Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

doi: 10.3791/52871 Published: April 21, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مقاومة فيروس مخاطي (MX) البروتينات تعد جزءا هاما من الدفاع المناعي الفطري ضد مسببات الأمراض الفيروسية. هذه البروتينات هي GTPases مثل dynamin الكبيرة التي يتم الناجمة عن النوع الأول والنوع الثالث إنترفيرون. المقابلة الجينات الإرسال المتعدد موجودة في جميع الفقاريات تقريبا في واحدة أو عدة نسخ والمنتجات الجينات، تمنع مجموعة واسعة من الفيروسات، بما في ذلك فيروسات مخاطية قويمة (على سبيل المثال، فيروس الأنفلونزا)، فيروسات ربدية (على سبيل المثال، فيروس التهاب الفم الحويصلي)، الفيروسات البنياوية (على سبيل المثال. ، LA فيروس اكروس) وRetroviridae (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1-4. ومن غير الواضح كيف تعترف هذه البروتينات مثل مجموعة واسعة من الفيروسات، من دون أي تسلسل الأساسي المشترك واضح الزخارف في هذه الفيروسات. تحليل تفاعل البروتينات الإرسال المتعدد مع أهدافها الفيروسية، ويحتمل أن تنطوي على المجمعات أجل أعلى مع العوامل الخلية المضيفة الأخرى، سوف تساعد على فهم الآليات الجزيئية روقد تطورت قبعة في سباق التسلح بين الفيروسات ومضيفيهم.

وقد تمت دراسة التفاعل بين البروتينات الإرسال المتعدد في الثدييات والأهداف الفيروسية الأكثر نطاق واسع لMXA البشري. MXA الإنسان يمكن أن تحول دون تكرار العديد من الفيروسات، بما في ذلك orthomyxoviruses الأنفلونزا وفيروس Thogoto. MXA يربط Thogoto المجمعات بروتين نووي ريبوزي فيروس (vRNPs)، وبالتالي منع دخولهم النووي، مما يؤدي إلى كتلة من العدوى 5. وقد تجلى هذا التفاعل بين MXA وThogoto vRNPs فيروس مع زملاء الترسيب وشارك في مناعي التجارب 6-9. كيف تعيق البروتينات الإرسال المتعدد فيروسات الأنفلونزا A غير أقل وضوحا. واحد المشكلة الرئيسية هي أنه ليس واضحة لإثبات وجود التفاعل بين البروتين الإرسال المتعدد ومنتج الجين الأنفلونزا. أظهر تقرير واحد تفاعل بين MXA البشري والبروتين NP في الأنفلونزا A خلايا الفيروس 10. يمكن أن يظهر هذا التفاعل إلا من خلال التعاون immunoprecipitation إذا كان قد تعامل الخلايا مع ربط عبر dithiobis كاشف (succinimidyl بروبيونات) قبل تحلل، مما يدل على أن التفاعل هو عابر و / أو ضعيف. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الفرق الإرسال المتعدد حساسية مختلفة سلالات الأنفلونزا A يتم تحديد من أصل البروتين NP 11،12. وتماشيا مع هذا، يمكن أن فيروسات الأنفلونزا A الهروب جزئيا من سيطرة الإرسال المتعدد التي تحور بقايا محددة في البروتين NP 13. وهذا يشير إلى أن الهدف الرئيسي من فيروسات الإنفلونزا A للمضيف MX هو البروتين NP، على الأرجح NP تجميعها في مجمعات vRNP. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الدراسات الأخيرة أظهرت وجود أكثر التفاعل بين NP الإنفلونزا أو vRNPs وإما MXA البشري أو الماوس MX1.

