Introduction
El, simulacro de cirugía de catarata clínicamente relevante, ex vivo modelo de curación de heridas epiteliales aquí descrito fue desarrollado para proporcionar una herramienta para la investigación de los mecanismos que regulan la reparación de los tejidos epiteliales en respuesta a una lesión. Las principales características que fueron destinadas para la creación de este modelo incluyen 1) proporcionar condiciones que replican de cerca la respuesta in vivo para herir en un entorno cultural, 2) la facilidad de la modulación de los elementos reguladores de la reparación, y 3) capacidad de la imagen del proceso de reparación, en su totalidad, en tiempo real. El reto, por lo tanto, era crear un modelo de cultivo en el que era posible estudiar y manipular, reparación de la herida epitelial en microambiente nativa de las células. La disponibilidad de este modelo de herida de reparación de abre nuevas posibilidades para la identificación de las señales de señalización endógenos de la matriz de proteínas, citocinas y quimiocinas que regulan el proceso de reparación. Además, el modelo es ideal para examinar cómo unn epitelio es capaz de moverse como una lámina colectiva para volver a epitelizar el área de la herida 2,3, y para determinar el linaje de células mesenquimales líder en el borde de la herida que funciona en la dirección de la migración colectiva del epitelio lesionado 4. Este modelo también ofrece una plataforma con la que identificar terapias que podrían promover la cicatrización efectiva y prevenir la reparación de heridas aberrante 5.
Ya hay una serie de modelos de heridas de reparación disponibles, tanto en la cultura como in vivo, que han proporcionado la mayor parte de lo que se conoce sobre el proceso de reparación de heridas hoy. En modelos de lesión de origen animal, tales como la córnea y la piel 6-12 13-17, hay la oportunidad de estudiar la respuesta del tejido a heridas en el contexto de todos los mediadores de reparación que podrían estar involucrados en el proceso, incluyendo las contribuciones de la vasculatura y el sistema nervioso. Sin embargo, hay limitaciones a la manipulación de la expericondiciones mentales en vivo, y aún no es posible llevar a cabo estudios de imagen de la respuesta de reparación in vivo, de forma continua en el tiempo. En contraste, la mayoría de los modelos de cultivo in vitro de reparación de la herida, tales como la herida de cero, pueden ser fácilmente manipulados y siguieron a lo largo del tiempo, pero carecen el contexto ambiental de estudiar la cicatrización de heridas en el tejido in vivo. Mientras que los modelos ex vivo ofrecen la ventaja de estudiar el proceso de reparación de la lesión continua en el tiempo en el contexto de microambiente de las células junto con la capacidad de modular los reguladores moleculares de reparación en cualquier punto en el proceso de tiempo, hay pocos modelos que se ajustan a estos parámetros.
Aquí se describe un procedimiento para generar altamente reproducible ex vivo epitelial herida culturas que reproducen la respuesta de un tejido epitelial a una herida fisiológico de curación. Uso de la lente de embrión de pollo como una fuente de tejido, un ex vivo mock se lleva a cabo la cirugía de catarata. La lente es un tejido ideal para utilizar para estos estudios ya que es auto-contenida dentro de una cápsula gruesa membrana basal, avascular, no inervado, y libre de cualquier estroma asociado 18,19. En la enfermedad humana, la cirugía de catarata se ocupa de la pérdida de la visión debido a la opacificación de la lente, y consiste en la extirpación de la masa celular de fibra de lente, que comprende el grueso de la lente. Después de la cirugía de cataratas visión se restaura mediante la inserción de una lente intraocular artificial. El procedimiento de la cirugía de cataratas, a través de la eliminación de las células de fibra, induce una respuesta lesión en el epitelio de la lente adyacente, que responde por la reepitelización de la zona posterior de la cápsula del cristalino que había sido ocupada por las células de fibra. En la cirugía de cataratas, como en la mayoría de las respuestas de reparación de la herida, hay a veces se produce un resultado fibrótica aberrante a la respuesta de cicatrización de heridas, asociado con la aparición de miofibroblastos, que en la lente que se conoce como Posterior Capsule opacificación 20-22. Para generar el modelo de cicatrización de heridas cirugía de cataratas, un procedimiento de cirugía de cataratas es imitado en lentes retira del ojo de embrión de pollo para producir una lesión fisiológica. Remoción microquirúrgica de las células resultados de fibra de la lente en un área de la herida circular muy consistente rodeado por las células epiteliales de la lente. Esta población de células permanece firmemente unido a la cápsula de la membrana basal de la lente y se lesiona por el procedimiento quirúrgico. Las células epiteliales migran a la zona denudada de la membrana basal endógena para sanar la herida, dirigido por una población de células mesenquimales vimentina ricos conocidos en el proceso de reparación como células líder 1. Con este modelo de la respuesta de un epitelio a la lesión puede ser visualizado y siguió con el tiempo en el contexto de microambiente de las células fácilmente. Las células son fácilmente accesibles a las modificaciones de la expresión o activación de moléculas espera que juegue un papel en la reparación de heridas. Una característica poderosa del XXes el modelo es la capacidad de aislar y estudiar los cambios a la migración específica en el marco de la cicatrización de heridas. La capacidad de preparar un gran número de cultivos in vivo de edad emparejados ex cicatrización de heridas para los estudios es otra ventaja de este modelo. De este modo, este modelo de sistema ofrece una oportunidad única de separar los mecanismos de reparación de la herida y la terapéutica de las pruebas para determinar su efecto sobre el proceso de cicatrización de la herida. Se espera que el modelo de la cirugía de cataratas ex vivo simulacro de tener una amplia aplicación, proporcionando un recurso crítico para el estudio de los mecanismos de reparación del daño.
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Protocol
El siguiente protocolo cumple con las directrices de Animales Institucional de Cuidado y Uso Comité Thomas Jefferson University y con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Vision Research.
1. Instalación y Preparación de lentes para la Cultura ex vivo de la herida
- Coloque tres platos de 100 mm de Petri en una campana de flujo laminar estéril. Llenar dos de los platos de Petri a medio camino con tampón Tris / Dextrosa (tampón TD; NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-glucosa, 8,25 mM Tris Base, pH a 7,4 con HCl) a TA , dejando la tercera vacío. Medios de cultivo Pre-caliente (Media suplementado con 199, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina / estreptomicina) a 37 o C.
Nota: El estándar de las heridas de curación medios de cultivo es libre de suero, como ocurre in vivo; sin embargo, los cultivos de reparación de la herida se pueden cultivar con éxito en condiciones de medios definidos que incluyen suero u otros factores. - Retire fértil d embrionariaay 15 White Leghorn huevos de pollo de la incubadora (celebrada en 37,7 ° C con suave balanceo)
- Coloca el huevo seleccionado en la campana de flujo laminar y fuera de la cáscara limpia con etanol al 70% a partir de una botella de lavado. Llevar a cabo todos los procedimientos siguientes en condiciones asépticas en la campana de flujo laminar, el uso de soluciones e instrumentos estériles.
- Grieta de huevo y colocar contenido en el vacío de 100 mm placa de Petri. Decapitar embrión utilizando pinzas estándar y tijeras finas. Coloque la cabeza del embrión de pollo en una placa de Petri que contiene tampón TD y disponer adecuadamente del resto del embrión. Opcionalmente mantener las cabezas de embrión de pollo en tampón TD por un corto período de tiempo, no más de 15 min.
- Coloque la cabeza del embrión de pollo en una tapa de placa de Petri. Con unas pinzas de alta precisión, retire la lente junto con su humor vítreo adjunta del ojo en la siguiente secuencia. Apriete la parte posterior del ojo con las pinzas para crear una pequeña abertura en la parte posterior del ojo.
- Luego, sujete el humor vítreo wITH pinzas y tirar suavemente en el vítreo con un movimiento de balanceo, el vítreo con el objetivo puesto serán desalojados del ojo. Coloque la lente / vítreo en la placa de Petri restante contiene tampón TD. Permita que los lentes se mantengan en tampón TD durante no más de 30 min.
- Mover la lente a una nueva tapa de placa de petri bajo un microscopio de disección. Desde este punto de realizar todos los pasos bajo un microscopio de disección. Con unas pinzas de alta precisión cepillarse cuidadosamente cualquier cuerpo ciliar (células pigmentadas) que fueron desalojados con la lente usando el borde de la pinza, teniendo la precaución de no dañar el tejido objetivo.
Nota: Extracción del cuerpo ciliar se asegura de que los tipos de células que no son endógenas a la lente no se incluyen en la cultura reparación de la herida. - Separar la lente del humor vítreo con pinzas de alta precisión pellizcando fuera del cuerpo vítreo de su asociación con la cápsula posterior del cristalino.
- Uso de alta precisión fórceps transferir la lente en una pequeña gotade tampón TD (aproximadamente 200 l) en una placa de cultivo tisular de 35 mm.
2. Realización de Cirugía de Catarata Mock
- Oriente la lente en la gota de tampón TD en el plato 35 mm con el aspecto anterior de la lente hacia arriba.
Nota: El anterior de la lente se identifica fácilmente por la presencia de un anillo denso en el tejido que toma nota de la frontera entre la parte anterior y la región ecuatorial del epitelio del cristalino. En contraste, hay una ausencia de marcas en la parte posterior de la cápsula de la lente a la que están unidos los células de fibra óptica. - El uso de dos pinzas de alta precisión hacer una pequeña incisión (aproximadamente 850μm) en el centro de la cápsula anterior de la lente, la membrana basal gruesa que rodea el tejido del cristalino, y su epitelio anterior del cristalino asociada, agarrando el tejido con uno fórceps en cada mano y tirando suavemente en direcciones opuestas.
- Retire la masa celular de fibra, lo que constituye la mayor parte del tejido de la lente, dislodging desde sus archivos adjuntos al epitelio de la lente y que rodea la cápsula del cristalino por hidro-elución (un enfoque clásico utilizado en la cirugía de cataratas, modelada en la Figura 1A).
- Llene una jeringa de 1 ml con una punta de la aguja 27.5 G con 300 l de tampón TD. Inserte la punta de la aguja en la incisión hecha en la cápsula anterior del cristalino, y aproximadamente a mitad de camino en la lente.
- Presione suavemente la jeringa inyectar el tampón TD en la masa celular de fibra lente. Inyectar entre 50 y 200 TD l, y nunca más de 300 l. Observe la masa celular de fibra aflojando en sí de la cápsula epitelio y lente.
- Con unas pinzas de alta precisión, retire la masa celular de fibra aflojado desde la lente a través del sitio de la incisión anterior.
Nota: Este procedimiento deja la cápsula posterior del cristalino membrana basal a la cual las células de fibra se habían unido despojada de las células, y un epitelio del cristalino lesionado justo al lado de este sitio.
3. preparing la lente Herido de Ex Vivo Cultura
- Acoplar la bolsa capsular de la lente que resulta de la cirugía de cataratas se ha descrito anteriormente en la placa de cultivo, con el lado de células hasta, al hacer cinco cortes en la cara anterior de la bolsa capsular.
- Cortar perpendicular a la zona de la incisión original a través del ecuador de la lente. Acoplar los resultantes cinco "flaps" de cápsula del cristalino con el epitelio adjunta en el lado de la cápsula placa de cultivo abajo, célula hacia arriba. Nota de la lente heridos ex vivo ahora debe asumir una estrella o la forma del flowerlike (véase la Figura 1B).
- Para asegurar la cápsula para el plato, presione suavemente hacia abajo con las pinzas en cada punto de la estrella. Esto hará una pequeña hendidura en los cinco consejos más exteriores del explante y el resultado en apego sostenido al plato.
Nota: Es posible dañar la cápsula durante este procedimiento y por lo que es importante para asegurar la cápsula al plato tan cerca de la punta de la flaps como sea posible, así como para hacer la menor cantidad de puntos de sujeción como sea posible (generalmente dos, máximo de tres por FLAP). - Retire el tampón TD desde el plato de 35 mm y reemplazarlo con 1,5 ml de medio de pre-calentado. Cubra el plato de 35 mm con su tapa y colocar en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).
4. Separación de la Zona Central de Migración (CMZ), donde Re-epitelización de la zona de la herida de la Cápsula Posterior produce, desde el archivo adjunto original Zone (OAZ) de las células epiteliales de la lente, para el análisis cuantitativo.
Nota: Las células comienzan a moverse en la región CMZ inmediatamente en respuesta a una lesión. Por día uno en la cultura suficientes células están migrando a través de la CMZ para el análisis molecular y bioquímico, después de la separación de la CMZ y la OAZ por micro-disección 23. Este protocolo consiste en la extracción de una solapa (OAZ) a la vez desde la zona de la herida de la cápsula.
- Observar un Demarcatión, claramente visible bajo el microscopio de disección, entre el OAZ y CMZ (véase la figura 2A). El uso de dos pinzas de alta precisión, sujete con ambas pinzas en el borde de la línea de OAZ / CMZ, uno justo al lado de la otra, a cada lado de la línea (ver la Figura 2A, B, flecha).
- Con una mano / un fórceps en el lado CMZ siguen aferrarse a la cultura heridos, mientras que con la otra mano / pinzas, tire suavemente de la OAZ largo de la línea OAZ / CMZ. La CMZ separa fácilmente del OAZ largo de esta línea. Continuar por esta línea alrededor de toda la cultura hasta que las dos regiones están completamente separadas.
- Estudiar las Oaz y CMZ fracciones separadas para el análisis molecular, tales como 24 o bioquímica análisis de ARN-Seq como western blot o co-inmunoprecipitación 23,25.
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Representative Results
Creado ex vivo modelo para estudiar el proceso de cicatrización de heridas en microambiente nativa de las células
Para investigar los mecanismos implicados en la regulación de la cicatrización de heridas de un epitelio dentro microambiente nativa de las células, se ha creado un modelo de la cirugía de catarata clínicamente relevante ex vivo simulacro. Este modelo se crea a partir de tejido de lente que ofrece muchas ventajas, debido a sus propiedades intrínsecas: 1) la lente es un órgano autónomo, rodeado por una membrana basal gruesa llamada la cápsula del cristalino; 2) es avascular, 3) no inervado y 4) libre de estroma asociado. Por lo tanto, el proceso de reparación examinado se limita a células que son innata a la lente adecuada. Para crear este modelo, las lentes se retiran de un embrionario (E) días 15 embrión de pollo (Figura 1A). Una pequeña incisión en la cápsula anterior del cristalino y sus células epiteliales de la lente asociados a través del cual se retira la masa celular fibra lentepor hidro-elución, un procedimiento de cataratas clásico que crea una herida fisiológicamente relevante (Figura 1A). El epitelio del cristalino, que está presente como una monocapa continuo de células a lo largo de la anterior y aspectos ecuatoriales de la cápsula del cristalino que rodean la masa celular de la fibra, junto con su población endógena de vimentina rica en progenitores de células de reparación mesenquimales 1, permanecen en la lente durante el extracción de células de la fibra (Figura 1A). Después de la eliminación de la masa celular de la fibra, cinco cortes se realizan en la cara anterior de la cápsula del cristalino y el epitelio aplanado del lado célula hacia arriba, hacia el medio. Este procedimiento permite obtener imágenes de la respuesta del epitelio lesionado por diversos enfoques microscópicos, incluyendo microscopía de lapso de tiempo (Video 1). Estos cortes adicionales en la cápsula anterior del cristalino crean un explante en forma de estrella de la lente heridos con la herida circular creado por la eliminación de la masa celular de la fibra en el CENter del explante (Figura 1B). La cirugía de cataratas y Post-aplanamiento del tejido, el epitelio heridos se encuentra en las puntas de la estrella, que se conoce como el archivo adjunto original Zone (OAZ) (Figura 1A, B).
La eliminación de la masa celular de la fibra a partir de su sitio de unión en la cápsula posterior del cristalino crea un área de la herida altamente reproducible en la membrana basal, rodeado por el epitelio heridos (Figura 1B, C). El borde expuesto de la lente epitelio ecuatorial, justo al lado de donde se unen las células de fibra, es el borde de ataque de la herida. Inmediatamente después de la lesión, una subpoblación de células de reparación mesenquimal vimentina-rico se activa y migra hacia el borde de la herida del epitelio 1. El epitelio del cristalino, con estas células mesenquimales de reparación en su borde de ataque, rápidamente se mueve sobre la región libre de células de la endógeno bcápsula de membrana asement, la Zona Central de Migración (CMZ), para comenzar la curación de la herida. Células epiteliales de la lente se mueven colectivamente, como una hoja, en la CMZ llevado por las células mesenquimales líder 1, que se extienden salientes a lo largo del sustrato y dirigir el proceso de cicatrización de la herida (F igura 1D, Video 1). La cicatrización de heridas progresa, que cubre un área significativa de la herida (67%) por día 1 en cultivo (Figura 1C), y típicamente se completa dentro de 3 días en cultivo (Figura 1B, C).
Una distinción física clara se puede hacer entre las regiones Oaz y CMZ tan pronto como 1 día, que está demarcada como un pliegue o arruga entre estas dos zonas (Figura 2A, flecha). Este fenómeno proporciona una pauta por la cual para separar estas áreas en cualquier punto durante el proceso de cicatrización de la herida. Utilizando una pinza fina de punta, las culturas pueden ser micro-disecados de SEPARcomió las regiones Oaz y CMZ con el fin de analizar las diferencias moleculares entre estas zonas distintas (Figura 2B). Este es un enfoque poderoso que se ha utilizado para identificar los cambios específicos de la migración asociados con la herida de reparación. Anteriormente, se encontró que hay un aumento en la activación de la quinasa de adhesión focal (FAK) en las culturas heridos ex vivo durante la herida proceso 5 de curación. FAK tiene un papel bien establecido en la migración celular 26-29. La capacidad de enriquecer para el OAZ vs. CMZ ahora hizo posible examinar si este aumento en la activación de FAK es específica para la región CMZ-migración específica. Para este estudio, las regiones Oaz y CMZ se separaron en día de 1 - 3 (en todo el proceso de cicatrización de la herida) y se analizaron para cambios bioquímicos en la activación de FAK (FAK pY397). Los resultados demostraron que el aumento en la activación de FAK se asoció con la región CMZ-migración específica (Figura 2C). Losex vivo modelo de sistema descrito aquí ofrece una oportunidad única y muy valiosa en el que para investigar los programas moleculares implicados en la coordinación del proceso de reparación de heridas.
Figura 1. Creación de un modelo ex vivo en el que para estudiar el proceso de cicatrización de la herida dentro de microambiente nativo de las células en respuesta a una herida fisiológica. Mock cirugía de cataratas se realizó en las lentes chick E15. La masa celular fibra lente (blanco) se retira a través de una incisión en la cápsula anterior por hidro-elución. Este proceso deja detrás de células epiteliales (verde) que permanecen fuertemente adherente a la cápsula de la lente y una membrana basal por células denudado (BM) sobre el que las células migrarán a curar la herida (A). Cinco cortes se hacen en el epitelio que se aplanan y crean una estrella en forma de culto ex vivo Ure (B). Las células epiteliales del cristalino residuales que llenan las puntas de la estrella se conocen como el archivo adjunto original Zone (OAZ) (A, B). El BM desnuda en la que las células migren se conoce como la Zona Central de Migración (CMZ) (A, B). Inmediatamente en respuesta a una lesión, las células comienzan a moverse en la región CMZ en el BM-desprovistas de células (B). El área de la herida abierta se cuantificó con el tiempo en (C). La cicatrización de heridas se completa típicamente por D3 en cultivo (B, C). En (B, C) T0 denota momento de herir, D1-3 denota Días 1-3. Dentro de la CMZ, dos poblaciones de células se pueden distinguir, las células epiteliales de la lente y las células mesenquimales líder que localizan al borde de la herida, que se extienden salientes a lo largo del sustrato (D). Esta cifra se reproduce desde Menko et al 23.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Separación de regiones Oaz y CMZ para identificar los cambios específicos de la migración asociados con la curación de heridas. Por día 1, las regiones Oaz y CMZ se pueden distinguir uno del otro por un pliegue (flecha), que puede ser utilizado como una guía para separar estas zonas (A). En este pliegue, fórceps de punta fina se pueden usar para agarrar el borde de la línea OAZ / CMZ. La cultura puede ser separado a lo largo de esta línea que permite el aislamiento de las regiones Oaz y CMZ (B). Micro-disección de la OAZ y CMZ diaria, desde el día 1 (D1) - día 3 (D3) se realizó para determinar si se producen cambios a la migración específica en la activación de FAK en la región de la reparación de heridas. Los lisados de cada región fueron examinados por Western blot, ya sea para la activación de FAK (pFAK Y397) o total expresión de FAK (C). Si bien se observó poco cambio en los niveles totales de FAK, un aumento en la activación de FAK se asoció con la región CMZ-migración específica (C).
Vídeo 1. Herida de curación en el modelo de la cirugía de cataratas ex vivo simulacro es seguido por microscopía de lapso de tiempo de vez en 0 después de la lesión hasta el día 3. cierre de la herida se ve desde el centro del área de la herida.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
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