إنشاء ذات الصلة سريريا Published: June 5, 2015 doi: 10.3791/52886

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janice L. Walker¹, Brigid M. Bleaken¹, Iris M. Wolff¹, A. Sue Menko¹

¹Pathology, Anatomy and Cell Biology, Thomas Jefferson University

Introduction

و، جراحة الساد وهمية ذات الصلة سريريا، وقد وضعت خارج الحي الظهارية نموذج التئام الجروح الموصوفة هنا إلى توفير أداة للتحقيق في الآليات التي تنظم إصلاح الأنسجة الظهارية في استجابة لإصابة. السمات الرئيسية التي كانت تهدف لفي خلق هذا النموذج وشملت 1) توفير الظروف التي تتكرر بشكل وثيق الاستجابة في الجسم الحي لاصابة في إعداد ثقافة، 2) سهولة تحوير العناصر التنظيمية للإصلاح، و3) القدرة على صورة عملية الإصلاح، في مجملها، في الوقت الحقيقي. التحدي، لذلك، كان لخلق نموذج الثقافة التي كان من الممكن للدراسة، والتلاعب، وإصلاح الجرح الظهارية في المكروية في الخلايا الأم. توافر هذا النموذج الجرح إصلاح يفتح إمكانيات جديدة لتحديد العظة الإشارات الداخلية من مصفوفة البروتينات، السيتوكينات وكيموكينات التي تنظم عملية الإصلاح. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج مثالي لدراسة كيف يمكن لن ظهارة قادرة على التحرك في ورقة جماعية لإعادة يغطي بالنسيج الظهاري-منطقة الجرح ^2،3، وتحديد نسب الخلايا زعيم الوسيطة على حافة الجرح التي تعمل في توجيه الهجرة الجماعية للظهارة أصيب ^4. يوفر هذا النموذج أيضا منبرا التي لتحديد العلاجات التي يمكن أن تعزز فعالية التئام الجروح ومنع ترميم الجروح الشاذة ^5.

وهناك بالفعل عدد من النماذج المتاحة الجرح إصلاح، سواء في الثقافة والحية، التي وفرت معظم ما هو معروف عن عملية ترميم الجروح اليوم. في نماذج إصابة الحيوانية، مثل القرنية ^{6-12 و13-17} الجلد، وهناك فرصة لدراسة استجابة الأنسجة لاصابة في سياق جميع الوسطاء الإصلاح التي يمكن أن تشارك في هذه العملية، بما في ذلك المساهمات من الأوعية الدموية والجهاز العصبي. ومع ذلك، هناك قيود على التلاعب من experiالظروف النفسية في الجسم الحي، وأنه ليس من الممكن بعد إجراء دراسات التصوير الاستجابة إصلاح في الجسم الحي، بشكل مستمر مع مرور الوقت. في المقابل، فإن معظم نماذج الثقافة في المختبر الجرح إصلاح، مثل الجرح الصفر، ويمكن التلاعب بها بسهولة، وتابعت مع مرور الوقت ولكنها تفتقر إلى الإطار البيئي دراسة التئام الجروح في الأنسجة في الجسم الحي. في حين أن النماذج خارج الجسم الحي توفر ميزة دراسة عملية إصلاح الضرر بشكل مستمر مع مرور الزمن في سياق المكروية في الخلايا إلى جانب القدرة على تعديل المنظمين الجزيئية للإصلاح في أي نقطة زمنية في هذه العملية، وهناك عدد قليل من النماذج التي تناسب هذه المعلمات.