أظهرنا مؤخرا، لأول مرة، وهو التفاعل بين أنفلونزا NP والبروتين MX1 الماوس مع الأمثل بروتوكول التعاون مناعي 14، الذي يوصف هنا بالتفصيل. في العام، وشارك في طmmunoprecipitation هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية الأكثر استخداما للتحقيق تفاعلات البروتين البروتين. وغالبا ما يفضل هذه التقنية على تقنيات بديلة، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين، لأنه يسمح للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتين في بيئتها الطبيعية. يمكن أن يتم التعاون مناعي خارجا على البروتينات وأعرب التطور الطبيعي إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتينات ذات الاهتمام المتاحة. بدلا من ذلك، البروتينات من الفائدة يمكن التعبير في الخلية من خلال ترنسفكأيشن أو العدوى، ويمكن استخدامه علامة التقارب. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه، وبروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح للكشف عن ضعف و / أو عابرة تفاعلات البروتين. المكون الرئيسي في هذا البروتوكول الأمثل هو إضافة N-ethylmaleimide (NEM) في المخزن المؤقت تحلل الخلية. NEM هو كاشف مؤلكل أن يتفاعل مع مجموعات ثيول المجانية مثل موجودة في cysteines، في الرقم الهيدروجيني من 6،5-7،5، لتشكيل مستقر ثيو استر(الشكل 1). في ارتفاع درجة الحموضة، ويمكن NEM أيضا تتفاعل مع مجموعات الأمينية أو الخضوع التحلل 15. وعادة ما تستخدم NEM لمنع الجماعات ثيول الحرة، وذلك لمنع تشكيل ثاني كبريتيد السندات أو تمنع النشاط الأنزيمي. على سبيل المثال، غالبا ما يستخدم NEM لمنع desumoylating الإنزيمات، والتي هي البروتياز السيستين. في بروتوكول التعاون مناعي وصفها، أدرج NEM في البداية في المخزن المؤقت تحلل لقد ذكر أن sumoylation من البروتينات الإنفلونزا يمكن أن تؤثر في التفاعل بين البروتينات الفيروسية 16. بشكل غير متوقع، أثبتت إضافة NEM أن يكون المفتاح لتوثيق التفاعل بين NP الإنفلونزا، والماوس MX1 التي شارك في مناعي. ومن غير الواضح لماذا إضافة NEM أمر حاسم للكشف عن التفاعل NP-MX1. ربما التفاعل هو عابر جدا و / أو ضعيف. NEM يمكن تحقيق الاستقرار في التفاعل، على سبيل المثال، من خلال الحفاظ على التشكل محدد من MX1، وهو بروتين فيروسي أو حتى كومبو الثالث غير معروفnent. وقد لوحظ مثل هذا أثر في تحقيق الاستقرار من NEM من قبل، على سبيل المثال، للتفاعل بين اختزال الريبونوكليوتيد M1 وجيمسيتابين المانع لها (F2dC) 17. MX1 وNP كلا تحتوي على بقايا السيستين متعددة والتي يمكن تعديلها من قبل NEM. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أجرتها ريني آخرون أن stalkless MXA-البديل يحتوي على ثلاثة المذيبات بقايا السيستين يتعرض التي يمكن تعديلها من قبل iodoacetamide. تحور هذه المخلفات إلى serines لم يؤثر على النشاط الأنزيمي من MXA، ولكن منعت بوساطة ثاني كبريتيد التجميع 18. كما يتم حفظها هذه cysteines في MX1، وهذا يشير إلى أن cysteines مماثل في MX1 يمكن تعديلها من قبل NEM وعلى هذا النحو تأثير التشكل، أو الذوبان. وبالإضافة إلى ذلك، NEM قد تؤثر أيضا على النشاط GTPase من MX1، وهو أمر ضروري للنشاط مضاد للأنفلونزا من MX1، وبالتالي تحقيق الاستقرار في التفاعل بين MX1 وNP. ومع ذلك، فإن التأثير المباشر للNEM على تشغيل إشارات GTPasevity من MX1 غير المحتمل، كما هو مطلوب NEM أيضا للكشف عن التفاعل بين NP الإنفلونزا، وGTPase المسوخ غير نشطة من البروتين MX1 14. ومن الواضح أن هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف تأثير NEM على التفاعل NP-MX1.

وباختصار، فإن بروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين MX1 المضادة للفيروسات وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة أخرى التفاعلات الضعيفة أو عابرة التي تعتمد على استقرار التشكل البروتين محددة. وقد وصفت البروتين البروتين التفاعل التي تعتمد على التشكل محددة من قبل، على سبيل المثال، على البروتينات ملزم الكالسيوم مثل كالمودولين 19. وأخيرا، يمكن أن تستخدم أيضا دور الفعال لNEM في الطرق الأخرى التي تكشف عن تفاعلات البروتين البروتين، مثل فحوصات المشارك الترسيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: تم تأسيس بروتوكول ترنسفكأيشن وشارك في مناعي التالية لشكل طبق بتري 9 سم. صيغ أخرى ممكنة أيضا بعد توسيع نطاق البروتوكول.

1. البذر الكلى الجنينية البشرية (HEK) خلايا 293T

  1. البذور قبل ترنسفكأيشن عند 1.2 × 10 6 خلايا في 9 سم طبق بتري في 12 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، 2 مم L-الجلوتامين، 0.4 ملي نا-البيروفات الخلايا HEK293T يوم واحد، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 100 U / البنسلين مل و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين.
  2. تنمو الخلايا 16 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
  3. بصريا تفتيش على التشكل وقابلية الخلايا مع مجهر الضوء المعكوس قبل ترنسفكأيشن. الخلايا تحتاج إلى أن تكون متكدسة الفرعية لأفضل كفاءة ترنسفكأيشن.

2. الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من خلايا HEK293T

ملاحظة: استخدام 0.5-1 ميكروغرام من pCAXL-NP أو فارغة بلازميد pCAXL في تركيبة مع 1-3 ميكروغرام من pCAXL-MX1 في 9 سم الطبق. استخدام مبلغ مساو من إجمالي DNA البلازميد في جميع العينات. ضبط مع البلازميد فارغة إذا لزم الأمر.

  1. إعداد مخازن ترنسفكأيشن التالية:
    1. إعداد تريس، EDTA (TE) مع تركيزات 1.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 و 0.1 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0.
    2. إعداد BS / HEPES مع تركيزات 25 ملي HEPES (5.96 غرام / L، 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، 274 مم كلوريد الصوديوم (16 ز / L)، 10 ملي بوكل (0.74 جم / L)، 1.5 ملي NaHPO 4 · 12H 2 O (0.5 غرام / L) و 11.1 مم سكر العنب (2 ز / L). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05.
    3. إعداد CaCl 2 / HEPES مع تركيزات 1.25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183.8 جم / L) و 125 ملي HEPES (29.79 جم / لتر). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05 مع هيدروكسيد الصوديوم.
  2. تدفئة مخازن ترنسفكأيشن في 37 ° C قبل الاستخدام.
  3. إعداد العينات البلازميد التي كتبها تمييع DNA البلازميد في 600 ميكرولتر من TE.إعداد هذه الخلائط في الآبار من لوحة 6 جيدا.
  4. إضافة 150 ميكرولتر من CaCl 2 / HEPES بطريقة حكيمة قطرة للعينات البلازميد ومزيج من قبل pipetting 3 مرات صعودا وهبوطا.
  5. إعداد الحل ترنسفكأيشن قطرة مضيفا الحكمة الحل البلازميد (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES، 750 ميكرولتر) إلى 750 ميكرولتر من العازلة BS / HEPES المنصوص عليها في لوحة 6 جيدا جديدة. توزيع الحل البلازميد بالتساوي على كامل تحتوي كذلك BS / HEPES العازلة.
  6. يهز الحل ترنسفكأيشن على لوحة شاكر لمدة 90 ثانية في 1،000 دورة في الدقيقة.
  7. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة محلول ترنسفكأيشن (1.5 مل) قطرة من الحكمة أن الخلايا. استخدام ممص مكروي P1000 بالتنقيط الحل ترنسفكأيشن على الخلايا. تفريق الخليط على كامل 9 سم طبق بتري ويهز لوحة بلطف شديد.
  9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة. ثم إزالة المتوسطة التي كتبها طموح واستبدال واي فوراعشر 12 مل الطازجة والمتوسطة قبل تحسنت. بلطف إضافة متوسطة جديدة للخلايا لمنع انفصال الخلية. لهذا، وعقد غيض من الماصة ضد الجانب من البئر وبلطف طرد المتوسط.
  10. احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.

3. المشارك مناعي

ملاحظة: إجراء شارك في مناعي 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

  1. إعداد منخفض العازلة تحلل الملح والملح العالية غسل العازلة.
    1. إعداد محلول المخزون من 2 M N-ethylmaleimide (NEM) عن طريق وزن كمية NEM وحلها في الايثانول المطلق. إعداد الأسهم حل NEM الطازجة قبل استخدامها.
      تنبيه: NEM سامة جدا، وإعداد واستخدام هذا الحل الأسهم في غطاء الدخان.
    2. إعداد منخفض الملح العازلة تحلل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 1٪ NP40 وكوكتيل مثبط البروتياز (حل الجدول 1ر في 50 مل العازلة تحلل). إضافة NEM إلى تركيز النهائي من 25 ملم (أي تمييع 1:80). الحفاظ على الجليد بعد إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM.
      ملاحظة: دائما إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM الطازجة قبل استخدامها.
    3. إعداد الملح العالية العازلة يغسل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 500 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA و 1٪ NP40. لاحظ أن غسل العازلة الملح العالية لا يحتوي NEM.
  2. إعداد لست] الخلية.
    1. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS). إضافة بلطف جدا غسل العازلة، وخلايا HEK293T تنفصل بسهولة.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 600 ميكرولتر من الجليد الباردة منخفض العازلة تحلل الملح في 9 سم طبق بتري.
    3. احتضان لوحات لمدة 20 دقيقة على الجليد. تأكد من أن لوحات يتم الاحتفاظ الأفقي، لضمان تغطية كاملة لسطح اللوحة مع تحلل العازلة. يهز بلطف لوحات كل 5 دقائق.
    4. جمع المحللة خلية في microcentrifuge 1.5 ملأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و 16،000 x ج لتكوير جزء غير قابلة للذوبان.
    5. نقل جزء القابلة للذوبان، أي المحللة خلية إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والحفاظ على الجليد. تواصل مباشرة مع بروتوكول التعاون مناعي، لمنع تفكك البروتينات التفاعل. تنفيذ كافة الخطوات التالية قدر الإمكان على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحد من نشاط بروتين في لست].
  3. جيل من المركبات المناعية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، البروتين من الفائدة لا بد من الأجسام المضادة المناسبة. لدراسة التفاعل NP-MX1، واستخدام الماوس لمكافحة NP وحيدة النسيلة الأجسام المضادة.
    1. لكل عينة، مزيج 135 ميكرولتر من المحللة مع 2 ميكرولتر من مكافحة NP الأجسام المضادة وحيدة النسيلة و 113 ميكرولتر من تحلل العازلة منخفضة الملح (إجمالي حجم 250 ميكرولتر). تخزين المحللة المتبقية في -20 ° C لمزيد من التحليل مثل النشاف الغربي، لتوثيق مستويات التعبير من INTERA مظنونشركاء ction في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وقياس تركيز البروتين من المحللة (على سبيل المثال مع برادفورد كاشف) واستخدام كمية ثابتة من البروتين الكلي، على سبيل المثال، 400 ميكروغرام لكل المحللة.
    2. احتضان مزيج الأجسام المضادة المحللة لمدة 3 ساعة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. ويمكن تمديد هذه الخطوة إلى الحضانة بين عشية وضحاها.
  4. إعداد البروتين الخرز G.
    ملاحظة: يتم شحنها والخرز البروتين G وتخزينها في 20٪ من الإيثانول لحفظ. للالطين حبة يتكون عادة من 50٪ الخرز وتحتاج إلى أن تغسل هذه الخرز قبل أن يتم استخدامها لimmunoprecipitate المركبات المناعية.
    1. استخدام 50 ميكرولتر من الخرز، أي 100 ميكرولتر من حبة الطين، لكل عينة. تغسل كمية من الخرز اللازمة لجميع العينات في مقايسة شارك في مناعي في أنبوب واحد. قطع غيض من طرف ماصة 1 مل لتخفيف pipetting لمن حبة الطين.
