kortikale regioner både innenfor og utenforside av den mediale tinninglappen tilveiebringe kritisk sensorisk informasjon til hippokampalformasjonen 5-7. Tradisjonelle permanente lesjon studier gir overbevisende bevis for involvering av en rekke kortikale regioner (f.eks retrosplenial, postrhinal og entorhinal cortex) i hippocampus-avhengig læring, men er begrenset i sin evne til å skjelne rollen som en bestemt region under diskrete faser av læring 8-10.
Protokoll tester hypotesen om at RSC er nødvendig for stimulus-stimulus læring ved å stanse RSC løpet av en enkelt fase av en 3-fase sensorisk preconditioning paradigme 11,12. Kort beskrevet, mottar rottene infusjoner av en AAV som inneholder designer reseptoren og ~ 3 uker senere administreres medikament til designeren (CNO) 30 min før starten av adferdstesting. I den foreliggende protokoll, eksperimentelle rotter motta CNO løpet av den første fasen av testing (når stimulus-stimulus learning forekommer), og de får bilen i løpet av de neste to fasene av testing. For å kontrollere for utilsiktede effekter av CNO på atferd, sette mot rotter med designer reseptor (hM4Di) og injisere med bilen i stedet for CNO. Å gjøre rede for generelle effekter av viral infusjon og reseptor uttrykk, sette mot en kontroll virus som ikke inneholder designer reseptoren og administrere CNO.
Et antall forskjellige serotyper av AAV brukes til å levere genetisk materiale. De nåværende NIH retningslinjer for forskning som omfatter rekombinant eller syntetiske molekyler holder at AAV (alle serotyper) og rekombinante eller syntetiske AAV konstruksjoner, der transgenet ikke koder enten en potensielt tumorigent genprodukt eller en toksinmolekylet og er produsert i fravær av en helper virus, krever BSL-en forholdsreglene (vedlegg B-1. Risk Group 1 (RG1) Agenter) 13. Et antall anmeldelser knyttet til AAV struktur, nytte og sikkerhet er tilgjengelig 14,15. Spesielt, men, På grunn av bekymringer knyttet til mulige reproduktive 16,17 og potensielle kreftfremkallende mekanismer 18-20 hos gnagere, enkelte institusjoner krever bruk av BSL-2 forholdsregler når du arbeider med AAV. Kontroller riktig BSL før bruk av konsulenttjenester med tilsynsutvalgene i enkeltinstitusjoner der forskningen vil bli gjennomført, Centers for Disease Control og NIH retningslinjer for forskning som involverer rekombinant DNA Molekyler 13 ved bruk av virale vektorer for genmanipulering i USA. Personlig verneutstyr, etterforsker trening, vektor containment, dekontaminering, disponering av dekontaminert materialer, og etter injeksjon dyreboligbehov er spesifisert av disse retningslinjene. I tillegg konsultere og følg passende Institutional Animal Care og retningslinjer for bruk av komité eller tilsvarende institusjonelle retningslinjer forglemmelse komité for å sikre trygg håndtering, forvaltning og disponering av AAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av dyr er godkjent av Oberlin College Institutional Animal Care og Bruk komiteen og er i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr 21.
1. Forberedelse til Viral Infusion
Merk: Denne protokollen bruker BSL-en forholdsregler. Ved ansettelse av BSL-2 forholdsregler, en engangs labfrakk, hansker, skoovertrekk, øye beskyttelse og et partikkelfilter (type N95) er påkrevd. Alle personer som håndterer BSL-2 forbindelser må passe testet for en støvmaske av en lokal folkehelsen byrå. Referere til Lowery & Majewska (2010) 22 for ytterligere informasjon om håndtering og lagring av virale vektorer.
- Ved første gangs bruk, delmengde og oppbevares viruset i 20 mL Mikrosentrifugerør å unngå gjentatt frysing og tining.
- Forbered arbeidsflaten ved å fjerne alle unødvendige gjenstander og sterilisering overflaten med 70% etanol. Forbered en 10% blekemiddel for dekontaminering AAV avfall. Plasser et beger fullt av blekemiddel og en steril 10 mL sprøyte på arbeidsflaten. Plasser mikrosentrifugerør med AAV i en beholder med knust is under satt opp.
- Plasser mikrosentrifugerør med viruset inn i en vanlig benk vice. Laste en 10 mL sprøyte med minst 4 mL av AAV. Pass på å ikke bøye tuppen av sprøyten mot bunnen av mikrorøret under lasting. Pass på at det ikke er luftbobler i 4 mL av AAV oppløsningen i sprøyten.
- Kast den tomme viruset rør i begeret inneholder 10% blekemiddel. Oppbevar ubrukte deler av viruset som angitt av leverandør.
- Legg ytterligere 10% blekemiddel til avfallsbeholderen, og la avfall til å sitte i 30 minutter før du kaster den dekontaminerte flytende avfall.
- Kast alt verneutstyr og plastavfall i en biohazard container som instruert av institusjonelle retningslinjer. Decontaminate noe utstyr eller overflater som kom i kontakt med viruset bruker 10% blekemiddel.
2. kirurgi
- Forbered kirurgiske området ved å plassere absorberende benkepapir under stereotaxic apparater og på et tilstøtende rom utpekt som en dedikert virus håndtering området.
- Plasser en 10% blekemiddel avfallsbeholder i den dedikerte virus håndtering område nær kirurgisk apparat.
- Indusere et jevnt nivå av anestesi og forberede rotte for kirurgi.
- Plasser rotte i en induksjons kammer som inneholder en blanding av gass isofluran (området 1 til 3%) og oksygen (100% ved omtrent 1 l / min) inntil det er et tap av bevissthet og mangel på brutto målrettet bevegelse. Oppretthold isoflurananestesi gjennom den kirurgiske prosedyren.
- Etter seks dyp anestesi er oppnådd, barbere rotte fra mellom øynene til litt bak ørene.
- Plasser rotte tilbake inn i induksjonskammeret for enytterligere 1-3 min.
- Kontroller at isoflurananestesi systemet er koblet til nesen membran av stereotaxic kirurgi. Åpne stengeventilen på den isofluran slangen til å begynne strømmen av isofluran til stereotax. Opprettholde isofluran og oksygen på nivåer som er angitt ovenfor.
- Plasser rotte i en stereotaxic apparat ved å sikre munnen på bite bar og sikring øret barer.
- Påfør øye smøremiddel til øynene og betadine til det kirurgiske området før snittet.
- Gjør en 2,4 cm midtlinjen snitt i huden på dorsalflaten av skallen starter ca 2 mm caudal for øynene. Trekk huden for å avsløre skallen. Periodisk innpode steril 0,9% sterilt saltvann i utkanten av det kirurgiske området for å hindre at vev fra tørking.
- Clear membranøs vev fra hodeskallen til bregma og lambda er klart synlig.
- Sørg for at hodeskallen er nivået ved å måle rygg-ventral koordinater påbregma og lambda. Juster stereotaxic enhet tilsvar inntil rygg-ventral koordinater på bregma og lambda avviker med mer enn 0,04 mm.
- På denne tiden, redusere isofluran gass til mellom 2 og 2,5%.
- Returner drill til bregma, rezero koordinatene og deretter flytte bore til ønsket medial-lateral og anterior-posterior koordinere.
- Bor et hull i koordinatsystemet ved hjelp av en 0,9 mm bor som den produserer en passende størrelse hull for en 28 G infusjon sprøyte.
- Sett infusjonspumpen for å levere virus ved en hastighet på 0,2 ul / min. Plasser sprøyten inn i infusjon arm av stereotaktisk anordning og senke sprøyten inn i ønsket koordinatsystem. Levere den ønskede mengden av virus (i området 0,1 til 0,8 ul). For eksempel leverer 0,8 mL av AAV enn 4 min.
Merk: gjennomføre pilotstudier for å finne den ideelle infusjonsvolumet og den typiske spredningen av viruset i hver region av interesse.- Etter levering av viruset er complete forlater sprøyten i stedet for 10 minutter for å hindre tilbakestrømning inn i nålen kanalen. Sakte heve sprøyten med en hastighet på ca. 5 mm / min. Gjenta til alle koordinatene er fylt med AAV.
- Lukke såret med kirurgiske stifter og frakk såret med aktuelle antibiotika salve.
- Følg institusjonelle retningslinjer for postoperativ smertebehandling.
- Plasser rotte i et bur med sengetøy, lokk og riktig skilting og returnere rotte til dyret anlegget.
- Hvis arbeider under BSL-2 forholdsregler, samle sengetøy for tiden (vanligvis 48-72 timer) spesifisert av institusjonelle retningslinjer. Plasser sengetøy i en smittefarlig avfall.
- Kast alle AAV-forurenset materiale som er spesifisert av retningslinjer for trygt disposisjon.
3. Behavioral Apparatus
Merk: Den sensoriske preconditioning apparat består av en standard operant betinging chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) med en rustfritt stål grid etasje, 2 Plexiglass sidevegger og to metallvegger.
- Montere en 2,8 W lys på en av aluminium vegger for å tjene som huset lys og som det visuelle stimulus når blinket på 2 Hz. Montere en høyttaler på kammeret for å levere de auditive stimuli (10 sek, 1500 Hz, 78 dB ren tone og en 10 sek 78 dB hvit støy).
- Bruk en food hopper til å levere 45 mg mat pellets inn i maten cup. Innenfor mat cup, infrarød fotoceller oppdage den totale tiden brukt i maten cup før, under og etter presentasjoner av stimuli og mat belønninger.
- Huset kamrene i lyd-demping skap (22 "W x 22" H x 16 "D) utstyrt med avtrekksvifter (~ 68 dB).
- Bruk en PC med Med Associates programvare for å kontrollere operant kammer og skaffe dataene. Under Badekar økter, samle inn data på den totale tiden brukt med hodet i maten cup under presentasjon av lyset stimulus (5 sek epoken) og under presentasjonen av maten belønning (5 sek epoke). Under testen økten, samle data om den totale tiden brukt i maten cup i respons til presentasjoner av auditive stimuli (10 sek epoken begynnelsen når de auditive stimuli er avsluttet).
4. Oversikt over Sensory preconditioning Paradigm
- Etter utvinning fra kirurgi, gradvis mat begrense rottene til 85% av sin mating kroppsvekt. Konsultere veterinær ansatte for en passende mat begrensning paradigme.
Merk: 3-fase sensorisk prekondisjonering paradigme er illustrert i figur 2. - Preconditioning Sessions (Fase 1; Daglig 64 min treningsøkter gjennomført over fire påfølgende dager):
- Presentere rotter med 12 blandede prøvelser som består av levering av auditive og visuelle stimuli. Inkluder inter-rettssaken mellomrom at gjennomsnittlig 4,5 min (range 4,0 til 5,0 min) etter hvert enuditory presentasjon.
- På seks av studiene, presentere en tone (forbehandlet stimulans) for 10 sek, umiddelbart etterfulgt av en 5 sek presentasjon av blinkende lys stimulans.
- På de andre seks studier presentere hvit støy (uparet stimulus) alene i 10 sek.
- Condition økter (fase 2; Daily 64 min treningsøkter gjennomført over 5 sammenhengende dager):
- Presentere rotter med åtte studier som består av levering av det visuelle stimulus (det blinkende lyset stimulus) i 5 sek fulgte umiddelbart etter levering av to 45 mg mat pellets. Inkluder inter-rettssaken mellomrom at gjennomsnittlig 7 min (range 6,0 til 8,0 min) etter hvert forsøk. Av og rotter krever mer enn fem condition økter for å lære den lett mat foreningen.
- Test Session (fase 3, en enkelt 78 min økt):
- Presentere rottene med 12 blandede prøvelser som består av levering av auditive stimuli alene. Inkluder inter-rettssaken intervaller som averaseri 4,5 min (range 4,0 til 5,0 min) etter hver auditiv presentasjon.
- På seks av studiene, presentere tone stimulus (den preconditioned stimulus) alene i 10 sek.
- På de andre seks forsøk, frem hvit støy (det uparede stimulus) alene i 10 sek.
- Motvekt stimuli ved å fullføre studien med et andre sett av rotter som mottar den hvite støyen som forbehandlet stimulus og tone som det uparede stimulus.
5. Farmakologisk og Behavioral Prosedyre
- Slå på strømmen til atferds apparater og laste Med-PC-kode for den aktuelle atferds økten. Wire og program atferds apparat slik at viftene som er montert på de lyddempende skap slå på når strømmen slås på.
- For å fremstille en 1 mg / ml oppløsning av Clozapine N-oksyd (CNO), veier 5,0 mg CNO inn i et 15 ml konisk rør og tilsett 5 ml av sterilt vann eller 5 ml sterilt 0,9% saline. Vortex inntil løsningen er klar.
- Dersom CNO ikke oppløses i oppløsningen eller hvis mer konsentrerte oppløsninger av CNO er ønsket legge et oppløsningsmiddel, så som DMSO 23. Nærmere bestemt, for å fremstille en 1 mg / ml oppløsning av CNO med 0,5% DMSO, veie 5,0 mg CNO og tilsett 25 ul DMSO til et 15 ml konisk rør. Flick forsiktig slik at innholdet holder seg på bunnen av røret. Når løsningen blir klar, tilsett 5 ml sterilt vann eller 5 ml sterilt 0,9% saltvann. Nærmere instruksjoner for å forberede løsninger av CNO er tilgjengelige på DREADD wiki ressurs side 25.
- Utarbeide en ny CNO løsning hver dag at det er administrert.
- Injiser CNO intraperitonealt i en dose på 1 mg / kg omtrent 30 min før adferdstesting. For eksempel, injiserer en 200 g rotte med 0,2 ml av 1 mg / ml oppløsning CNO. Dosen og tidsforløpet for CNO administrasjon ble valgt basert på tidligere publiserte rapporter 2,12.
- Injisere CNO 30 min før hver prekondisjonering session (fase 1, totalt 4 dager med injeksjoner), men administrere kjøretøyet før alle påfølgende atferds økter.
- Etter 30 minutter, plasseres rottene i de atferdsmessige testkamre og starte programkode for den aktuelle atferds økt.
- Ved fullføring av atferds oppgaven, umiddelbart fjerne rottene fra kamrene og returnere rottene til dyret kolonien.
6. Analyser av adferdsdata
Merk: Den avhengige variabelen for alle atferds økter er hvor lang tid at rotta hode er inne maten cup som oppdages ved avbrudd av de infrarøde fotoceller i maten cup. Dataene (i sekunder) er samlet og registrert av datamaskinprogramvare.
- Ikke foreta analyser på data generert under prekondisjonering fasen.
- For de condition økter: analysere hver rotter 'enheten å lære lett mat foreningen ved å sammenligne mat cup atferd under presentasjonen av den visuelle stimulus over fem atferdsmessige økter. Spesielt beregne gjennomsnittlig tid brukt i maten cup i løpet av 5 sek lys epoke for hver av åtte forsøk / session (dvs. et gjennomsnitt på åtte forsøk som er hvert 5 sek i varighet / rotte). Sammenligne gjennomsnittlig kontroll og eksperimentelle verdier for hver av fem daglige økter (se figur 3A).
- Analyser rottene motivasjon for å skaffe mat belønning ved å sammenligne mat cup oppførsel under levering av mat belønning (5 sek epoken) på tvers av de fem atferdsmessige økter som bruker samme utregning som spesifisert for 5 sek lys epoke over. Disse verdiene vil være gjennomgående høyere enn de som er ervervet under presentasjonen av den visuelle stimulus (se figur 3B).
- For testen økt: beregne en diskriminering forhold som beskriver rottenes mat cup atferd i respons til prespresentasjoner av hvert auditiv stimulus.
- Spesielt for hver rotte, dele gjennomsnittlig tid brukt i mat koppen etter hver av seks presentasjoner av sensorisk preconditioned stimulus (dvs. tonen) av summen av gjennomsnittlig tid brukt i mat koppen etter hver av seks presentasjoner av sensoriske prekondisjonerte stimulus (dvs. tonen stimulus) pluss gjennomsnittet av den totale tiden brukt i mat koppen etter hver av seks presentasjoner av uparet stimulus (dvs. hvit støy stimulus). Hver epoke er 10 sekunder i varighet.
Merk: En diskriminering score på 0,5 eller høyere viser at rotter lærte de foreninger som ligger i den sensoriske preconditioning paradigme.
- Spesielt for hver rotte, dele gjennomsnittlig tid brukt i mat koppen etter hver av seks presentasjoner av sensorisk preconditioned stimulus (dvs. tonen) av summen av gjennomsnittlig tid brukt i mat koppen etter hver av seks presentasjoner av sensoriske prekondisjonerte stimulus (dvs. tonen stimulus) pluss gjennomsnittet av den totale tiden brukt i mat koppen etter hver av seks presentasjoner av uparet stimulus (dvs. hvit støy stimulus). Hver epoke er 10 sekunder i varighet.
7. Verifisering av AAV Plassering og Expression
- Anesthetize og perfuse rottene transcardially bruker 4% paraformaldehyde. På grunn av bruken av fluorescerende markører, ikke overstige en etterfiksering tid på 2 timer til minimize tap av antigenisitet og for å bevare den fluorescerende signal.
- Dehydrere perfuserte hjerner ved å overføre dem til en hjerne krukke inneholdende 30 ml av en 20% sukrose-løsning i fosfatbufret saltvann (1x) i minst 2 dager eller til hjernen synker til bunnen av hjernen glasset.
- Bruk en frysing skyve mikrotom å gjøre koronale hjernen seksjoner (20-40 mm) gjennom hele rostrocaudal omfanget av regionen av interesse.
- Gjennomføre immunhistokjemi rettet mot merket reseptor eller reporter-protein for å fastslå beliggenhet og ekspresjon av designer reseptor og / eller reporter 12. En immunhistokjemi farging protokollen er gitt på DREADD wiki ressurs side 25.
- Monter delene bort på Superfrost-plus sklier og dekk bruker 100-200 mL av en vandig monteringsmedium.
- Utfør fluorescensmikropskopi på hjernevev å verifisere AAV plassering og protein uttrykk 12,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Atferds resultater
Ved fullføring av forsøket, bør effektiviteten av regionspesifikke midlertidig inaktive kvantitativt og kvalitativt bedømt. Den foreliggende eksempel omfatter et tre-faseadferds paradigmet (sensorisk forkondisjonering), hvor CNO ble administrert for å dempe nevral aktivitet i RSC under prekondisjonering sesjoner for å teste hypotesen om at den RSC er nødvendig for dannelsen av forbindelser mellom nøytrale stimuli 12. Viktigere er forskere ikke begrenset til atferds paradigmet eller eksperimentell design er beskrevet her som farmakogenetiske tilnærming kan være sammen med de fleste atferds paradigmer.
Mens analysene ikke er vanligvis utført på data generert i løpet av de preconditioning økter (fase 1), er det viktig å kvantifisere om rotter lærte lett mat foreningen under Badekar økter (fase 2). Som vist i Figure 3A, både eksperimentelle (Expt) and Control (Ctrl) rotter demonstrere økende mat cup oppførsel under presentasjoner av lyset stimulus (figur 3A) indikerer at rotter kjøpt en Pavlovian sammenheng mellom det visuelle stimulus (lys) og maten belønning. I tillegg demonstrerer begge grupper øker matkopp oppførsel under presentasjonen av mat belønning (figur 3B) som indikerer tilsvarende for å oppnå motivasjon for belønning. Under den kritiske Test økten, når auditive stimuli presenteres i fravær av andre stimuli, kontrollrottene har en diskriminering score som er vesentlig forskjellig fra eksperimentelle rotter (Figur 3C). Visuell inspeksjon av grafen viser at den gjennomsnittlige diskriminering forholdet mellom kontrollrotter er større enn 0,5, en indikasjon på større matkopp oppførsel som reaksjon på presentasjoner av den auditive stimulus som var forbundet med lys (ved prekondisjonering) sammenlignet med deres matkoppatferd i respons til presentasjoner av auditiv stimulus som ble sammenkoblingen (under prekondisjonering). I motsetning til dette eksperimentelle rotter ikke klarer å påvise en forskjell score som ovenfor er sjansen. Således viser figur 3C som kontroll, men ikke eksperimentelle rotter viste det sensoriske prekondisjonering effekt.
Verifisering av AAV Place
Ved fullførelsen av adferdstesting, analysere rottehjernevevet for korrekt plassering og ekspresjon av designer reseptoren. Conduct immunhistokjemi 12,25 ved hjelp av primære antistoffer rettet mot en reseptor kode (for eksempel en anti-HA primært antistoff), eller det fluorescerende reporter (i dette eksemplet, mcitrine som detekteres av et antistoff til grønt fluorescerende protein (GFP)). En skjematisk fremstilling av en koronale snitt gjennom rottehjernen er vist i figur 4A. Figur 4B illustrerer robust fluorescerende immundeteksjon av reporter prot. Ein i RSC i en representativ eksperimentell rotte uten fluorescerende markør påvist i omgivende områder figurene 4C - d illustrerer representative fluorescerende merking av rapportør proteiner i eksperimentell (Expt; rotter ble infusert med en AAV konstruksjon inneholdende designer reseptorgenet og mcitrine gen ) og kontroll (Ctrl; rotter ble fylt med en lignende AAV konstruksjon som inneholder GFP gen men ingen sekvens for designeren reseptor) rotter, henholdsvis. Reseptor nivåer kan også vises som minimum, representative og maksimal uttrykk 24. Hvis det oppdages merking i regioner utenfor området av interesse, ekskludere disse data fra atferdsanalyser.
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av AAV konstruere et diagram av hSyn-HA-hM4D (GI) -IRES-mCitrine AAV som brukes til å express hemmende designer reseptor (hM4Di) under en neuronal bestemt synapsin promoter (hSyn) i RSC nevroner. Immunofluorescent reportere (HA-tag og / eller mcitrine) kan brukes til å visualisere ekspresjon av proteinet og reporter, respektivt. hSyn, human synapsin promoter; spesifiserer uttrykk i nevroner. HA, hemagluttinin tag; denne koden er kondensert til designeren reseptor og virker som en epitop tag muliggjør deteksjon av reseptorekspresjon. hM4Di, genet for designeren inhiberende G-proteinkoblet reseptor. IRES, intern ribosomet oppføring nettstedet; lar reporter (mcitrine) som skal oversettes. mcitrine, en fluorescerende reporter som er en variant av GFP, men er mer motstandsdyktig mot fotobleking.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av sensorisk preconditioning paradigmet (A) I løpet av prekondisjonering sess.ioner, er 12 blandede prøver presentert. Under seks av studiene, er en auditiv stimulus presenteres i 10 sek umiddelbart etterfulgt av et blinkende huset lys stimulus (2 Hz, i 5 sek). I de andre seks forsøk, er en annen auditiv stimulus presenteres uten en visuell stimulans. (B) under kondisjone økter, er det tidligere paret visuelle stimulus paret med mat belønning. (C) under testen sesjon, er det 12 insprängda presentasjoner av de to auditive stimuli i fravær av visuelle stimuli eller mat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Behavioral resultater Gjennomsnittlig mat cup svare under (A) Lys og (B) Mat epoker DUring de Badekar økter (fase 2). Data ble analysert ved bruk av gjentatte målinger variansanalyse. (C) Diskriminering forholdstall under testen økten (fase 3). Den stiplede linjen viser like mengder kondisjonerte mat cup reagerer på hver auditiv stimulus (dvs. ingen sanse preconditioning) Data ble analysert ved hjelp av uavhengige utvalg t-test. Expt; eksperimentelle rotter (n = 17) tilført en AAV-konstruksjon som inneholder DNA-sekvensen for den inhiberende G-proteinkoblet reseptor designer (hM4Di) og DNA-sekvensen for en fluorescerende reporter (mcitrine). Ctrl; kontrollrotter (n = 6) infusert med hM4Di og administreres kjøretøy kombinert med kontrollrotter (n = 4) infusert med en AAV virus som ikke inneholder designer reseptoren og som ble administrert CNO. Kontrollgrupper var ikke signifikant forskjellige fra hverandre (p> 0,05). Feilfelt betegne ± SEM.
Figur 4: Histologisk verifikasjon av protein ekspresjon (a) et skjema som illustrerer plasseringen av RSC i en koronale snitt gjennom rottehjernen.. (B) Representative bilder av immunhistokjemisk merket rottehjernevevet fra en eksperimentell rotte (Expt) som ble infusert med en AAV-konstruksjon som inneholder DNA-sekvensen for den inhiberende G-proteinkoblet reseptor designer (hM4Di) og DNA-sekvensen for en fluorescerende reporter ( mcitrine). mcitrine er en svært lysekte variant av grønt fluoriserende protein. (C) Representative bilde fra en eksperimentell rotte som illustrerer plasseringen av det fluorescerende reporter etiketten (mcitrine). (D) Representant bilde fra en kontrollrotte (Ctrl) tilført en AAV konstruksjon som inneholder DNA-sekvensen for en fluorescerende reporter (forbedret GFP). Skala barer: B, 500 mikrometer; C og D, 10081; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan du bruker en farmakogenetiske tilnærming (DREADD) for å undersøke hvordan en bestemt hjernen regionen bidrar til en flerfase kompleks læring oppgave. Med muligheten til å midlertidig og tele taushet nevrale aktiviteten i diskrete områder av hjernen over faser av læring, gir denne kombinasjonen av tilnærminger en plattform for å undersøke et bredt spekter av atferd, inkludert mer nyanserte eller maskerte læringsformer. I det eksempel som er beskrevet i denne protokollen, kontrollrotter og rotter som uttrykker reseptoren designer i retrosplenial cortex (RSC) ble testet i en 3-fase behavioral oppgave 12. Den første fasen av oppgaven involvert presentasjon av flere nøytrale stimuli med den forutsetning at styrer rotter ville få en stimulus-stimulus sammenheng mellom to av stimuli. Arbeids hypotese er at RSC er nødvendig for stimulus-stimulus læring, således, på hver av fire kondisjone dager, 30 min før starten av adferdstesting, kontroll og forsøksrotter ble gitt systemisk administrering av enten designer medikament (CNO) eller bærer. Når de er bundet til designeren reseptoren, CNO reduserer aktiviteten av neuroner i hvilket som reseptoren blir uttrykt. I løpet av de resterende faser av atferdskondisjonering og testing, når RSC ikke er antatt å påvirke læring, ble CNO ikke administreres og dermed nevrale aktiviteten ble ikke forstyrret.
Kritiske trinn i protokollen
Sikker håndtering av AAV forbindelser: De kirurgiske prosedyrer som er involvert i farmakogenetiske tilnærmingen er ikke mer teknisk krevende enn en enkel stereotaksisk tilførsel er imidlertid bruken av AAV på noen institusjoner krever at experimenters følge BSL-2 forholdsregler. Det er viktig at etterforskerne følge retningslinjene fastsatt av Centers for Disease Control, virkemiddelapparatet, hjem institusjoner og andre kontrollutvalgene er spesifikke for deres forskningsprogram. Informasjon om the sikker håndtering av AAVs er lett tilgjengelig 13.
Forberedelse og administrasjon av designer narkotika: CNO, designeren stoffet, binder seg til designer reseptor og stiller nevrale aktiviteten, men er ellers biologisk inert 1,3. Forsendelser av CNO fra leverandører kan variere i konsistens. Forbindelsen bør komme som et pulver som ikke er festet til sidene av beholderen.
Viktige kontrollgrupper for å vurdere: For å kontrollere for uspesifikke effekter av designer narkotika, før atferds testing, sette mot et annet sett av eksperimentelle rotter (dvs. de som uttrykker designer reseptor) med kjøretøy injeksjoner i stedet for CNO. I tillegg, for å kontrollere for ikke-spesifikke virkninger av designeren reseptoren omfatter en gruppe rotter som er fylt med en kontrollvirus som inneholder et fluoriserende reporter, men ikke den modifiserte designer reseptoren og injisere disse rottene med designeren medikament (dvs. CNO) . Ensure tilstrekkelig eksperimentell design av counterbalancing tvers av grupper.
Verifisering av ekspresjonen av konstruksjonen: Det finnes en rekke måter å maksimere ekspresjon og påvisning av designer reseptoren. Før infusjon, kontrollere at viral titer er nær 10 12 partikler / ml. Ofte visualisering av det fluorescerende reporter er lav og derfor er det anbefalt at immunhistokjemi utføres på samme område av interesse ved bruk av antistoffer rettet mot reporter (e) som inngår i det virale konstruksjonen 25. I dette eksempel, gir anti-GFP immunoreaktivitet et robust signal (figurene 4B - D). Viktigere, på grunn av innholdet av fluorescerende markører, begrense lengden av fiksering tiden til 2 timer.
Fordeler av teknikkene
Når viral konstruksjon er blitt levert til hjernen via stereotaksisk kirurgi, tillater farmakogenetiske tilnærmingen for den midlertidige inactivasjon av hjerneaktivitet i adskilte områder ved hjelp av en minimal invasiv systemisk injeksjon av designer stoffet. Drug Administration kan skje flere ganger, noe som er fordelaktig for atferds oppgaver som oppstår over påfølgende dager eller uker 12,24,26. Videre indikerer bevis for at konstruktøren medikament (CNO) ikke hindrer bevegelsesatferd eller appetitt 27,28. Således gir fremgangsmåten mulighet for å dempe nevral aktivitet for en kort periode (2-5 timer), og samtidig unngå stressfaktorer som ligger i andre fremgangsmåter for midlertidige inaktivering. Nærmere bestemt, i kanylering studier, er midlertidig inaktivering oppnås ved levering av nervegifter gjennom kanyler som er permanent festet til skallen. Denne tilnærmingen er begrenset i at det å holde kanylen fri for rusk og beskyttet er utfordrende. Videre, for å indusere inaktivitet, blir dyrene behandles grundig (for å administrere toksinet gjennom kanyler) like før atferds testing, WHIch pålegger stress på dyret og øker også sannsynligheten for at kanyler kan løsne fra skallen. Fordi effektene av CNO er relativt kort sikt, er muligheten for langsiktige kompenserende mekanismer (for eksempel de som ble observert etter permanente skader eller genmanipulerte mus) minimert 29,30.
Begrensninger av teknikkene
DREADD er en relativt ny metode for ikke-invasiv dempende neuronal aktivitet. Som slike forskere kan være tilbøyelig til å uavhengig verifisere at nevronale stanse oppstår i deres forberedelser. Verifikasjon kan utføres ved hjelp av elektrofysiologiske metoder, men disse forsøk er tidkrevende, kostbart og krever spesifikk kompetanse. I tillegg, mens chemogenetic teknikker er mindre kostnadskrevende enn optogenetics, er problemstillingen dyrere enn tradisjonelle inaktivering med farmakologiske midler så som TTX. En annen begrensning av DREADD tilnærmingen er at Infusion av de virale konstruksjoner ikke resulterer i 100% infeksjon av nevroner i regionen av interesse, og heller ikke inaktivering via CNO fører til 100% reduksjon av neuronal aktivitet. Til slutt, kan noen AAV serotyper bli retrograd transportert som kan komplisere tolkningen av forsøksresultater to.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker forfatterne av Robinson et al. 12 for deres bidrag til manuskriptet som denne protokollen er delvis avledet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