هنا يتم وصف هذا الإجراء لتوليد تكرار للغاية خارج الحي الظهارية التئام الجروح الثقافات التي تتكاثر ردا على الأنسجة الظهارية لوجرح الفسيولوجية. باستخدام عدسة الفرخ الجنين كمصدر الأنسجة، وبحكم فيفو وزارة التجارةيتم إجراء جراحة الساد ك. العدسة هي الأنسجة مثالية لاستخدامها في هذه الدراسات أنه على مسافة سميكة كبسولة الغشاء القاعدي مكتفية ذاتيا، اوعائي، وليس معصب، وخالية من أي سدى المرتبطة ^18،19. في الأمراض التي تصيب البشر، وتتناول جراحة الساد فقدان البصر بسبب عتامة العدسة، وينطوي على إزالة كتلة الخلية الألياف العدسة، التي تضم الجزء الأكبر من العدسة. يتم استعادة التالية الساد رؤية عملية جراحية خلال إدخال عدسة داخل العين الاصطناعية. إجراء جراحة الساد، من خلال إزالة الخلايا الألياف، يحرض استجابة إصابة في الظهارة عدسة المجاورة، التي تستجيب عن طريق إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري للمنطقة الخلفية للكبسولة العدسة التي كانت محتلة من قبل خلايا الألياف. في جراحة الساد، كما هو الحال في معظم الردود ترميم الجروح، ويحدث هناك في بعض الأحيان نتيجة تليفي الشاذة للاستجابة التئام الجروح، ويرتبط مع ظهور myofibroblasts، والتي في عدسة يعرف الخلفي Capsuلو عتامة ^20-22. لتوليد جراحة الساد نموذج التئام الجروح، وتحاكي إجراء جراحة الساد في العدسات إزالتها من عين الفرخ الجنين لإنتاج إصابة الفسيولوجية. إزالة المجهرية من ألياف العدسة خلايا النتائج في منطقة الجرح دائري متسقة للغاية تحيط بها الخلايا الظهارية عدسة. لا تزال تعلق هذه الفئة من السكان خلية بحزم عدسة الطابق السفلي كبسولة غشاء وأصيبوا من جراء العملية الجراحية. الخلايا الظهارية تهاجر إلى منطقة الجرداء من الغشاء القاعدي الذاتية للشفاء الجرح، بقيادة عدد سكانها خلايا vimentin الغنية الوسيطة المعروفة في عملية الإصلاح كخلايا الزعيم ^1. مع هذا النموذج استجابة لظهارة للإصابة يمكن تصور بسهولة وجاءت مع الوقت في سياق المكروية الخلايا. الخلايا يمكن الوصول إليها بسهولة لإدخال تعديلات على التعبير أو تفعيل جزيئات المتوقع أن تلعب دورا في ترميم الجروح. وهناك ميزة قوية من الهو النموذج هو القدرة على عزل ودراسة التغيرات الهجرة محددة في إطار التئام الجروح. القدرة على إعداد عدد كبير من الذين تتراوح أعمارهم بين خارج الجسم الحي التئام الجروح الثقافات مطابقة للدراسات هو ميزة أخرى لهذا النموذج. وبالتالي، فإن هذا النظام النموذجي فرصة فريدة لندف بصرف النظر آليات إصلاح الجرح والعلاجات اختبار تأثيرها على عملية التئام الجروح. ومن المتوقع أن يكون تطبيق واسع نموذج جراحة الساد وهمية خارج الحي، وتوفير الموارد الحرجة لدراسة آليات إصلاح الضرر.

Protocol

بروتوكول التالية يتوافق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام جامعة توماس جيفرسون ومع بيان ARVO لاستخدام الحيوانات في البحوث الرؤية.

