Introduction
臨床的に関連する、モック白内障手術は、ここで説明するex vivoでの上皮の創傷治癒モデルは、損傷に応答して、上皮組織の修復を制御する機構を調査するためのツールを提供するために開発されました。このモデルを作成する際にを目的とした主な機能は、1を含む）と密接画像へのカルチャ設定で負傷、2）修理の調節要素を調節のしやすさ、および3）能力修復プロセスへのインビボ応答をレプリケート条件を提供します、その全体を、リアルタイムで。課題は、したがって、細胞のネイティブの微小環境では、上皮創傷修復を研究することが可能とされた培養モデルを作成し、操作することでした。この創傷修復モデルの利用可能性は、修復プロセスを調節するマトリックスタンパク質、サイトカインおよびケモカインからの内因性シグナル伝達の手がかりを識別するための新たな可能性を開きます。また、モデルがどのように検査するための理想的ですnは上皮が創傷領域2,3を 、再上皮化する集団シートとして負傷した上皮4の集団移動を導くで機能創傷端に間葉リーダー細胞の系統を決定するために移動することができます。また、このモデルでは、効果的な創傷治癒を促進し、異常な創傷修復5を防ぐことができる治療薬を同定する際のプラットフォームを提供します。
今日創傷修復プロセスについて知られているものの大部分を提供してきた文化およびin vivoの両方で利用可能な創傷修復モデル、の数が既にあります。このような角膜6-12や皮膚13-17のような動物損傷モデルでは、からの寄与を含むプロセスに関与することができたすべての修復メディエーターの文脈で負傷に組織の反応を研究する機会があります血管系と神経系。しかし、experiを操作するには限界がありますインビボでの精神状態、それが継続的に時間をかけて、in vivoでの修復応答のイメージング研究を行うことがまだ可能ではありません。対照的に、そのようなスクラッチ傷のようなほとんどのインビトロ創傷修復培養モデルは、容易に操作することができ、経時的に追跡が、in vivoでの組織の創傷治癒を研究する環境的文脈を欠いています。 ex vivoでのモデルは、プロセスの任意の時点で修理の分子制御因子を調節する能力と結合し、細胞の微小環境のコンテキスト内で時間かけて連続的に損傷修復過程を研究するという利点を提供するが、これらに適合するいくつかのモデルが存在しますパラメータ。
ここでは、生理的創傷の上皮組織の応答を再現する文化を癒し、再現性の高いex vivoでの上皮の傷を生成する手順を説明します。組織源、 エクスビボ MOCとしてニワトリ胚のレンズを使用しましたk個の白内障手術が行われます。レンズは無血管、神経支配、および関連する間質18,19の自由ではない、それは自己完結型の厚い基底膜カプセル内にあるので、これらの研究のために使用するのに理想的な組織です。ヒト疾患において、白内障手術は、レンズの混濁による視力喪失に対処し、かつレンズの大部分を含むレンズ繊維細胞塊の除去を含みます。次の白内障手術のビジョンは、人工の眼内レンズを挿入することによって復元されます。白内障手術の手順は、繊維細胞を除去して、繊維細胞によって占有されていたレンズカプセルの後部領域の再上皮化することによって応答する各レンズ上皮における損傷応答を誘導します。白内障手術では、ほとんどの傷の修復反応のように、時にはレンズに事後Capsuとして知られている筋線維芽細胞の出現に関連する創傷治癒応答に異常な線維化の成果は、そこに発生しますル混濁20-22。白内障手術創傷治癒モデルを生成するには、白内障手術の手順は、生理学的損傷を生成するためにニワトリ胚の眼から取り出したレンズで模倣されます。レンズ上皮細胞に囲まれた非常に一貫性のある円形の創傷領域のレンズ繊維細胞の結果の顕微除去。この細胞集団は、しっかりとレンズの基底膜カプセルに取り付けられたままであり、外科的処置により負傷されます。上皮細胞は、リーダーセル1として修復プロセスで知られているビメンチン豊富な間葉細胞の集団が率いる傷を癒すために、内因性の基底膜の剥皮領域に移行します。このモデルでは損傷に対する上皮の応答が容易に可視化することができ、細胞の微小環境のコンテキスト内で経時的に追跡しました。細胞は、創傷修復に関与すると予想される分子の発現または活性化の変更に容易にアクセスできます。目の強力な機能モデルは分離し、創傷治癒の枠組みの中でマイグレーション固有の変化を研究する能力です。研究のために熟成一致エクスビボ創傷治癒培養多数を調製する能力は、このモデルの別の利点です。したがって、このモデル系は、創傷治癒プロセスに対するそれらの効果について、創傷修復のメカニズムと試験治療薬を離れていじめるするユニークな機会を提供します。 エキソビボモック白内障手術モデルは損傷修復のメカニズムを研究するための重要なリソースを提供し、幅広い適用性を有することが期待されます。
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Protocol
以下のプロトコルは、トーマス·ジェファーソン大学制度動物実験委員会のガイドラインに及び視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に準拠しています。
ex vivoで創傷文化用レンズの1セットアップと準備
- 無菌層流フード内で3 100ミリメートルペトリ皿を置きます。 RTで、途中トリス/デキストロース緩衝液を用いてペトリ皿を2つ（140ミリモルのNaCl、5mMの塩化カリウム、0.7ミリモルのNa 2 PO 4、5mMのD-グルコース、8.25 mMトリス塩基、HClで7.4にpHをTDバッファー）フィル、第三の空を残します。プレ暖かい培養培地（メディア199 1％L-グルタミンおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）37 O Cに
注： インビボで起こるように培養培地を、標準的な治癒創傷は、無血清です。しかし、創傷修復の培養物は、血清または他の因子を含む定義された培地条件で正常に成長させることができます。 - 肥沃な胚Dを削除しますAYインキュベーターから15白色レグホンニワトリの卵（穏やかに揺らしながら37.7℃に保持）
- 洗浄瓶からの層流フード、70％エタノールでシェルのきれいな外で選択された卵を置きます。滅菌溶液および器具を使用して、層流フード内で無菌条件下で、以下のすべての手順を実施しています。
- 空の100mmペトリ皿に卵と場所の内容を解読。標準鉗子と細かいハサミを使用して胚を刎ねます。 TDバッファーを含むペトリ皿にニワトリ胚の頭部を置き、適切に胚の残りを処分。必要に応じてもう15分より、短時間のTDバッファにニワトリ胚の頭を維持しません。
- シャーレの蓋にニワトリ胚ヘッドを配置します。高精度の鉗子を使用して、以下の順序で目からその添付硝子体液と一緒にレンズを取り外してください。目の奥に小さな開口部を作成するために、ピンセットで目の奥ピンチ。
- そして、W硝子体液を把握i番目の鉗子と穏やかローリング運動と硝子体に引っ張るが、取り付けられたレンズと硝子体が眼から追い出されます。 TDバッファを含む残りのペトリ皿に入れレンズ/硝子体。レンズは、もはやよりも30分間TDバッファに残ることを可能にします。
- 解剖顕微鏡下で新たなペトリ皿の蓋にレンズを移動します。この点以降は、解剖顕微鏡下にあるすべての手順を実行します。高精度なピンセットで慎重にレンズティッシュを傷つけないよう注意しながら、鉗子のエッジを使用してレンズを追い出された任意の毛様体（色素性細胞）を離れて磨きます。
注：毛様体の取り外しは、レンズに内因性ではない細胞タイプは、創傷修復培養に含まれていないことを保証します。 - 後方レンズカプセルとの関連から硝子体をピンチオフすることにより、高精度なピンセットで硝子体液からレンズを分離します。
- 高精度の鉗子を使用して、小滴の中にレンズを転送します35ミリメートルの組織培養皿でTDバッファ（約200μL）の。
2.実行モック白内障手術
- オリエント上に向け、レンズの前方側面に35mm皿でTDバッファのドロップでレンズ。
注：レンズの前面を簡単にレンズ上皮の前部と赤道域の境界を指摘し、組織内の密度の高いリングの存在によって同定されます。対照的に、水晶体線維細胞が結合している水晶体嚢の後部上のマークが存在しないことがあります。 - 二つの高精度なピンセットを使用すると、それぞれの手で1鉗子で組織を把持することにより、前方レンズカプセルの中心、レンズ組織を囲む厚い基底膜、及びそれに関連する前方レンズ上皮で小切開（約850μm）を作成し、静かに反対方向に引っ張ります。
- レンズ組織の大部分を構成する繊維細胞塊を、削除、dislodレンズ上皮にその添付ファイルからそれを銀杏、ハイドロ溶出（ 図1Aにモデル化された古典的な白内障手術に使用されるアプローチ）により、レンズカプセルを囲みます。
- TDバッファー300μlの27.5 G針の先端で1mlシリンジを埋めます。前部レンズカプセルに作られた切開部に針の先端を挿入し、ほぼ中間レンズへ。
- ゆっくりレンズ繊維細胞塊にTDバッファーを注入する注射器を押し下げます。 50〜200μlのTD、決して300以上μLを注入します。上皮およびレンズカプセルから自分自身を緩め繊維細胞塊を観察します。
- 高精度の鉗子を使用して、前方切開部位を介してレンズから緩め繊維細胞塊を除去。
注：この手順は、このサイトにちょうど隣接する繊維細胞が付着細胞を裸出されていたに後方レンズ基底膜カプセル、損傷した水晶体上皮を残します。
3. Preparinex vivoでの文化のためのG傷ついたレンズ
- カプセルバッグの前面に5つのカットをすることによって、培養皿上で、上記の白内障手術、細胞側を上にした結果、レンズカプセルバッグを平らに。
- レンズの赤道まで元の切開部位に垂直にカットします。ダウン培養皿カプセル側に取り付けられた上皮細胞面を上にして、レンズカプセルの合成5「フラップ」をフラット化。星や花のような形状（ 図1B参照 ）を取るべきである今ex vivoで負傷したレンズに注意してください。
- 星の各ポイントでピンセットでそっと下、皿にプレスをカプセルを保護することができます。これは、外植片の5つの最も外側の先端に小さなくぼみを作り、皿に持続的な添付ファイルになります。
注：この手順の間にカプセルを損傷することが可能であるので、それは、FLAの先端に近い皿にカプセルを確保することが重要ですできるだけPS、並びに可能なように固定ポイントの最小量を作るために（一般的に2つ、フラップごとに3つの最大）。 - 35ミリメートル皿からTDバッファを削除し、予め温めておいたメディアの1.5ミリリットルと交換してください。インキュベーター内でその蓋と場所（37℃、5％CO 2）で35ミリメートル皿をカバーしています。
嚢の創傷領域の再上皮化は、定量分析のために、水晶体上皮細胞の元の添付ゾーン（OAZ）から、発生セントラル移行ゾーン（CMZ）、の4分離。
注：細胞が傷害に反応してすぐにCMZ領域に移動し始めます。文化の中で初日によって十分な細胞は、マイクロ解剖23によるCMZとOAZの分離後、分子および生化学的解析のためCMZ全体に移行しています。このプロトコルは、カプセルの創傷領域から一度に1つのフラップ（OAZ）の除去を含みます。
- demarを観察カチオン、OAZとCMZの間、解剖顕微鏡下ではっきりと見える（ 図2A参照 ）。二つの高精度なピンセットを使用して、行のいずれかの側に、OAZ / CMZ線、他にちょうど隣接する一方の端部の両方鉗子で把持（ 図2A、B、矢印参照）。
- 片手を使用して、/ CMZの側に1つの鉗子は、一方/ピンセットで、優しくOAZ / CMZ線に沿ってOAZを引き出しながら、負傷した文化に保持し続けます。 CMZは、簡単にこの線に沿ってOAZから分離します。二つの領域が完全に分離されるまで、培養物全体の周りに、この線に沿って進みます。
- 例えば、ウェスタンブロットまたは免疫共沈降23,25のようなRNA-、配列24または生化学的解析などの分子解析のための分離OAZとCMZの分画を研究。
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Representative Results
エクスビボモデルは、細胞の天然の微小環境において創傷治癒過程を研究するために作成しました
細胞の天然の微小環境内の上皮の創傷治癒の調節に関与するメカニズムを調べるために、臨床的に関連するex vivoでの模擬白内障手術のモデルが作成されました。このモデルは、その固有の特性に起因する多くの利点を提供する水晶体組織から作成されます：1）レンズは、レンズカプセルと呼ばれる厚い基底膜に囲まれた自己完結型の器官です。 2）それは無血管性、3）神経支配されず、4）関連する間質の自由です。したがって、調べ修復プロセスは、適切なレンズに対する自然である細胞に限られています。このモデルを作成するには、レンズは、胚（E）15日目ニワトリ胚（ 図1A）から削除されます。小切開水晶体線維細胞の塊が除去され、それを通して前方水晶体嚢とその関連する水晶体上皮細胞で行われますハイドロ溶出、生理学的に関連する創傷（ 図1A）を作成する古典的な白内障の手順による。ビメンチン豊富な間葉修復細胞前駆体1のその内因性人口とともに、前方に沿って細胞と繊維細胞塊を囲むレンズカプセルの赤道側面の連続単層として存在するレンズ上皮は、中にレンズに残ります繊維細胞（ 図1A）の抽出。繊維細胞塊を除去した後、5カットは、水晶体嚢の前方側面に作られており、上皮は、媒体との対向、アップセル側を平坦化。この手順は、タイムラプス顕微鏡（ ビデオ1）を含む様々な顕微鏡のアプローチによって負傷した上皮の応答のイメージングを可能にします。前部レンズカプセルでこれらの追加削減はCENで繊維細胞塊を除去することによって作成された円形の傷で負傷レンズの星形の外植片を作成します外植片（ 図1B）のター。ポスト白内障手術や組織のフラット化は、負傷した上皮は元の添付ゾーン（OAZ）と呼ばれる星の点に位置している（ 図1A、B）。
後方水晶体嚢への付着部位から繊維細胞塊の除去は、負傷した上皮に囲まれ、基底膜上に再現性の高い創傷領域を作成します （ 図1B、C）。繊維細胞が付着された場所のすぐ隣接するレンズ赤道上皮の露出端は、創傷の先端です。直ちに損傷後の、ビメンチン豊富な間葉修復細胞の亜集団が活性化され、上皮1の傷の端に移動します。レンズ上皮は、その先端のこれらの間葉修復細胞で、急速に内因性Bの無細胞領域に移動しますasement膜カプセルは、中央の移行ゾーン（CMZ）は、創傷治癒を開始します。水晶体上皮細胞がシートとして、基材に沿って突起部を拡張し、創傷治癒過程（F igure 1D、ビデオ1）を導く間葉リーダーセル1、率いるCMZに、まとめて移動します。創傷治癒は、（ 図1C）培養物中で1日によって傷（67％）のかなりの面積をカバーし、進行し、そして典型的に培養物（ 図1B、C）3日以内に完了されます。
明確な物理的な区別はこの現象はでこれらの領域を分離することにより、ガイドラインを提供しています。これらの二つの領域（ 図2A、矢印）との間の折り目やしわのように区画され、早ければ1日目としてOAZとCMZの領域の間にすることができます創傷治癒プロセスの間の任意の時点。微細な先端鉗子を使用して、培養物をSEPARにマイクロ解剖することができますこれらの別個のゾーン（ 図2B）との間の分子の違いを分析するためにOAZとCMZ領域を食べました。これは、創傷修復に関連するマイグレーション固有の変更を識別するために使用されている強力なアプローチです。以前は、それが創傷治癒プロセスの間に5 エクスビボ負傷培養における焦点接着キナーゼ（FAK）の活性化の増加があることがわかりました。 FAKは、細胞遊走26-29で十分に確立された役割を有します。 CMZ対OAZを濃縮する能力は、今では可能なFAKの活性化の増加は、マイグレーション固有のCMZの領域に特異的であるかどうかを調べるために作られました。 （創傷治癒プロセスを通じて）3、FAKの活性化（FAK pY397）における生化学的変化について分析 - この研究のために、OAZとCMZの領域は、1日目に分離しました。結果は、FAKの活性化の増加は、マイグレーション固有のCMZ領域（ 図2C）と関連していたことを明らかにしました。ザここで説明したex vivoでのモデル系は、創傷修復プロセスの調整に関与する分子プログラムを調査する中で、ユニークで非常に貴重な機会を提供しています。
図1の生理的創傷に応答して細胞のネイティブの微小環境内の創傷治癒過程を研究する中でex vivoでモデルの作成 。モック白内障手術は、E15のひよこレンズで行いました。水晶体線維細胞塊（白色）はハイドロ溶出によって前嚢の切開部を介して除去されます。このプロセスは、細胞が傷（A）を癒すために移行します、その上にレンズカプセルおよび細胞剥皮基底膜（BM）にしっかりと付着したままの上皮細胞（緑）を残します。ファイブカットをex vivoでカルト平らにし、星形を作成するために、上皮に作られています URE（B）。スターポイントを満たす残留水晶体上皮細胞は、オリジナルアタッチメントゾーン（OAZ）（A、B）と呼ばれます。細胞が移動しますその上に剥皮BMが中央の移行ゾーン（CMZ）（A、B）と呼ばれています。直ちに損傷に応答して、細胞は、細胞裸化BM（B）にCMZ領域に移動し始めます。開いた創傷領域は（C）の経時定量します。創傷治癒は、典型的には、培養中のD3（B、C）によって完成されます。に（B、C）T0は創傷の時間を示し、D1-3は1-3日です。 CMZ内では、細胞の2つの集団は、基板（D）に沿って突出部を拡張レンズ上皮細胞および創傷縁に局在間葉リーダー細胞、区別することができます。この図は、Menko ら 23から復刻されています。ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
創傷治癒に関連付けられているマイグレーション固有の変更を識別するためOAZとCMZ領域の図2の分離。1日目では、OAZとCMZ領域を分離するためのガイドとして使用することができ、しわ（矢印）によって互いに区別することができますこれらの領域（A）。この折り目では、微細な先端鉗子はOAZ / CMZラインのエッジグリップに使用することができます。培養はOAZとCMZ領域（B）の単離を可能にする、この線に沿って分離することができます。顕微解剖毎日OAZとCMZのは、1日目（D1）から - 3日目（D3）FAKの活性化に移行固有の変更は、創傷修復の領域で発生するかどうかを決定するために実施しました。各領域からの溶解物は、FAKの活性化のいずれかのためのウェスタンブロット分析（pFAK Y39で調べました7）または全FAK式（C）。総FAKレベルにほとんど変化が観察されたが、FAKの活性化の増加は、マイグレーション固有のCMZ領域（C）と関連していました。
動画1. ex vivoでモック白内障手術モデルにおける創傷治癒は、損傷後の創傷領域の中心から見た3日目の創傷閉鎖までの時間0からタイムラプス顕微鏡が続いています 。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
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