Summary

Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

La tolerancia inmunológica en el embarazo requiere que el sistema inmunológico de la madre experimenta cambios distintivos para aceptar y nutrir al feto en desarrollo. Esta tolerancia se inicia durante el coito, establecido durante la fecundación y la implantación, y se mantiene durante todo el embarazo. Mediadores celulares y moleculares activos de la tolerancia materno-fetal se enriquecen en el sitio de contacto entre los tejidos fetales y maternas, conocidos como la interfaz materno-fetal, que incluye la placenta y el útero y los tejidos deciduales. Esta interfaz se compone de las células del estroma y leucocitos infiltrantes, y sus características fenotípicas de abundancia y cambia en el transcurso del embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal incluyen neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, células T, células B, células NK, las células NKT y que juntos crean el micro-entorno local que sustenta el embarazo. Un desequilibrio entre estas células o cualquier inappropalteración piados en sus fenotipos se considera un mecanismo de la enfermedad en el embarazo. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos que se infiltran en la interfase materno-fetal es esencial con el fin de dilucidar los mecanismos inmunológicos que conducen a complicaciones relacionadas con el embarazo. Descrito en el presente documento es un protocolo que utiliza una combinación de disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto con una proteolítica y cóctel colagenolıtica enzimática para aislar los leucocitos infiltrantes de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Este protocolo permite el aislamiento de un gran número de leucocitos viables (> 70%) con propiedades antigénicas y funcionales suficientemente conservadas. Leucocitos aislados pueden ser analizados mediante varias técnicas, incluyendo la inmunofenotipificación, clasificación de células, formación de imágenes, inmunotransferencia, la expresión de ARNm, cultivo celular, y en ensayos funcionales in vitro tales como reacciones mixtas de leucocitos, la proliferación, o ensayos de citotoxicidad.

Introduction

La tolerancia inmune durante el embarazo es un período en que se producen cambios distintivos en el sistema inmunológico de la madre. Estos cambios permiten a la madre para tolerar el feto, un injerto alogénico semi-1. El feto expresa paternal complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antígenos de 2, y las células fetales se han encontrado en la circulación materna 3; sin embargo, el feto no se rechaza 4,5. Este enigma no se entiende completamente.

La hipótesis más reciente afirma que se crea la tolerancia materno-fetal durante el coito y su fecundación 6,7 y mantenido para sostener un embarazo a término 8-10. El desglose de esta tolerancia materno-fetal se considera un mecanismo de la enfermedad durante las primeras y últimas etapas del embarazo 10-16. La tolerancia materno-fetal consiste en la participación de los diversos sub-poblaciones de leucocitos, incluyendo las células T (células T reguladoras, las células Th1, células Th2 y células Th17), macrophages, neutrófilos, mastocitos, células NK, y células NKT, células dendríticas y células B, que el cambio en la densidad y localización durante todo el embarazo 15,17-19. Tolerancia materno-fetal se enriquece en la interfase materno-fetal 20 – el sitio anatómico donde el sistema inmune de la madre interactúa con los antígenos fetales 20,21.

Se crea la interfaz materno-fetal durante la placentación cuando las células trofoblásticas extravillous fetales invaden la mucosa uterina 22-24. En el lado fetal de esta interfaz, las membranas que rodean al feto crean una superficie epitelial especializada dentro de la placenta, y las células sincitiotrofoblasto controlan el intercambio de nutrientes a través de su contacto directo con la sangre materna 22. En el lado materno de la interfaz, el decidua recluta una piscina heterogéneo de leucocitos en ratones que representan el 30% a 50% de todas las células deciduales. Además de su participación en maternAl tolerancia inmune, estas células son los principales contribuyentes a los distintos procesos durante el embarazo, por ejemplo., la protección del tracto reproductivo de las infecciones, la fecundación, la implantación del embrión 7,25, la angiogénesis decidual 26, remodelado vascular 24,27, la invasión del trofoblasto 28, de la placenta desarrollo 24,25, y, en última instancia, el trabajo y la entrega 15,17. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos implicados en la tolerancia materno-fetal es esencial para dilucidar la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo.

Aunque el uso de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia ha generado datos para la visualización directa y localización de uterina, decidual, o leucocitos placentarios 29,30, citometría de flujo análisis ha revelado también subconjuntos específicos de leucocitos en cada uno de estos tejidos 31,32. Además, la citometría de flujo se ha utilizado para determinar la densidad y la proporción de maternal-fetal interfaz de leucocitos 33 y de expresión los niveles de proteínas extracelulares e intracelulares 8-10,34. Análisis de citometría de flujo de leucocitos en la interfase materno-fetal requiere una suspensión de una sola célula. Con el fin de aislar los leucocitos infiltrantes de la decidual, uterino, y tejidos de la placenta, se han utilizado dos métodos de disociación de tejidos: mecánica y enzimática. Ambos métodos permiten la separación de los leucocitos infiltrados de la matriz extracelular (ECM) de estos tejidos. Disociación enzimática de tejido es superior a la disociación de tejido mecánica, ya que permite un mayor rendimiento de los leucocitos con daño asociado a la fuerza de cizallamiento menos 35. En consecuencia, la disociación de tejido mecánico requiere la agrupación de tejidos 36, que pueden aumentar la variabilidad y la heterogeneidad de las muestras. Sin embargo, la disociación mecánica puede ser la opción cuando el antígeno de interés puede ser alterada por disociación enzimática o cuando la funcionalidad de la células de las necesidades de interés que se conserva (por ejemplo., la citotoxicidad de las células NK) 35.

El uso de la proteolisis con enzimas específicas para degradar la ECM elimina los bajos rendimientos observados con disociación mecánica. Varios estudios han reportado el uso de tripsina 32, colagenasa 37, DNasa 31, Dispasa 38 y cócteles comerciales de diversas enzimas 32,39. Sin embargo, la naturaleza y concentración de diferentes enzimas y la duración de la digestión deben ser meticulosamente definidos y validados con el fin de asegurar el mantenimiento de la integridad de los epítopos antigénicos de la superficie celular necesarias para inmunofenotipo. Las diversas estructuras de la superficie son diferencialmente susceptibles a la destrucción por diferentes enzimas, con algunas enzimas, tales como tripsina, siendo notorio para pelar epítopos de superficie de leucocitos reconocidos por muchos anticuerpos monoclonales.

Introducido en el presente documento es un método que utiliza un proteolytic y cóctel enzimático colagenolítica, llamado Accutase. Esta solución enzimática es lo suficientemente suave mientras que todavía eficiente en disociar tejidos murinos en la interfase materno-fetal, y no requiere la adición de otros reactivos o suero de disociación para terminar la reacción de disociación. Por otra parte, está listo para usar tal como se suministra y, aunque el tiempo de disociación debe ser validado, es más robusto que las enzimas mencionadas anteriormente 40,41.

La utilización de una combinación de ambos tipos de desagregación del tejido mejora la calidad y la cantidad de células obtenidas; Por lo tanto, varios estudios han implementado el uso combinado de disociación mecánica y enzimática con resultados satisfactorios 31,32,37. El protocolo descrito en este documento se estableció y validó en nuestro laboratorio; que utiliza una combinación de una disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto. Este protocolo permite el estudio y el aislamiento adicional delos leucocitos infiltran en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal (útero, decidua y placenta). El siguiente protocolo también mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y los rendimientos de células viables suficiente para aplicaciones posteriores como se demuestra por análisis de citometría de flujo. Finalmente, este protocolo mantiene la consistencia de la preparación de células para el análisis y la comparación de diferentes tejidos murinos que componen la interfaz materno-fetal.

Protocol

Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética animal debe ser dada por el Comité de Ética Local de Investigación y las Juntas de Revisión Institucional. Cuando se trabaja con sangre animal, células o agentes peligrosos que se mencionan en este protocolo, las medidas de bioseguridad y seguridad de laboratorio adecuados se deben seguir. 1. Manejo del ratón y Tejidos Colección Preparar una estación de trabajo estéril y obtener herram…

Representative Results

La disección de los tejidos murinos de la interfaz materno-fetal se muestra en la Figura 1; Este procedimiento incluye la apertura de la cavidad peritoneal (Figura 1A, B), cuernos uterinos (Figura 1C), incluyendo los sitios de implantación (Figura 1D), y la colección de los tejidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), y los tejidos deciduales (Figura 1G) a 16,5 dpc. La Figura 2</strong…

Discussion

La recogida de datos consistentes que registra las características de abundancia y fenotípicas de los leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal es esencial para la comprensión de la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Varias técnicas se han descrito que facilitan el aislamiento de la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal durante el embarazo 31,38,39,43-46. Sin embargo, cada técnica es diferente, utiliza enzimas o combinac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NGL fue apoyado por la Iniciativa Universitaria Perinatal Wayne State en maternas, perinatales y Salud Infantil. Agradecemos Maureen McGerty y Amy E. Furcron (Wayne State University) por su lectura crítica del manuscrito.

Materials

Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies (Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin (BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope

References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother’s little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system’s interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring’s health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Play Video

Cite This Article
Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

View Video