1. إعداد والتحضير للعدسات للثقافة فيفو السابقين الجرح

1. وضع ثلاث 100 أطباق بتري ملم في العقيمة، غطاء تدفق الصفحي. ملء اثنين من أطباق بتري في منتصف الطريق مع العازلة تريس / سكر العنب (العازلة TD، 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 0.7 ملي نا ₂ PO _4، 5 ملي مد الجلوكوز، 8.25 ملي تريس قاعدة، ودرجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك) في RT ، وترك فارغا الثالث. وسائل الإعلام ثقافة ما قبل الدافئ (وسائل الإعلام تستكمل مع 199، 1٪ L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) إلى 37 ^{درجة مئوية.}
   ملاحظة: الجرح معيار الشفاء سائل الإعلام والثقافة وخالية من الدم، كما يحدث في الجسم الحي. ومع ذلك، يمكن أن تنمو الثقافات الجرح إصلاح بنجاح في ظروف محددة وسائل الاعلام التي تشمل المصل أو عوامل أخرى.
2. إزالة د الجنينية خصبةعبد المنعم يوسف 15 أبيض ليفورنو البيض فرخ من الحاضنة (التي عقدت في 37.7 درجة مئوية مع هزاز لطيف)
3. وضع البيض المحدد في غطاء تدفق الصفحي وخارج نظيف من قذيفة مع الايثانول 70٪ من زجاجة غسل. إجراء كافة الإجراءات أدناه تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي، وذلك باستخدام الحلول والأدوات المعقمة.
4. الكراك البيض ومكان المحتويات في فارغة 100 مم طبق بتري. قطع رأس الجنين باستخدام ملقط القياسية ومقص غرامة. وضع رئيس أجنة الدجاج في طبق بتري تحتوي العازلة TD والتخلص السليم من ما تبقى من الجنين. اختياريا حفاظ على رؤساء الفرخ الجنين في المخزن TD لفترة قصيرة من الزمن، لم يعد من 15 دقيقة.
5. وضع رئيس الفرخ الجنين على غطاء طبق بتري. باستخدام ملقط عالية الدقة، وإزالة العدسة المرفقة مع النكتة لها الزجاجي من العين في التسلسل التالي. قرصة الجزء الخلفي من العين مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة في الجزء الخلفي من العين.
6. ثم، فهم النكتة الزجاجي ثإيث ملقط والساحبة بلطف على الجسم الزجاجي مع تحريك المتداول، سيتم طردهم الزجاجي مع عدسة المرفقة من العين. مكان عدسة / زجاجي في ما تبقى من طبق بتري تحتوي العازلة TD. السماح للعدسات أن تبقى في المخزن TD مدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
7. تحريك العدسة لجديد غطاء طبق بتري تحت المجهر تشريح. من هذه النقطة على تنفيذ جميع الخطوات تحت المجهر تشريح. مع ملقط عالية الدقة فرشاة بعناية بعيدا أي الجسم الهدبي (الخلايا الصباغية) التي تم فكها مع العدسة باستخدام حافة ملقط، مع الحذر على عدم الإضرار الأنسجة العدسة.
   ملاحظة: إزالة الجسم الهدبي تضمن أنواع الخلايا التي ليست الذاتية للعدسة ليست مدرجة في الثقافة إصلاح الجرح.
8. فصل العدسة من النكتة الزجاجي مع ملقط عالية الدقة عن طريق معسر قبالة الجسم الزجاجي من ارتباطه مع كبسولة عدسة الخلفي.
9. باستخدام عالية الدقة ملقط نقل العدسة إلى قطرة صغيرةمن TD العازلة (حوالي 200 ميكرولتر) في صحن زراعة الأنسجة 35MM.

2. إجراء جراحة الساد موك

1. توجيه عدسة في قطرة من العازلة TD في 35 ملم الطبق مع الجانب الأمامي للعدسة مواجهة.
   ملاحظة: يتم تحديد الأمامي للعدسة بسهولة من خلال وجود حلقة كثيفة في الأنسجة التي تحيط الحدود بين الأمامية والمنطقة الاستوائية من ظهارة العدسة. في المقابل، هناك غياب علامات على الخلفي من كبسولة العدسة التي ترد خلايا ألياف العدسة.
2. باستخدام اثنين من ملقط عالية الدقة تجعل شق صغير (حوالي 850μm) في وسط الكبسولة الأمامية عدسة، والغشاء القاعدي الكثيف الذي يحيط نسيج العدسة، وما يرتبط بها من ظهارة العدسة الأمامي لها، من خلال استيعاب الأنسجة مع واحد ملقط في كل جهة، و التجاذبات بلطف في اتجاهات متعارضة.
3. إزالة كتلة الخلية الألياف، والتي تشكل الجزء الأكبر من النسيج العدسة، dislodجينج أنه من مرفقاتها إلى ظهارة العدسة والمحيطة عدسة الكبسولة التي كتبها المائية شطف (النهج المستخدمة في جراحة الساد الكلاسيكية، على غرار في الشكل 1A).
4. ملء حقنة 1 مل مع طرف إبرة 27.5 G مع 300 ميكرولتر من العازلة TD. إدراج رأس الإبرة في شق المحرز في عدسة الكبسولة الأمامية، وحوالي منتصف الطريق إلى العدسة.
5. خفض بلطف حقنة حقن عازلة TD في كتلة الخلايا الألياف العدسة. ضخ ما بين 50 و 200 TD ميكرولتر، وأبدا أكثر من 300 ميكرولتر. مراقبة الكتلة الخلوية الألياف تخفيف نفسها من الظهارة وعدسة الكبسولة.
6. باستخدام ملقط عالية الدقة، وإزالة خففت كتلة الخلايا الألياف من العدسة من خلال موقع شق الأمامي.
   ملاحظة: يترك هذا الإجراء العدسة الخلفي كبسولة الغشاء القاعدي الذي خلايا الألياف قد تعلق المعراة من الخلايا، وظهارة العدسة بجروح فقط المجاورة لهذا الموقع.

3. Preparinز العدسة الجرحى لفيفو السابقين الثقافة

1. تسطيح حقيبة المحفظة العدسة التي تنتج من جراحة الساد المذكورة أعلاه على طبق ثقافة، جنبا خلية يصل، بجعل خمسة تخفيضات في الجانب الأمامي من الحقيبة المحفظة.
2. قطع عمودي على موقع شق الأصلي وصولا إلى خط الاستواء من العدسة. تسطيح الناتجة خمسة "اللوحات" من عدسة كبسولة مع ظهارة تعلق على الجانب ثقافة طبق كبسولة أسفل، الجانب الخلية يصل. لاحظ عدسة الجرحى خارج الحي الآن يجب أن تأخذ على نجمة أو شكل flowerlike (انظر الشكل 1B).
3. لتأمين الكبسولة إلى الطبق، اضغط برفق إلى أسفل مع ملقط في كل نقطة من النجم. وهذا سيجعل المسافة البادئة صغيرة في النصائح الخمس الأكثر الخارجية للالنباتى ويؤدي إلى التعلق المستدام إلى الطبق.
   ملاحظة: من الممكن أن يدمر الكبسولة أثناء هذا الإجراء، ولذا فمن المهم تأمين الكبسولة إلى الطبق أقرب إلى نصائح من فلوريداملاحظة وقت ممكن، وكذلك لجعل أقل قدر من النقاط تأمين ممكن (عادة اثنين، بحد أقصى ثلاثة في رفرف).
4. إزالة المنطقة العازلة TD من الطبق 35MM واستبدالها 1.5 مل من وسائل الاعلام قبل تحسنت. تغطية صحن 35MM مع غطاء ووضعه في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO _2).

4. فصل المنطقة الهجرة الوسطى (CMZ)، حيث إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في المنطقة الجرحى من الخلفي كبسولة يحدث، من مرفق الأصل المنطقة (OAZ) من الخلايا الظهارية عدسة، على التحليل الكمي.

ملاحظة: هذه الخلايا تبدأ في التحرك إلى المنطقة CMZ على الفور ردا على إصابة. قبل يوم واحد في الثقافة ما يكفي من الخلايا يهاجرون عبر CMZ للتحليل الجزيئية والكيمياء الحيوية، وبعد الانفصال من CMZ وOAZ كتبها micro-تشريح ^23. هذا البروتوكول ينطوي على إزالة واحد رفرف (OAZ) في وقت من منطقة الجرحى من الكبسولة.

1. مراقبة وديمارالموجبة، واضحة للعيان تحت المجهر تشريح، بين OAZ وCMZ (انظر الشكل 2A). باستخدام اثنين من ملقط عالية الدقة، فهم مع كل من ملقط على حافة خط OAZ / CMZ، واحد فقط المتاخمة للالبعض، على جانبي الخط (انظر الشكل 2A، B، السهم).
2. باستخدام يد واحدة / واحد ملقط على الجانب CMZ تواصل التمسك ثقافة الجرحى، في حين باليد الأخرى / ملقط، وسحب بلطف OAZ على طول الخط OAZ / CMZ. وCMZ يفصل بسهولة من OAZ على طول هذا الخط. مواصلة السير على هذا الخط في جميع أنحاء ثقافة بأكملها حتى يتم فصل المنطقتين تماما.
3. دراسة فصل OAZ وCMZ الكسور للتحليل الجزيئي مثل ²⁴ أو البيوكيميائية تحليل الحمض النووي الريبي يليها مثل لطخة غربية أو زملاء مناعي ^23،25.

