Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Immuntoleranse i svangerskapet krever at immunforsvaret til mor gjennomgår karakteristiske endringer for å akseptere og gi næring til fosteret. Denne toleransen er initiert under samleie, etablert under fecundation og implantasjon, og vedlikeholdes gjennom hele svangerskapet. Aktive cellulære og molekylære formidlere av maternal-føtal toleranse er beriket på kontaktstedet mellom foster eller mor vev, kjent som mor til foster grensesnitt, som inkluderer morkaken og livmor og Deciduale vev. Dette grensesnittet består av stromale celler og infiltrere leukocytter, og deres overflod og fenotypiske egenskaper endre seg i løpet av svangerskapet. Infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet inkluderer nøytrofile, makrofager, dendrittiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler, og NKT celler som til sammen skaper den lokale mikro-miljøet som opprettholder svangerskapet. En ubalanse mellom disse celler eller ethvert inappropmessig endring i deres fenotyper er ansett som en mekanisme for sykdom i svangerskapet. Derfor er studiet av leukocytter at infiltrere maternal-føtal grensesnitt viktig for å belyse immunmekanismer som fører til svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Beskrevet her er en protokoll som bruker en kombinasjon av milde mekanisk dissosiasjon etterfulgt av en robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og kollagenolytisk enzymatisk cocktail å isolere infiltrere leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt. Denne protokollen tillater isolering av et høyt antall levedyktige leukocytter (> 70%) med tilstrekkelig konserverte antigene og funksjonelle egenskaper. Isolerte leukocytter kan deretter bli analysert ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunfenotyping, cellesortering, bildebehandling, immunoblotting, mRNA-ekspresjon, cellekultur, og in vitro funksjonelle forsøk slik som blandede leukocyttkultur-reaksjon, proliferasjon eller cytotoksisitetsanalyser.

Introduction

Immuntoleranse i svangerskapet er en periode da karakteristiske endringer forekommer i immunforsvaret til mor. Disse endringene gjør at moren til å tolerere fosteret, en semi-allogen pode ^en. Fosteret uttrykker fars hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) antigener ^to, og føtale celler er funnet i morens sirkulasjon ^3; imidlertid er fosteret ikke avvises ^4,5. Dette gåte er ikke fullt ut forstått.

Den siste hypotesen sier at maternal-føtal toleranse er opprettet under samleie og fecundation ^6,7 og vedlikeholdes for å opprettholde en full-term graviditet ^8-10. En oppsplitting av denne maternal-føtal toleranse er ansett som en mekanisme for sykdom i tidlige og sene stadier av svangerskapet ^10-16. Mor til foster toleranse innebærer deltakelse av ulike leukocytter sub-populasjoner, inkludert T-celler (regulatoriske T-celler, Th1-celler, Th2-celler og Th17 celler), macrophages, nøytrofile, mast celler, NK-celler, og NKT celler, dendrittiske celler og B-celler, som endring i tetthet og lokalisering gjennom hele svangerskapet ^15,17-19. Mor til foster toleranse er beriket ved maternal-føtal grensesnitt ²⁰ – den anatomiske området der immunforsvaret til mor samhandler med føtale antigener ^20,21.

Den maternal-føtal grensesnittet er opprettet under placentation når fosterets extravillous trophoblast celler invadere livmorslimhinnen ^22-24. På fosterets side av dette grensesnittet, membraner som omgir fosteret lage en spesialisert epiteloverflaten i morkaken, og syncytiotrophoblast celler styre næringsstoff utveksling gjennom sin direkte kontakt med mors blod ^22. På mors side av grenseflaten, decidua rekrutterer en heterogen pool av leukocytter som i mus utgjør 30% til 50% av alle uterusslimhinneceller. I tillegg til sin deltakelse i Maternal immuntoleranse, disse cellene er viktige bidragsytere til ulike prosesser i løpet av svangerskapet, f.eks., beskyttelse av skjede fra infeksjoner, fecundation, embryoimplantasjonen ^7,25, decidual angiogenese ^26, vaskulær remodelle ^24,27, trophoblast invasjonen ^28, morkake utvikling ^24,25, og, til slutt, arbeid og levering ^15,17. Derfor er studiet av leukocytter involvert i maternal-føtal toleranse viktig å belyse patogenesen av svangerskapsrelaterte komplikasjoner.

Mens bruken av immunhistokjemi og immunfluorescens har generert data for direkte visualisering og lokalisering av livmor, decidual, eller placenta leukocytter ^29,30, flow cytometri analyse har videre avslørt spesifikke undergrupper av leukocytter i hver av disse vev ^31,32. I tillegg flow cytometri er blitt brukt til å bestemme tetthet og andelen av maternal-føtal grensesnitt leukocytter ³³ og uttrykk nivåer av ekstracellulære og intracellulære proteiner ^8-10,34. Strømningscytometrisk analyse av leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet krever en encellet suspensjon. For å isolere infiltrere leukocytter fra decidual, livmor, og morkakevev, har to fremgangsmåter for vev dissosiasjon blitt anvendt: mekanisk og enzymatisk. Begge metodene tillater separasjon av infiltrerte leukosytter fra den ekstracellulære matriks (ECM) av disse vev. Enzymatisk vev dissosiasjon er overlegen mekanisk vev dissosiasjon som det tillater et høyere utbytte av leukocytter med mindre skjærkraft assosierte skader ^35. Følgelig krever mekanisk vev dissosiasjon pooling vev ^36, som kan øke variabilitet og heterogenitet av prøvene. Likevel kan mekanisk dissosiasjon være valg når antigenet av interesse kan bli endret ved enzymatisk dissosiasjon, eller når funksjonaliteten av cellens av interesse behov for å bli bevart (f.eks., cytotoksisitet av NK-celler) ^35.

Bruken av proteolyse med spesifikke enzymer for å degradere ECM eliminerer de lave rentene observert med mekanisk dissosiasjon. Flere studier har rapportert bruk av trypsin ^32, kollagenase ^37, DNase ^31, dispase ^38, og kommersielle cocktails av ulike enzymer ^32,39. Imidlertid må arten og konsentrasjonen av forskjellige enzymer og varigheten av fordøyelsen være omhyggelig definert og valideres for å sikre opprettholdelse av integriteten av celleoverflate-antigene epitoper som er nødvendige for immunfenotyping. De forskjellige overflatestrukturer er differensielt utsatt for ødeleggelse av forskjellige enzymer, med noen enzymer, såsom trypsin, som er beryktet for stripping av leukocytt-overflate epitoper gjenkjent av flere monoklonale antistoffer.

Introdusert her er en metode som bruker en proteolytic og kollagenolytisk enzymatisk cocktail, kalt Accutase. Denne enzymatiske løsningen er skånsom nok samtidig effektiv i dissociating murine vev ved maternal-føtal grensesnitt, og krever ikke tillegg av andre dissociating reagenser eller serum for å avslutte dissosiasjon reaksjon. Videre, er den klar til bruk som levert, og selv om tiden for dissosiasjon må valideres, det er mer robust enn de ovennevnte enzymer ^40,41.

Anvendelsen av en kombinasjon av begge typer av vev dekomponering forbedrer kvaliteten og mengden av celler oppnådd; dermed har flere studier gjennomført kombinert bruk av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon med tilfredsstillende resultater ^31,32,37. Protokollen er beskrevet her ble etablert og validert i vårt laboratorium; Den benytter en kombinasjon av en mild mekanisk dissosiasjon etterfulgt av en robust enzymatisk dekomponering. Denne protokollen tillater isolering og videre studier avde infiltrere leukocytter i murine vev ved maternal-føtal grensesnitt (livmor, decidua, og placenta). Følgende protokoll også opprettholder integriteten av celleoverflatemarkører og gir tilstrekkelig levedyktige celler til nedstrøms applikasjoner som demonstrert ved strømningscytometrisk analyse. Til slutt, opprettholder denne protokollen konsistensen av cellepreparat for analyse og sammenligning av ulike murine vev som utgjør maternal-føtal grensesnitt.

Protocol

Før arbeider med prøvene nevnt i denne protokollen, må dyret etisk godkjenning gis av den lokale forskningsetiske komité og Institutional Review Boards. Når du arbeider med dyreblod, celler, eller farlige stoffer som er nevnt i denne protokollen, må de riktige biologisk og laboratorie sikkerhetstiltak følges. 1. Mouse Håndtering og Tissue Collection Forbered en steril arbeidsstasjon og få sterile verktøy for vev samling. Disse verktøyene vil omfatte store og små kirurg…

Representative Results

Disseksjon av murine vev fra mor til foster grensesnittet er vist i figur 1; denne fremgangsmåten omfatter å åpne bukhulen (figur 1 A, B), uterine horn (figur 1C), inkludert implantasjoner (figur 1D), og innsamling av uterusvev (figur 1E), placenta (figur 1F), og Deciduale vev (figur 1G) ved 16,5 DPC. Figur 2 viser morfologi av isolerte makrofager (F4 / 80 +) samlet inn fra Deciduale…

Discussion

Samlingen av konsistente data som registrerer overflod og fenotypiske egenskaper ved infiltrere leukocytter ved maternal-føtal grensesnittet er avgjørende for å forstå patogenesen av svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Flere teknikker har blitt beskrevet som lette isolering av infiltrerende leukocytter fra murine vev ved maternal-føtal grensesnitt gjennom hele svangerskapet ^{31,38,39,43-46.} Men hver teknikk er forskjellig, bruker ulike enzymer eller enzym kombinasjoner, krever forskjellige dissosiasjon …

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope