Introduction
임상 적으로, 모의 백내장 수술은, 여기에서 설명한 생체 상피 상처 치유 모델 부상에 응답하여 상피 조직의 복구를 조절 메카니즘을 조사하기위한 도구를 제공하기 위해 개발되었다. 이 모델을 창출을 목적으로 한 주요 기능은 밀접하게 복구 프로세스를 문화 설정, 2), 수리의 규제 요소를 변조의 완화에 부상에 대한 생체 반응을 복제하고 이미지 3) 기능 1) 제공하는 조건을 포함 실시간 전체에서. 과제는, 따라서, 세포의 미세 환경에서 원시 상피 상처 복구를 연구하는 것이 가능시킨 배양 모델을 생성하고 조작하는 것이었다. 이 상처 수리 모델의 유용성은 복구 프로세스를 조절하는 매트릭스 단백질, 사이토 카인 및 케모카인에서 내인성 시그널링 신호를 식별하기위한 새로운 가능성을 연다. 또한, 모델을 조사하기위한 이상적인 방법N 상피 창상 면적 2,3-을 다시 epithelialize하는 단체 시트 같이 부상 상피 4 집단 이주를 연출 기능 감긴 가장자리 간엽 리더 셀의 혈통을 결정하기위한 이동시킬 수있다. 이 모델은 또한 효과적인 상처 치유를 촉진하고 비정상적인 상처 수리 (5)을 방지 할 수 치료제를 식별하는 데 사용할 수있는 플랫폼을 제공한다.
가능한 상처 수리 모델의 수는 문화와 오늘 상처 복구 프로세스에 대해 알려진 대부분을 제공 한 생체, 모두, 이미있다. 이러한 각막 6-12 및 13-17 등 피부 손상 동물 모델에서의 기여를 포함하는 과정에 관여 할 수있는 모든 수리 매개체의 맥락에서 부상으로 조직의 반응을 연구 할 수있는 기회가있다 혈관 및 신경계. 그러나, experi 조작에 한계가있다생체 내에서의 정신적 상태 및 연속적으로 시간이 지남에 따라, 생체 내에서 수리 응답의 영상 검사를 실시 아직 가능하지 않다. 대조적으로, 이러한 스크래치 상처와 같은 대부분의 시험 관내 상처 수복 배양 모델들은 쉽게 조작 될 수 있고, 시간이 지남에 따라하지만 생체 조직에 상처 치유 공부의 환경 문맥이 부족하다. 생체 외 모델이 프로세스의 모든 시점에서 수리 분자 조절기를 조절하는 능력과 결합 된 세포의 미세 환경의 콘텍스트에서 시간에 걸쳐 연속적으로 부상 복구 프로세스를 연구하는 이점을 제공하지만, 이들에 맞 몇몇 모델이 있습니다 매개 변수를 설정합니다.
여기에 생리 상처 상피 조직의 반응을 재현 배양 치유 재현성 높은 생체 상피의 상처를 생성하는 절차를 설명한다. 조직 공급원, 생체 MOC으로 병아리 배아 렌즈 사용K 백내장 수술이 행해진 다. 렌즈는 무 혈관, 신경 지배, 및 관련 기질 (18,19)의 자유되지는 자체 포함 두꺼운 기저막 캡슐 내에 있기 때문에이 연구에 사용하는 이상적인 조직이다. 인간의 질환, 백내장 수술로 인해 렌즈의 혼탁으로 시력 상실을 해결하고, 렌즈의 대부분을 포함하는 렌즈 섬유 세포 덩어리의 제거를 포함한다. 다음은 백내장 수술의 비전은 인공 수정체의 삽입을 통해 복원됩니다. 백내장 수술 절차, 섬유 세포의 제거를 통해, 섬유 세포에 의해 점유되었던 렌즈 캡슐의 후방 영역의 재 상피화함으로써 응답 인접한 렌즈 상피의 상처 반응을 유도한다. 백내장 수술에서 가장 상처 복구 응답 같이 때때로 렌즈 후방 Capsu로 알려져 근육 섬유 모세포의 출현과 관련된 창상 치유 반응을 비정상적 섬유화 결과,이 발생제작 혼탁 20-22. 백내장 수술 상처 치유 모델을 생성하기 위해, 백내장 수술 절차는 생리 부상을 생성 병아리 배아로부터 제거 눈 렌즈에 모방한다. 렌즈 상피 세포에 의해 둘러싸인 매우 일관된 원형 상처 영역에서 렌즈 섬유 세포 결과 미세 수술 제거. 이 세포 집단 단단히 렌즈 기저막에 부착 된 캡슐 유지되며 외과 적 절차에 의해 부상한다. 상피 세포는 리더 셀 1로 복구 프로세스에 공지 멘틴 풍부한 간엽 세포 집단 이끄는 상처를 치유하는 내인성 기저막의 무 결함 영역으로 이동한다. 이 모델 부상 상피의 응답 쉽게 시각화 할 수 있고, 세포의 미세 환경의 콘텍스트에서 시간에 따라. 세포 발현 또는 상처 복구하는 역할을 할 것으로 기대 분자의 활성화의 변형에 용이하게 접근 할 수있다. 일의 강력한 기능모델 분리 및 상처 치유의 틀에서 마이그레이션 별 변화를 연구 할 수있는 기능입니다. 연구를 위해 세 유사한 생체 상처 치유 배양 다수를 준비하는 능력은이 모델의 다른 이점이다. 따라서,이 모델 시스템은 상처 치유 과정에 미치는 영향에 대한 상처 수리의 메커니즘과 테스트 치료제 떨어져 애타게 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 생체 모의 백내장 수술 모델은 손상 복구 메커니즘의 연구를위한 중요한 자원을 제공하는, 다양한 적용 가능성을 가질 것으로 기대된다.
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Protocol
다음 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침을 준수합니다.
예 생체 상처 문화 렌즈 1. 설치 및 준비
- 멸균, 층류 후드 세 100mm 페트리 접시를 놓습니다. 실온에서, 중간 트리스 / 우선 당 버퍼와 배양 접시 두 개를 (140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 0.7 mM의 나 2 PO 4, 5 mM의 D-포도당, 8.25 mM 트리스 자료, 염산으로 pH 7.4까지 TD 버퍼)를 입력 세 번째 빈 떠나. 사전 따뜻한 배양 배지를 37 ℃로 O (미디어 (199)는, 1 % L- 글루타민 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된)
참고 : 생체 내에서 발생으로 문화 매체를 치유 표준 상처, 무 혈청이다 그러나, 상처 수복 배양 혈청 또는 다른 인자를 포함 한정 배지 조건에서 성공적으로 성장시킬 수있다. - 비옥 한 배아 D를 제거바깥 인큐베이터에서 15 화이트 레그혼 병아리 달걀 (부드러운 락과 37.7 ° C에서 개최)
- 세척 병에서 층류 후드 70 % 에탄올로 쉘의 깨끗한 외부에서 선택한 달걀을 놓습니다. 멸균 솔루션과 장비를 사용하여 층류 후드에서 무균 조건 아래 모든 절차를 실시한다.
- 빈 100mm 페트리 접시에 계란과 장소 내용을 균열. 표준 집게 및 미세 가위를 사용하여 배아 목을 벨. TD 버퍼를 포함하는 배양 접시에 병아리 배아의 머리를 놓고 제대로 배아의 나머지를 폐기하십시오. 선택적으로 15 분보다 더 짧은 시간에 대한 TD 버퍼 병아리 배아 헤드를 유지하지 않는다.
- 페트리 접시 뚜껑에 병아리 배아 머리를 놓습니다. 고정밀 집게를 사용하여, 다음과 같은 순서로 눈로부터 부착 유리체와 함께 렌즈를 제거한다. 눈 뒤쪽의 작은 개구부를 생성하기 위해 집게 눈 뒤쪽 핀치.
- 그런 다음, W 유리체 유머를 파악i 번째 집게 부드럽게 롤링 운동과 유리체에 예인선이 부착 된 렌즈 유리체는 눈에서 탈락됩니다. TD 버퍼를 포함하는 나머지 배양 접시에서 유리체 장소 렌즈 /. 렌즈는 더 이상 30 분 TD 버퍼에 남아 있도록 허용합니다.
- 해부 현미경 새로운 배양 접시 뚜껑에 렌즈를 이동합니다. 이 시점부터 해부 현미경 아래의 모든 단계를 수행합니다. 고정밀 집게 조심스럽게 렌즈 조직이 손상되지 않도록주의를 복용, 집게의 가장자리를 사용하여 렌즈가 빠질 된 모든 모양체 (색소 세포)를 멀리 브러시.
참고 : 모양체 제거는 렌즈에 내생없는 종류의 세포가 상처 수리 문화에 포함되지 않도록합니다. - 후방 렌즈 캡슐과의 관계에서 유리체 몸을 곤란하게하여 고정밀 집게로 유리체 유머에서 렌즈를 분리합니다.
- 높은 정밀도를 사용하여 작은 방울로 렌즈를 전송 겸자35mm 조직 배양 접시에 TD 버퍼 (약 200 μL)의.
2. 수행 모의 백내장 수술
- 이 위를 향하게하여 렌즈의 전방 측면에 35mm 접시에 TD 버퍼의 드롭 렌즈의 방향을.
참고 : 렌즈의 앞쪽에 쉽게 렌즈 상피의 전방과 적도 지역의 경계를주의 조직의 밀도가 고리의 존재에 의해 식별됩니다. 대조적으로, 렌즈 섬유 세포가 부착되는 렌즈 캡슐의 후부에 마킹 부재가있다. - 각 손에 하나 집게로 조직을 파지하여 두 고정밀 집게는 전방 렌즈 캡슐 렌즈 조직을 둘러싸는 굵은 기저막 및 관련 전방 렌즈 상피의 중앙에 작은 절개 (약 850μm)하게 사용 부드럽게 반대 방향으로 잡아 당 겼.
- 렌즈 용 티슈, dislod의 대부분을 구성하는 섬유의 균체를 분리렌즈 상피 세포에 첨부 파일에서 그것을 카 및 (그림 1A에서 모델링 고전적인 백내장 수술에 사용되는 방식) 수력 용출에 의해 수정체 낭 주변.
- TD 버퍼 300 μL와 27.5 G 바늘 끝 1 ML의 주사기를 채우십시오. 앞쪽에 렌즈 캡슐에서 만든 절개로 바늘 끝을 삽입하고 대한 중간 렌즈로.
- 부드럽게 렌즈 섬유 세포 덩어리로 TD 버퍼를 주입 주사기 우울. 50 ~ 200 μL의 TD, 결코 300 개 이상의 μl를 주입한다. 상피 및 렌즈 캡슐에서 자신을 풀어 섬유 세포 질량을 관찰한다.
- 고정밀 집게를 사용하여, 전방 절개 부위를 통해 렌즈로부터 풀어 섬유 세포 덩어리를 제거한다.
참고 :이 절차는이 사이트에 바로 인접한 섬유 세포가 부착 된 세포의 무 결함했다되는 후방 렌즈 기저막 캡슐 및 부상 렌즈 상피 세포를 떠난다.
3. Preparin전의 VIVO 문화 G 부상 렌즈
- 낭의 전방 측면에서 다섯 삭감하여, 배양 접시에 위에서 설명한 백내장 수술, 셀 사이드의 결과 렌즈 낭을 평평하게.
- 렌즈의 균분 원을 통해 절개 부위에 수직으로 잘라. 아래로 배양 접시 캡슐 측에 부착 된 상피 세포 쪽이 위로 렌즈 캡슐의 결과 다섯 "날개"를 평평하게. 스타 또는 flowerlike 모양 (그림 1B 참조)해야 지금 생체 부상 렌즈를합니다.
- 별의 각 지점에서 부드럽게 아래로 집게, 접시를 눌러 캡슐을 확보합니다. 이 이식편의 다섯 가장 바깥 끝에서 작은 들여 쓰기를하고 접시에 지속적인 첨부 파일에서 발생합니다.
주 :이 절차 중에 캡슐 손상 가능하며 그래서 FLA의 선단에 가깝게 접시에 캡슐을 고정하는 것이 중요가능한 PS뿐만 아니라 가능한 확보 지점 최소량을 만들기 위해 (일반적으로 두 플랩 당 최대 세). - 35mm 접시에서 TD 버퍼를 제거하고 미리 예열 미디어 1.5 ㎖로 교체합니다. 인큐베이터에서 뚜껑과 장소 35mm 접시 커버 (37 ° C를, 5 % CO 2).
후방 캡슐의 부상 영역의 재 상피화가 정량 분석을위한 렌즈 상피 세포의 원래 첨부 지대 (OAZ)에서 발생 중앙 마이그레이션 지대 (CMZ), 4. 분리.
참고 : 세포 손상에 대한 응답으로 즉시 CMZ 영역으로 이동하기 시작한다. 문화의 날 하나 충분한 세포는 미세 해부 (23)에 의해 CMZ와 OAZ의 분리 다음, 분자, 생화학 적 분석을 위해 CMZ를 통해 마이그레이션. 이 프로토콜은 캡슐의 상처 영역으로부터 한 번에 하나의 플랩 (OAZ)의 제거를 수반한다.
- demar을 준수양이온과 OAZ CMZ 사이, 해부 현미경 명확하게 볼 (도 2a 참조). 두 고정밀 집게를 사용하여, 라인의 양측에, OAZ / CMZ 라인에 바로 인접한 다른 하나의 에지에서 두 집게로 잡고 (도 2A, B, 화살표 참조).
- 한 손으로 / CMZ 측의 한 집게는 다른 손 / 집게로 부드럽게 OAZ / CMZ 라인을 따라 OAZ을 끌어 동안, 부상자 문화에 개최하는 것을 계속한다. CMZ 쉽게이 선을 따라 OAZ에서 분리합니다. 두 지역이 완전히 분리 될 때까지 전체 문화 주위에이 라인을 따라 계속합니다.
- 이러한 웨스턴 블롯 또는 공동 면역 (23, 25)와 같은 RNA-SEQ (24) 또는 생화학 적 분석과 같은 분자 분석을위한 분리 OAZ 및 CMZ 분수를 공부한다.
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Representative Results
예 생체 내 모델은 세포의 기본 미세 환경에서 상처 치유 과정을 연구하기 위해 만들어
세포의 기본 미세 환경 내에서 상피의 상처 치유 조절에 관여하는 메커니즘을 조사하기 위해, 임상 적으로 생체 모의 백내장 수술 모델을 만들었습니다. 이 모델은 그의 고유 특성 때문에 많은 이점을 제공 렌즈 조직으로부터 생성된다 : 1) 렌즈 수정체 낭 불리는 두꺼운 기저막으로 둘러싸여 독립적 기관이다; 2)는 무 혈관성, 3)의 지배를하지 4) 관련 기질 무료입니다. 따라서, 검사 보수 프로세스가 적절한 렌즈 타고난 세포로 제한된다. 이 모델을 만들려면, 렌즈는 배아 (E) 하루 15 병아리 배아 (그림 1A)에서 제거됩니다. 작은 절개 렌즈 섬유 균체가 제거되는 전방 렌즈 캡슐과 연관된 렌즈 상피 세포에서 이루어진다하이드로 용출, 생리 학적으로 관련 상처 (그림 1A)를 생성하는 고전적인 백내장 절차에 의해. 멘틴 풍부한 간엽 수리 세포 전구 세포 (1)의 내인성 인구와 함께 섬유 균체를 둘러싸고 전방 따라 세포 및 수정체 낭의 적도 양상 연속 단일 층으로서 존재 렌즈 상피는 동안 렌즈 유지 섬유 세포 (도 1A)의 추출. 섬유 균체를 제거한 후, 다섯 인하 수정체 낭의 전방 측면에서 만들어진다 및 상피 매체 대향 최대 셀 측 평평. 이 절차는 시간 경과 현미경 (비디오 1) 등 다양한 미시적 접근 방법에 의해 손상된 상피 세포의 응답의 영상을 가능하게한다. 전방 렌즈 캡슐에 이러한 추가 삭감 CEN에서 섬유 균체를 제거하여 생성 된 원형으로 감겨 부상 렌즈의 별 모양 이식편을 만들이식편 (그림 1B)의 터. 후 백내장 수술과 조직의 평탄화가 부상 상피가 원래 첨부 지대 (OAZ)라고 별의 점에 있습니다 (그림 1A, B).
후방 수정체 낭에의 결합 부에서 섬유 균체의 제거는 상처에 의해 둘러싸인 상피 기저막에 높은 재현성 상처 영역을 작성 (도 1B, C). 섬유 세포가 부착 한 위치로 바로 인접한 렌즈 적도 상피의 노출 엣지는 상처의 선단이다. 손상 후 즉시, 비 멘틴이 풍부한 수리 간엽 세포의 하위 집단은 활성화되어 상피의 창상 한 가장자리로 마이그레이션. 렌즈 상피 그들의 리딩 에지에서 이러한 수리 간엽 세포를 빠르게 내인성 B의 무 세포 영역에 이동asement 막 캡슐은 중앙 이송 영역 (CMZ)은, 상처 치유를 시작합니다. 렌즈 상피 세포가 기판을 따라 돌기를 확장하고 상처 치유 과정을 직접 중간 엽 리더 세포 1, 주도 CMZ로, 시트 집합 적으로 이동 (F는 1D, 비디오 1 igure). 상처 치유 문화의 날 (1)에 의한 상처 (67 %) (그림 1C)의 상당 지역을 커버, 진행, 일반적으로 문화 삼일 (그림 1B, C) 이내에 완료된다.
분명 물리적 구분이 이르면이 두 영역 (그림 2A, 화살표) 사이의 주름이나 주름으로 경계가되는 1 일, 같은 OAZ 및 CMZ 영역 사이에 할 수있다. 이러한 현상은 이들 영역을 구분하는 기준에 가이드 라인을 제공 상처 치유 과정 중 임의의 시점. 뾰족한 집게를 사용하여, 문화 separ하는 마이크로 해부 될 수 있습니다이 별개의 영역 (그림 2B) 사이에 분자의 차이를 분석하기 위해 OAZ 및 CMZ 지역을 먹었다. 이 상처 수리와 관련된 마이그레이션 관련 변경 사항을 식별하는 데 사용 된 강력한 방법입니다. 이전에는 공정 (5) 상처 치유 동안 생체 상처 문화에 초점 접착 키나제 (FAK) 활성화의 증가가있는 것으로 나타났습니다. FAK는 세포 이동 26 ~ 29에 잘 설립 역할을한다. CMZ 지금 FAK 활성의 증가가 이주 특정 CMZ 영역 특정인지 검사하는 것이 가능하게 대 능력 OAZ 위해 풍요롭게. (상처 치유 과정에서) 3 FAK 활성화 (FAK pY397)의 생화학 적 변화를 분석 -이 연구를 위해 OAZ 및 CMZ 영역은 1 일에 분리 하였다. 결과는 FAK 활성화의 증가가 마이그레이션 관련 CMZ 영역 (그림 2C)와 관련이 있음을 보여 주었다.여기에 설명 된 생체 모델 시스템은 상처 복구 프로세스를 조정에 관여하는 분자 프로그램을 조사하여 독특하고 귀중한 기회를 제공한다.
그림 1. 생리적 상처에 반응하여 세포의 기본 미세 환경 내에서 상처 치유 과정을 연구하여 생체 모델의 창조. 모의 백내장 수술 E15 병아리 렌즈에서 수행되었다. 렌즈 섬유 세포 질량 (흰색) 수력 용출에 의한 전방 캡슐의 절개를 통해 제거된다. 이 프로세스는 수정체 낭과 세포 상처 (A)을 치유하기 위하여 이동되는 상으로 세포 - 무 결함 기저막 (BM)에 단단히 부착 남아 상피 세포 (녹색) 뒤에 남긴다. 상피에 만들어진 다섯 인하 평평하고 모양 생체 숭배 스타를 만드는 URE (B). 스타 포인트를 채우기 잔류 렌즈 상피 세포는 본래 부착 영역 (OAZ)로 지칭된다 (A, B). 셀은 중앙 이송 영역 (CMZ)라고도하는 마이그레이션에 무 결함 BM (A, B). 즉시 부상에 응답하여, 세포는 세포 - 무 결함 BM (B)에 CMZ 영역으로 이동하기 시작한다. 개방형 상처 영역 (C)에서 시간이 지남에 따라 정량한다. 상처 치유는 일반적으로 배양 (B, C)에 D3에 의해 완성된다. (나, 다) T0는 상처의 시간을 의미에서, D1-3는 일 1-3이다. CMZ 내 세포의 두 집단은, 기판 (D)을 따라 연장되는 돌출부 렌즈 상피 세포 및 상처 가장자리 지역화 리더 간엽 세포, 구별 될 수있다. 이 수치는 Menko 등 (23)에서 다시 인쇄됩니다.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OAZ 및 CMZ 지역의 그림 2. 분리는 상처 치유와 관련된 마이그레이션 관련 변경 사항을 식별합니다., OAZ 및 CMZ 영역은 서로 구별 할 수있는 일 (1)에 의해 별도의 가이드로 사용할 수있는 주름 (화살표)에 의해 이러한 영역 (A). 이 주름에서, 뾰족한 집게 그립에 OAZ / CMZ 라인의 가장자리를 사용할 수 있습니다. 문화는 OAZ 및 CMZ 지역 (B)의 분리를 허용하는이 라인을 따라 분리 할 수있다. 마이크로 해부 매일 OAZ 및 CMZ의는 1 일 (D1)에서 - 일 3 (D3) FAK 활성화에 마이그레이션 별 변화가 상처 수리의 영역에서 발생하는지 확인하기 위해 수행되었다. 각 지역에서 해물 FAK 활성화 중 하나에 대한 웨스턴 블롯 분석 (pFAK Y39에 의해 조사 하였다7) 또는 총 FAK 식 (C). 총 FAK 수준에 작은 변화가 관찰되지만, FAK 활성의 증가는 특정 이동 CMZ 영역 (C)과 연관이 있었다.
비디오 1. 생체 모의 백내장 모델에서 상처 치유가 손상 후 상처 영역의 중심에서 보았을 일 3. 상처 봉합 시간까지 0에서 시간 경과 현미경으로 이어진다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
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