Representative Results

فيفو السابقين نموذج أنشئت لدراسة عملية التئام الجروح في المكروية في الخلايا الأم

للتحقيق في الآليات التي تشارك في تنظيم التئام الجروح لظهارة داخل المكروية في الخلايا الأم، تم إنشاء نموذج جراحة الساد ذات الصلة سريريا خارج الحي وهمية. يتم إنشاء هذا النموذج من عدسة الأنسجة والذي يقدم العديد من المزايا وذلك بسبب خصائصه الجوهرية: 1) العدسة هي جهاز بذاتها يحيط بها الغشاء القاعدي سميكة تسمى كبسولة العدسة. 2) هو اوعائي، 3) لا معصب و4) خالية من سدى المرتبطة بها. ولذلك، فإن عملية الإصلاح فحص يقتصر على الخلايا التي تعتبر ملازمة للعدسة المناسبة. لإنشاء هذا النموذج، يتم إزالة العدسات من الجنينية (E) يوم 15 كتكوت الجنين (الشكل 1A). يتم إجراء شق صغير في كبسولة العدسة الأمامية والخلايا الظهارية عدسة المرتبطة بها التي يتم من خلالها إزالة العدسة كتلة الخلايا الأليافبواسطة المائية شطف، وهو إجراء إعتام عدسة العين الكلاسيكي الذي يخلق جرح ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (الشكل 1A). ظهارة العدسة، والتي هي موجودة كما أحادي الطبقة مستمرة من الخلايا على طول الأمامي والجوانب الاستوائية من كبسولة العدسة المحيطة كتلة الخلايا الألياف، جنبا إلى جنب مع السكان الذاتية المتمثلة في-vimentin الغنية الأسلاف خلية إصلاح الوسيطة ^1، يبقى في عدسة خلال استخراج خلايا الألياف (الشكل 1A). بعد إزالة كتلة الخلايا الألياف، يتم إجراء خمس تخفيضات في الجانب الأمامي للكبسولة العدسة وظهارة بالارض جانب الخلية يصل، في مواجهة المتوسطة. يتيح هذا الإجراء التصوير للاستجابة للظهارة أصيب النهج مجهرية مختلفة، بما في ذلك الفحص المجهري الوقت الفاصل بين (فيديو 1). هذه التخفيضات الإضافية في العدسة الأمامية كبسولة خلق يزدرع النجوم شكل العدسة أصيب الجرح دائري تم إنشاؤها عن طريق إزالة كتلة الخلايا الليفية في CEN(ثالثا) من يزدرع (الشكل 1B). جراحة الساد بعد وتسطيح للأنسجة، ويقع ظهارة الجرحى في نقطة من النجم، وهو ما يشار إليه باسم مرفق الأصل المنطقة (OAZ) (الشكل 1A، B).

إزالة كتلة الخلية الألياف من موقع حرصه على كبسولة العدسة الخلفي يخلق منطقة الجرح استنساخه للغاية على الغشاء القاعدي، وتحيط بها الظهارة الجرحى (الشكل 1B، C). الحافة المكشوفة من عدسة ظهارة الاستوائية، تماما المجاورة إلى حيث كانت تعلق على خلايا الألياف، هو على حافة الرائدة في الجرح. مباشرة بعد الإصابة، يتم تنشيط جزء من السكان من إصلاح الخلايا الوسيطة-vimentin الغني ويهاجر إلى حافة الجرح من ظهارة ^1. ظهارة العدسة، مع هذه الخلايا إصلاح الوسيطة على حافة الرائدة، ويتحرك بسرعة على المنطقة خالية من الخلايا لب الذاتيةasement كبسولة غشاء، المنطقة الوسطى الهجرة (CMZ)، ليبدأ شفاء الجرح. الخلايا الظهارية عدسة تتحرك بشكل جماعي، كما ورقة، في CMZ بقيادة خلايا اللحمة المتوسطة الزعيم ^1، التي تمتد على طول نتوءات الركيزة وتوجيه عملية التئام الجروح (F igure 1D، فيديو 1). تقدم التئام الجروح، وتغطي مساحة كبيرة من الجرح (67٪) بعد يوم 1 في الثقافة (الشكل 1C)، وعادة ما تكتمل في غضون 3 أيام في الثقافة (الشكل 1B، C).