    2. أجهزة الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 Xز و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. إزالة حل الإيثانول وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح. الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وإزالة طاف بلطف. كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات.
      ملاحظة: منخفض العازلة تحلل الملح تستخدم لغسل حبات ليست في حاجة لاحتواء مثبطات الأنزيم البروتيني أو NEM.
    3. تقدير حجم البروتين الخرز G وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح لجعل الجديد 50٪ حبة الطين في انخفاض العازلة تحلل الملح.
    4. لكل عينة، ونقل 100 ميكرولتر من حبة الطين في الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. كن حذرا لresuspend وحبة الطين قبل تقسيم، وهذه الخرز الرواسب بسرعة إلى أسفل الأنبوب.
  5. مناعي من المركبات المناعية عن طريق بروتين G الخرز وشطف بهم.
    1. قبل استخدام بروتين G الخرز لمناعي، الطرد المركزي كل 30 ثانية في أنابيب 8،000 x ج و 4 ° C وتحقق عن طريق التفتيش البصري أن هناك مبلغ مساو من الخرز موجودة في جميع العينات. إذا لزم الأمر ضبط كمية من الخرز في بعض من العينات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات.
    2. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على المركبات المناعية (أي.، لست] مع الأجسام المضادة، 250 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C لجمع العينة كاملة في الجزء السفلي من الأنبوب. نقل المركبات المناعية للبروتين G الخرز (50 ميكرولتر).
    3. احتضان 60 دقيقة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. لا احتضان هذه المركبات المناعية أطول من 75 دقيقة مع حبات للحد ملزمة انوعي من البروتينات للبروتين G الخرز.
    4. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G (مع المربوطة المركبات المناعية) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وإزالة supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات. اختياري: تخزين هذه supernatants في 4 درجات مئوية أو -20 ° C لتحليلها لاحقا،على سبيل المثال، لتقدير كمية البروتين غير منضم.
    5. غسل بروتين G الخرز لحوالي 5 دقائق مع 900 ميكرولتر من الملح العالية العازلة تحلل. تأكد من أن الخرز ومعلق تماما في غسل العازلة لغسل الأمثل. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وتجاهل supernatants. كرر هذه الخطوة غسل 4 مرات. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز بروتين G مكعبات لتجنب فقدان المواد immunoprecipitated.
    6. بعد الخطوة غسل الماضي، إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة إلى الخرز وتسخين تعليق لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى أزل (المشترك) البروتينات immunoprecipitated.
      1. إعداد 10 مل من العازلة 6X Laemmli مع 1 غرام من دوديسيل كبريتات الصوديوم، 3.5 مل من الجلسرين، و 3.5 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 420 ميكرولتر من β المركابتويثانول. التكيف مع إجمالي حجم 10 مل بإضافة الماء المقطر. تمييع 3 مرات في الماء المقطر للحصول عازلة 2X Laemmli.
        تنبيه: &# 946؛ -mercaptoethanol غير سامة، وإعداد واستخدام عازلة Laemmli في غطاء الدخان.
    7. وبعد التسخين، أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج وتخزين العينات في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو -20 ° C (على المدى الطويل).

4. تحليل (المشارك) Immunoprecipitated البروتينات

  1. تصور البروتينات الموجودة في الخلايا المحللة وشطافة من شارك في مناعي من قبل SDS-PAGE 20 و غرب النشاف 21،22. تحميل عادة نصف شطافة Laemmli على هلام. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز مكعبات G البروتين عند أخذ عينات للهلام التحميل. تم الكشف عن MX1 وNP التعبير مع مضاد للMX1 ومكافحة NP الأجسام المضادة، على التوالي 14. تم الكشف عن العصابات مع لمعان كيميائي على أساس HRP ومطور فيلم الأشعة السينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

N-ethylmaleimide هو مركب عضوي التي يمكن استخدامها لتعديل بشكل لا رجعة فيه جماعات ثيول الحرة، على سبيل المثال لمنع البروتياز السيستين (الشكل 1).

بروتين مضاد للفيروسات الأنفلونزا A MX1 يمنع تكاثر الفيروس من خلال التفاعل مع البروتين النووي الفيروسي. والأمثل بروتوكول التعاون مناعي الموصوفة هنا يسمح لدراسة هذا التفاعل NP-MX1. و transfected الخلايا HEK293T مع ناقلات التعبير عن البروتين MX1 المضادة للفيروسات في غياب أو وجود أنفلونزا البروتين NP. وبعد ذلك، كان البروتين NP سحبت إلى أسفل من إجمالي لست] الخلية مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة NP-محددة الشكل 2 يوضح أن البروتين MX1 هو فقط في وجود-أعرب المشارك NP-immunoprecipitated شارك. هو سبب محتمل غير محدد شارك في مناعي من MX1 في غياب NP إما عن طريق غير محدد المنسدلة من البروتين MX1 من قبل الأجسام المضادة لمكافحة NP أو عن طريق ملزمة لانوعي من MX1 لبروتين G الخرز. ولذلك، تشمل دائما السيطرة السلبية لتقييم هذا غير محدد شارك في مناعي الشكل 3 يدل على أن التفاعل NP-MX1 لا يمكن إلا أن يتم الكشف في وجود NEM. في هذه التجربة، تم تقييم ملزمة انوعي من MX1 للبروتين G الخرز مع رد فعل مناعي السيطرة المشارك في غياب مكافحة NP الأجسام المضادة.

ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم لدراسة التفاعل بين MX1 والأنفلونزا من البروتين NP معزولة عن الخلايا المصابة أو من virions. لهذا التطبيق، وكان البروتوكول المذكور أعلاه تكييفها بشكل طفيف من خلال الجمع بين لست] من MX1 معربا عن الخلايا مع لست] التي تحتوي على البروتين NP الفيروسي قبل البدء في بروتوكول التعاون مناعي الشكل 4 يوضح شارك في مناعي من MX1 مع NP معزولة عن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، الخلايا المصابة أو virions.

في الختام، تشير هذه النتائج إلى أن هذا التعاون مناعي بروتocol يمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين البروتين المضاد للفيروسات وهدفه الفيروسي.

الشكل (1)
الشكل 1: تعديل لا رجعة فيه الجماعات ثيول حرة بحلول N-ethylmaleimide الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: يتفاعل مع MX1 NP تحليل لطخة غربية من تجربة التعاون مناعي مع عينتين: واحدة في كل من الذي MX1 وNP موجودة واحد الإعداد الخاضعة لسيطرتها التي البروتين NP غائب. تم immunoprecipitated NP مع مكافحة NP وNP وMX1 وتصور من قبل النشاف الغربي. تم تعديل هذا الرقم وROM 14.

الشكل (3)
الشكل 3: N-ethylmaleimide مهم للكشف عن NP - التفاعل MX1 تحليل لطخة غربية من تجربة التعاون مناعي يؤديها في وجود أو عدم وجود N-ethylmaleimide. تم immunoprecipitated NP مع مكافحة NP وMX1 وNP تم تصور من قبل النشاف الغربي.

الشكل (4)
الرقم 4: MX1 يتفاعل مع NP معزولة عن الخلايا المصابة أو من virions لست] تحتوي على MX1 كانت مجتمعة مع لست] التي تحتوي على NP من مصادر مختلفة: المحللة التحكم (لا vRNPs)، transfected vRNPs، vRNPs من الخلايا المصابة أو vRNPs معزولة عن الأنفلونزا A virions . بعد خلط لست]، وشارك في immunopreتم إجراء بالترسيب مع مكافحة NP وكانت تصور MX1 وNP بواسطة النشاف الغربي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

دراسة التفاعل بين البروتينات المضادة للفيروسات وأهدافها الفيروسية مهم جدا لفهم تفاصيل آلية المضادة للفيروسات من هذه البروتينات. هذا يمكن أن تعطي رؤى جديدة في كيفية الفيروسات ومضيفيهم شارك تطورت وتكون أساسا لوضع استراتيجيات المضادة للفيروسات جديدة. والأمثل بروتوكول التعاون مناعي الموصوفة هنا يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين الماوس MX1 وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. الجانب الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو إضافة NEM في المخزن المؤقت تحلل، والتفاعل NP-MX1 غير قابل للكشف في غياب NEM (الشكل 3). حتى الآن، لا يعرف هو السبب في وجود NEM ضروري للكشف عن هذا التفاعل. ومع ذلك، يمكن هذا البروتوكول يكون من المفيد دراسة أخرى التفاعلات الضعيفة و / أو عابرة التي تعتمد على استقرار التشكل البروتين محددة، لا سيما إذا وتشارك cysteines.

لالحد هاما من المقايسات المشترك مناعي بشكل عام هو توافر الأجسام المضادة محددة وعالية الجودة التي تعترف الحواتم بتكوين في واحدة من شركاء التفاعل مع تقارب عالية. لا يمكن أظهرت التفاعل NP-MX1 مع شركائنا في منزل إنتاج مصل بولكلونل مكافحة MX1. هذا مصل الإنفلونزا أيضا immunoprecipitates البروتين NP، حتى في غياب MX1. وعلاوة على ذلك، فإن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للNP الذي تم استخدامه، يعترف البروتين NP من A / بورتوريكو / 8/34 سلالة الإنفلونزا، ولكن لسوء الحظ أنها ليست مناسبة لسحب إلى أسفل NP من سلالات فيروس انفلونزا الطيور. الحد آخر من هذا البروتوكول المشترك مناعي هو الربط انوعي من MX1 للبروتين G الخرز. هذه الأخيرة ملزمة ويمكن التغلب على ذلك بزيادة تركيز الملح في غسل العازلة وتقليل وقت الاتصال بين المحللة للبروتين والخرز G. وبالإضافة إلى ذلك، وتقليل كمية من الخرز المستخدمة لكل مناعيرد فعل من 50 إلى 25 ميكرولتر ميكرولتر، يمكن أن يزيد من انخفاض غير محدد ملزم من MX1 لهذه الخرز. وبصفة عامة، غير مقصود المنسدلة من البروتينات تلويث، والناجمة عن انوعي ملزمة للبروتين G الخرز، ويمكن أيضا أن تخفض من الاستراتيجيات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن إزالة هذه البروتينات خلال خطوة قبل واضحة، حيث تتم إزالة هذه البروتينات التي يحتضنها المحللة مع بروتين G حبات في غياب الأجسام المضادة. ثم تتم إزالة البروتينات تلويث جنبا إلى جنب مع الخرز ويتم استخدام المحللة تطهيرها قبل للمشاركة في مناعي. هذه الاستراتيجية هو مفيد فقط إذا البروتينات تلويث مختلفة من البروتين (ق) قيد الدراسة. بدلا من ذلك، مواقع الربط غير محددة على البروتين يمكن أن يكون قد تم حظره الخرز G مع BSA. ومع ذلك، يوصى هذه الاستراتيجية إلا إذا والمغلفة حبات أولا مع الأجسام المضادة، كما BSA يمكن أيضا أن يقلل من ترسب-المركبات المناعية (أي انخفاض الأجسام المضادة ملزمة من قبل الخرز المغلفة). مأخوذمعا، فمن المهم جدا أن تشمل ضوابط سليمة لاستبعاد ملزمة انوعي من البروتينات التي تهم بروتين G الخرز أو إلى الأجسام المضادة المستخدمة.

بروتوكول التعاون مناعي وصف يمكن تعديلها لدراسة التفاعل من MX1 مع البروتين NP موجودة في بيئة مختلفة، على سبيل المثال، في الخلايا المصابة أو في vRNPs المنقى. MX1 يحول دون التعبير عن البروتينات الفيروسية، بما في ذلك NP، خلال العدوى بفيروس إنفلونزا 23. ولذلك، فمن الصعب للغاية من الناحية الفنية لدراسة التفاعل NP-MX1 في الخلايا MX1 transfected التي تقوم إصابة في وقت لاحق. ومع ذلك، يمكن أيضا أن هذا البروتوكول المشترك مناعي أن يؤديها بعد الجمع لست] من MX1 معربا عن الخلايا والخلايا المصابة، مما يتيح الكشف الناجح للتفاعل NP-MX1 (الشكل 4). وبما أن الهدف الحاسم للNEM غير معروف، وأضيف NEM خلال تحلل كل السكان الخلية. إذا رغبت في ذلك، ودرجة الحموضة منيمكن تغيير تحلل العازلة. يتم تنفيذ التجارب وصفها هنا في الرقم الهيدروجيني 8 (كما في توران وآخرون. 10)، ولكن كان أيضا أداء وNP-MX1 شارك في مناعي بنجاح مع تحلل العازلة درجة الحموضة 7.2. في الواقع ويفضل الرقم الهيدروجيني من 7.2، لأنه في هذه الحموضة NEM يتفاعل بشكل حصري مع مجموعات ثيول حرة وأيضا يزيد من هذا الرقم الهيدروجيني العائد استخراج البروتين MX1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الاستعاضة عن بروتين G حبات من البروتين والخرز، اعتمادا على الأنواع المضيفة التي تستمد الأجسام المضادة المستخدمة. ومع ذلك، يتم الحصول على نتائج الأنظف مع حبات بروتين G. وأخيرا، يمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم لدراسة التفاعل بين MX1 والبروتينات الأنفلونزا الأخرى، على سبيل المثال، PB2 14. في هذه الحالة الموسومة حاتمة V5 تم استخدام PB2، والتي يمكن من حيث المبدأ أن يقترن مع anti-V5 متاحة تجاريا الاغاروز هلام التقارب.

في تجارب مستقبلية، يمكن هذا البروتوكول أن تكون ذات قيمة لتحديد المناطق في MX1 وNP التي تعتبر مهمة للتفاعل NP-MX1. واحد هذه المنطقة في MX1 يمكن أن تكون حلقة L4، كما لم تظهر هذه الحلقة أن تكون حاسمة للتفاعل بين MXA وفيروس Thogoto NP 8،9. إذا أصبحت الأجسام المضادة NP-محددة مناسبة متاحة، وسوف يسمح هذا البروتوكول أيضا لتحديد ما إذا كانت حساسية متزايدة من سلالات انفلونزا الطيور وللMX1 يرتبط مع تفاعل NP-MX1 أقوى أم لا، والتي يمكن أن تساعد على فهم آلية حساسية MX. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التفاعل بين MX1 ومكونات الفيروسات ينتمون إلى عائلات أخرى من فيروسات مخاطية قويمة، ويمكن أيضا أن تعالج من قبل هذا البروتوكول المشترك مناعي تكييفها. وأخيرا، إجراء المزيد من الدراسات لكشف تأثير NEM على NP-MX1 ستكون قيمة للغاية لفهم أفضل لهذا التفاعل محددة، ولكن أيضا لاكتساب المعرفة في تطبيقات أوسع من إضافة هذا المركب خلال تحلل الخلية وشارك في مناعي التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل FWO-فلاندر، ومشروع الاحتلال IOF10 / StarTT / 027 وجامعة غنت الخاصة بحوث غرانت BOF12 / GOA / 014.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM high glucose Gibco 52100-047
N-Ethylmaleimide Sigma E-3876 Toxic
Igepal CA-630 Sigma I-30212 also known as NP40
Protease inhibitor cocktail Roche 11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository NR-4282 ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository NR-3133 directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF GE Healthcare 17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm GE Healthcare 28-9068-36
ECL western blotting substrate Pierce 32106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77, (4), 551-566 (2013).
  2. Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502, (7472), 559-562 (2013).
  3. Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502, (7472), 563-566 (2013).
  4. Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14, (4), 398-410 (2013).
  5. Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (5), 2082-2086 (1999).
  6. Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463, (1-2), 24-28 (1999).
  7. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, (7), 4370-4376 (1999).
  8. Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12, (4), 598-604 (2012).
  9. Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289, (9), 6020-6027 (2014).
  10. Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32, (2), 643-652 (2004).
  11. Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82, (7), 3624-3631 (2008).
  12. Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85, (16), 8133-8140 (2011).
  13. Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9, (3), e1003279 (2013).
  14. Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86, (24), 13445-13455 (2012).
  15. Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18, (2), 248-255 (1967).
  16. Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85, (13), 6618-6628 (2011).
  17. Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413, (2), 383-388 (2011).
  18. Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22, (10), 1433-1445 (2014).
  19. Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405, (2), 199-221 (2007).
  20. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  21. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  23. Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66, (4), 2564-2569 (1992).
شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J. Vis. Exp. (98), e52871, doi:10.3791/52871 (2015).More

Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J. Vis. Exp. (98), e52871, doi:10.3791/52871 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter