Summary

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

임신에서 면역 관용은 어머니의 면역 체계가 현상 태아에 동의하고 육성하기 위해 특유의 변화를 겪는 것을 요구한다. 이 허용 오차는 성교시에 시작 Fecundation는과 주입 중 설립, 임신 동안 유지된다. 산모 – 태아 관용의 활성 세포 및 분자 매개은 태반과 자궁과 탈락 막 조직을 포함하는 산모 – 태아 인터페이스로 알려진 태아와 산모의 조직 사이의 접촉의 사이트에 충실. 이 인터페이스는, 기질 세포 및 백혈구 침윤으로 구성되고, 그 표현형 풍부하고 임신에 걸쳐 변화. 모체 – 태아의 계면에 침투 백혈구 함께 임신 지탱 로컬 미세 환경을 만들 호중구, 대 식세포, 수지상 세포, 비만 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 및 NKT 세포를 포함한다. 이 세포 또는 inapprop 간의 불균형자신의 표현형에 riate 변경은 임신 질병의 메커니즘을 고려된다. 따라서, 산모 – 태아 인터페이스를 침투 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증으로 이어질 면역 메커니즘을 규명하기 위해 필수적이다. 본원에 기재된 단백질 분해 및 모체 – 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리 collagenolytic 효소 칵테일 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 충분히 보존 항원 및 기능적 특성을 가진 가능한 백혈구 (> 70 %)의 높은 숫자의 분리 수 있습니다. 격리 백혈구이어서 면역 표현형, 세포 분류, 영상화, 면역, mRNA 발현, 세포 배양, 및 혼합 백혈구 반응, 증식 또는 세포 독성 분석 시험 관내 기능 분석 등을 포함한 몇 가지 기술에 의해 분석 될 수있다.

Introduction

특징적인 변화가 어머니의 면역 시스템 내에서 발생하는 경우 임신 면역 관용은 기간입니다. 이러한 변화는 어머니가 태아, 반 동종 이식 (1)을 허용 할 수 있습니다. 태아는 아버지의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 항원이, 태아 세포가 모체 순환 3에서 발견 된 표현; 그러나 태아는 4,5를 거부하지 않습니다. 이 수수께끼는 완전히 이해되지 않습니다.

가장 최근의 가설은 산모 – 태아의 허용 오차가 성교 중에 생성 및 6,7 Fecundation는과 만삭 임신 8 ~ 10을 유지하기 위해 유지되는 것을 말한다. 이 산모 – 태아 관용의 고장은 임신 10-16의 초기와 후기 단계에서 질병의 메커니즘을 고려된다. 모체 – 태아의 공차는 T 세포 (T 조절 세포, Th1 세포, TH2 세포와 Th17 세포), MAC 등 다양한 백혈구 하위 집단의 참여를 수반rophages, 호중구, 비만 세포, NK 세포, 및 NKT 세포, 수지상 세포 및 B 세포, 임신 15,17-19 걸쳐 밀도 및 위치 파악에 그 변화. 어머니의 면역 체계가 태아 항원 (20, 21)와 상호 작용하는 해부학 사이트 – 산모 – 태아의 허용 오차는 산모 – 태아 인터페이스 (20)에서 농축된다.

태아 extravillous 영양막 세포가 자궁 점막 22-24를 침공 할 때 산모 – 태아 인터페이스는 태반 중에 작성됩니다. 이 인터페이스의 태아 측면에서, 태아를 둘러싸고있는 막은 태반 내에서 전문 상피 표면을 생성하고, 융합 세포의 세포는 산모의 혈액 (22)과의 직접 접촉을 통해 영양 교환을 제어 할 수 있습니다. 인터페이스의 모체 측에서 탈락은 모든 마우스에서 탈락 막 세포의 50 %로 30 %를 차지하고 백혈구 이종 풀을 모집. matern에 참여하는 것 외에도알 면역 관용,이 세포는 임신 기간 동안 다른 프로세스, 예., 감염, Fecundation는에서 생식 기관의 보호, 배아 이식 7,25, 탈락 혈관 신생 (26), 혈관 재 24,27, 영양막 세포 침윤 (28), 태반의 핵심 기여자입니다 개발 24, 25, 및, 궁극적으로, 노동 및 배달 15,17. 따라서, 산모 – 태아 내성에 관여하는 백혈구의 연구는 임신 관련 합병증의 발병 기전을 해명하는 것이 필수적입니다.

면역 조직 화학 염색 및 면역 형광의 사용이 직접 시각화 및 자궁, 탈락, 또는 태반 백혈구 (29, 30)의 국산화에 대한 데이터를 생성하고 있지만, 더 이러한 조직 (31, 32)의 각각에 백혈구의 특정 부분 집합을 밝혔다 분석 유동 세포 계측법. 또한 계측법 밀도 메이터의 비율을 결정하기 위해 사용되어왔다 흐름NAL-태아 인터페이스는 세포와 세포 내 단백질 8-10,34 33과 표현 수준을 백혈구. 모체 – 태아의 계면에서 백혈구 세포 계측 분석 흐름은 단일 세포 현탁액을 필요로한다. 탈락, 자궁, 태반 조직으로부터 침윤 백혈구를 분리하기 위해, 티슈 해리의 두 가지 방법이 사용되고있다 : 기계적 및 효소. 두 가지 방법이 조직의 세포 외 기질 (ECM)에서 침투 백혈구의 분리를 할 수 있습니다. 덜 전단력 – 관련 손상 (35) 백혈구의 높은 수율을 허용하는 조직 분해 효소는 조직 기계적 해리 우수하다. 따라서, 기계적 해리 티슈 샘플의 가변성 및 이질성 조직을 증가시킬 수있다 (36)를 필요로 풀링. 그러나, 기계적 해리 관심 항원 또는 효소 분해에 의해 변경 될 때 때 선택이 세포의 기능관심의 필요의 보존되는 (예., NK 세포의 세포 독성) 35.

ECM을 저하 특정 단백질 분해 효소의 사용은 기계적 해리 관찰 저수율을 제거한다. 여러 연구 트립신 (32), 콜라게나 제 (37)의 DNase (31), (38) 디스 파제, 각종 효소 32,39의 상업 칵테일의 사용 신고되었습니다. 그러나, 자연 및 다른 효소의 농도 및 분해 기간 꼼꼼하게 정의 면역 표현형에 필요한 세포 표면 항원 성 에피토프의 무결성의 유지를 보장하기 위해 검증되어야한다. 다양한 표면 구조는 다수의 단일 클론 항체에 의해 인식 백혈구 표면 에피토프 스트리핑 악명되고, 트립신과 같은 일부 효소와 다른 효소에 의해 파괴 차분 쉽다.

본원에 도입 proteolyt를 사용하는 방법이다Accutase라고 IC와 collagenolytic 효소 칵테일. 이 효소 용액을 충분히 모체 – 태아의 계면에서 해리 뮤린 조직 내 여전히 효율적으로 완만하고, 해리 반응을 정지 해리 다른 시약 또는 혈청의 첨가를 필요로하지 않는다. 해리 시간을 검증 할 필요가 있지만, 또한, 그것은 전술 한 효소 40,41보다 더 강력, 공급로 사용할 준비하고.

조직 세분화 두 유형의 조합의 이용은 얻어지는 전지의 품질과 양을 향상시킨다; 따라서, 여러 연구 결과는 만족할 31,32,37와 기계적 및 효소 적 분해의 병용을 시행하고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 설립 우리의 실험실에서 검증되었다 이것은 강력한 효소 세분화이어서 부드러운 기계적 해리의 조합을 사용한다. 이 프로토콜은의 고립과 더 많은 연구를 할 수 있습니다산모 – 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에 침투 백혈구 (자궁, 탈락 및 태반). 유세포 분석에 의해 입증 된 바와 같이 다음과 같은 프로토콜은 세포 표면 마커 및 하류 어플리케이션에 충분한 수율을 생세포의 무결성을 유지한다. 마지막으로,이 프로토콜은 분석 모체 – 태아의 인터페이스를 구성하는 다른 뮤린 조직의 비교 세포 제제의 일관성을 유지한다.

Protocol

이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 동물의 윤리적 인 승인은 지역 연구 윤리위원회와 윤리 심의 보드에 의해 제공되어야합니다. 동물의 혈액, 세포, 또는이 프로토콜에 언급 된 유해 에이전트와 작업 할 때, 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야합니다. 1. 마우스의 취급 및 조직 컬렉션 멸균 워크 스테이션을 준비하고 조직 수집을 위?…

Representative Results

모체 – 태아의 인터페이스에서 뮤린 조직의 절개는도 1에 도시되어있다; 이 절차는 복강 (도 1A, B), 주입 부위 (도 1d)를 포함한 자궁 뿔 (도 1C), 및 자궁 조직의 컬렉션 (도 1E), 태반 (도 1F), 및 탈락 조직을 개방 포함 16.5에서 (그림 1G)는 DPC. 그림 2는 고립 된 대 식세포의 형태를 보여줍니다 (F4 / 80 +) …

Discussion

산모 – 태아 인터페이스에 침투 백혈구의 풍요 로움과 표현형 특성을 기록하고 일관된 데이터의 수집은 임신 관련 합병증의 발병 기전을 이해하는 데 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 31,38,39,43-46 걸쳐 모체 – 태아의 계면에서 뮤린 조직으로부터 백혈구 침투의 분리를 용이하게하는 기술되었다. 그러나, 각각의 기술은 다르고, 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NGL은 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 비판적인 읽기 모린 McGerty 에이미 E. Furcron (웨인 주립 대학)을 인정합니다.

Materials

Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies (Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin (BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother’s little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system’s interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring’s health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

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Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

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