يمكن التفريق الجسدي واضح بين المناطق OAZ وCMZ في وقت مبكر من يوم 1، التي رسمتها كما تجعد أو تجعد بين هاتين المنطقتين (الشكل 2A، السهم). وتوفر هذه الظاهرة توجيهي التي لفصل هذه المناطق في أي نقطة أثناء عملية التئام الجروح. باستخدام ملقط يميل غرامة، ويمكن أن يكون الثقافات تشريح الصغيرة لseparأكل المناطق OAZ وCMZ من أجل تحليل الاختلافات الجزيئية بين هذه المناطق المتميزة (الشكل 2B). هذا هو نهج القوية التي استخدمت لتحديد التغييرات الهجرة الخاصة المرتبطة الجرح إصلاح. في السابق، فقد وجد أن هناك زيادة في التنسيق التصاق كيناز (FAK) التنشيط في فيفو السابقين الثقافات بجروح خلال عملية الجرح ⁵ الشفاء. FAK لها دور راسخة في هجرة الخلايا ^26-29. القدرة على إثراء للOAZ مقابل جعل CMZ الآن من الممكن لدراسة ما إذا كانت هذه الزيادة في تفعيل FAK تقتصر على المنطقة CMZ الهجرة محددة. لهذه الدراسة، تم فصل المناطق OAZ وCMZ في يوم 1-3 (في جميع مراحل عملية التئام الجروح) وتحليلها من أجل التغيرات البيوكيميائية في FAK تفعيل (FAK pY397). وأظهرت النتائج أن الزيادة في تفعيل FAK ارتبط المنطقة CMZ الهجرة الخاصة (الشكل 2C). الفيفو السابقين نموذج النظام الموصوفة هنا يوفر فرصة فريدة من نوعها والتي لا تقدر بثمن والتي للتحقيق في برامج الجزيئية تشارك في تنسيق عملية إصلاح الجرح.

الشكل 1. إنشاء نموذج خارج الحي الذي لدراسة عملية التئام الجروح داخل المكروية في الخلايا الأم ردا على إصابة الفسيولوجية. تم إجراء جراحة الساد وهمية على E15 العدسات الفرخ. تتم إزالة كتلة الخلية الألياف عدسة (البيضاء) من خلال شق في كبسولة الأمامية التي كتبها المائية شطف. هذه العملية يترك وراءه الخلايا الظهارية (الخضراء) التي لا تزال ملتصقة بإحكام على كبسولة العدسة وقبو غشاء الخلية الجرداء (BM) على الخلايا التي سوف تهاجر لتضميد الجرح (A). يتم إجراؤها على ظهارة خمسة تخفيضات لشد خارج وخلق شكل نجمة عبادة خارج الجسم الحي لدى عودتهم (B). ويشار إلى الخلايا الظهارية عدسة المتبقية التي تملأ نقطة للنجم باسم مرفق الأصل المنطقة (OAZ) (A، B). وBM الجرداء على الخلايا التي سوف يهاجر يشار اليها على انها المنطقة الوسطى الهجرة (CMZ) (A، B). على الفور ردا على إصابة الخلايا تبدأ في التحرك إلى المنطقة CMZ على BM-الجرداء الخلية (B). وكميا منطقة الجرح المفتوح على مر الزمن في (C). عادة اكتمال التئام الجروح التي كتبها D3 في الثقافة (B، C). في (B، C) T0 يدل وقت جرح، D1-3 يدل على أيام 1-3. ضمن CMZ، يمكن أن اثنين من السكان الخلايا تمييزها، والخلايا الظهارية العدسة والخلايا زعيم الوسيطة التي توطين إلى حافة الجرح، وتمتد على طول نتوءات الركيزة (D). لقد طبع هذا الرقم من Menko وآخرون ^23.الهدف = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. فصل المناطق OAZ وCMZ لتحديد التغييرات الهجرة الخاصة المرتبطة التئام الجروح، وبحلول يوم 1، المناطق OAZ وCMZ يمكن تمييزها عن بعضها البعض من خلال تجعد (السهم)، والتي يمكن استخدامها كدليل للفصل هذه المناطق (A). في هذه تجعد، ملقط يميل غرامة يمكن استخدامها لقبضة حافة خط OAZ / CMZ. يمكن فصل الثقافة على طول هذا الخط مما يسمح للعزل المناطق OAZ وCMZ (B). من يوم 1 (D1) الصغرى تشريح OAZ وCMZ يوميا، - يوم 3 (D3) قد أنجز لتحديد ما إذا تحدث تغييرات الهجرة الخاصة في تفعيل FAK في منطقة إصلاح الجرح. تم فحص لست] من كل منطقة عن طريق تحليل لطخة غربية إما تفعيل FAK (pFAK Y397) أو مجموع التعبير FAK (C). في حين لوحظ تغير طفيف في إجمالي مستويات FAK، كان مرتبطا بزيادة في تفعيل FAK مع المنطقة CMZ الهجرة الخاصة (C).

فيديو 1. يتبع التئام الجروح في نموذج جراحة الساد وهمية خارج الحي الزمن الفاصل بين المجهري من الوقت 0 بعد الاصابة حتى اليوم 3. الجرح إغلاق ينظر من وسط منطقة الجرح.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope