פרוטוקול קו-אימונו-משקעים זה מאפשר לחקור את האינטראקציה בין נוקלאופרוטאין של נגיף השפעת A לבין החלבון האנטי-ויראלי Mx1 בתאים אנושיים. הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של N-ethylmaleimide להצלחה של קו-אימונו-משקעים של Mx1 ונוקלאופרוטאין של נגיף השפעת A.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקר האינטראקציה בין חלבונים הוא המפתח להבנת התפקוד שלהם. שיטה חזקה מאוד המשמשת לעתים קרובות לחקר אינטראקציות של חלבונים עם מקרומולקולות אחרות בדגימה מורכבת נקראת קו-אימונו-משקעים. פרוטוקול הקו-אימונו-משקעים המתואר מאפשר להדגים ולחקור עוד יותר את האינטראקציה בין חלבון העמידות האנטי-ויראלי למיקסווירוס 1 (Mx1) לבין אחת המטרות הוויראליות שלו, נוקלאופרוטאין נגיף השפעת A (NP). הפרוטוקול מתחיל בתאי יונקים שעברו טרנספטציה, אך ניתן גם להשתמש בתאים נגועים בנגיף שפעת A כחומר מוצא. לאחר ליזיס תאים, חלבון ה-NP הנגיפי נמשך כלפי מטה עם נוגדן ספציפי והקומפלקסים החיסוניים המתקבלים משקעים עם חרוזי חלבון G. המשיכה המוצלחת של NP והקו-אימונו-משקעים של חלבון Mx1 האנטי-ויראלי מתגלים לאחר מכן על ידי כתמים מערביים. תנאי מוקדם למשקעים חיסוניים מוצלחים של Mx1 עם NP הוא נוכחות של N-ethylmaleimide (NEM) במאגר הליזיס של התאים. NEM אלקילטים משחררים קבוצות תיול. יש להניח שתגובה זו מייצבת את האינטראקציה החלשה ו/או החולפת NP-Mx1 על ידי שימור קונפורמציה ספציפית של Mx1, המטרה הנגיפית שלו או מרכיב שלישי לא ידוע. מגבלה חשובה של ניסויי קו-אימונו-משקעים היא משיכה לא מכוונת של חלבונים מזהמים, הנגרמת על ידי קשירה לא ספציפית של חלבונים לחרוזי החלבון G או לנוגדנים. לכן, חשוב מאוד לכלול הגדרות בקרה כדי לא לכלול תוצאות חיוביות כוזבות. ניתן להשתמש בפרוטוקול הקו-אימונו-משקעים המתואר כדי לחקור את האינטראקציה של חלבוני Mx ממיני בעלי חוליות שונים עם חלבונים ויראליים, כל זוג חלבונים, או של חלבון עם מקרומולקולות אחרות. יש לבדוק את התפקיד המועיל של NEM לייצוב אינטראקציות חלשות ו/או חולפות עבור כל זוג אינטראקציות בנפרד.
מבוא
חלבוני התנגדות Myxovirus (MX) הם חלק חשוב של ההגנה החיסונית המולדת נגד פתוגנים נגיפיים. חלבונים אלה הם GTPases כמו dynamin-גדול הנגרמים על ידי הסוג I וסוג III אינטרפרונים. גני Mx המקבילים נמצאים כמעט בכל בעלי חוליות בעותקים אחד או מספר המוצרים והגן לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל Orthomyxoviridae (למשל., וירוס שפעת), Rhabdoviridae (למשל., וירוס stomatitis שלפוחי), Bunyaviridae (למשל. , וירוס LA CROSSE) וRetroviridae (למשל, וירוס כשל חיסוני אנושי-1) 1-4. לא ברור כיצד חלבונים אלה להכיר מגוון רחב כל כך של וירוסים, ללא כל רצף ראשוני משותף לכאורה מוטיבים בוירוסים אלה. ניתוח האינטראקציה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול transfection ושיתוף immunoprecipitation הבא נקבע לפורמט צלחת פטרי 9 סנטימטרים. פורמטים אחרים גם אפשריים לאחר שטפס על הפרוטוקול.
1. הכליה העוברית האנושי תאי 293T זריעה (HEK)
- זרעי יום אחד תאי HEK293T לפני transfection 1.2 x 10 6 תאים לכל 9 סנטימטר צלחת פטרי ב 12 מיליליטר של המדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, L-גלוטמין 2 מ"מ, 0.4 מ"מ Na-פירובט, 0.1 מ"מ חומצות אמינו שאינו חיוניים, 100 U / ml פניצילין ו 0.1 מ"ג / מיליליטר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
N-ethylmaleimide היא תרכובת אורגנית שיכול לשמש כדי לשנות באופן בלתי הפיך קבוצות תיאול חופשיות, למשל לעכב פרוטאזות ציסטאין (איור 1).
החלבון אנטי MX1 מעכב שפעת שכפול נגיף על ידי אינטראקציה עם nucleoprotein ויראלי. פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation מותאם המתואר כאן מאפשר ללמוד אינטראקציה NP-MX1 זה. תאי HEK293T היו transfected עם וקטורי ביטוי לחלבון MX1 אנטי בהעדר או הנוכחות של חלבון NP שפע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לומד את האינטראקציה בין חלבונים אנטי ויראלי והמטרות שלהם הוא מאוד חשוב להבין את פרטי המנגנון אנטי של החלבונים האלה. זה יכול לתת לי תובנות חדשות על איך וירוסים ומארחיהם התפתחו יחד ולהיות הבסיס לפיתוח אסטרטגיות אנטי חדשות. פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation מותאם המתואר כאן מאפשר לחקור את האינטראקציה בין חלבוני MX1 העכבר והיעד הנגיפי שלה, חלבון NP שפעת. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא התוספת של nem במאגר תמוגה, כאינטראקצית NP-MX1 היא בלתי ניתנת לגילוי בהעדר nem (איור 3).......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי FWO-Vlaanderen, פרויקט צבא IOF10 / StarTT / 027 ואוניברסיטת גנט מיוחדת מענק מחקר BOF12 / גואה / 014.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM גלוקוז גבוה | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | |
| Toxic Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | הידוע גם בשם קוקטייל מעכב פרוטאז NP40 |
| Roche | 11 873 580 001 | ||
| נוגדן חד שבטי נגד NP | NIH הגנה ביולוגית וזיהומים מתעוררים מאגר | משאבי מחקרNR-4282 | תערובת מיימת של שיבוטים A1 ו-A3 |
| אנטי-RNP סרום פוליקלונלי | NIH הגנה ביולוגית וזיהומים מתעוררים מאגר משאבי מחקר | NR-3133 | מכוון נגד A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 ס"מ | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL מצע כתמים מערבי | פירס | 32106 |
מקורות
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
