Introduction
klinik olarak anlamlı, sahte katarakt cerrahisi, burada açıklanan ex vivo epitel yara iyileşmesi modeli bir yaralanma tepki olarak epitel dokuların onarımını düzenleyen mekanizmaları araştırmak için bir araç sağlamak için geliştirilmiştir. Bu modeli oluştururken için amaçlanmıştır Temel özellikler, yakından onarma işlemini bir kültür ayarı, 2), tamir düzenleyici unsurları modüle kolaylığı yaralama in vivo cevabı çoğaltılmış ve görüntü 3) yeteneği 1) sağlayan koşullar dahil gerçek zamanlı olarak bütünüyle içinde. meydan, bu nedenle, hücrelerin doğal mikroçevresinin, epitel yara onarımı incelemek mümkün olduğu bir kültür modeli oluşturmak ve işlemek için oldu. Bu yara onarım modelinin mevcudiyeti onarım sürecini düzenleyen matriks proteinleri, sitokinler ve kemokinlerin endojen sinyal ipuçları belirlenmesi için yeni olanaklar açar. Buna ek olarak, bir model incelenmesi için idealdir nasıln epitel yara alan 2,3, reepitelizasyonu için kolektif bir levha olarak ve yaralı epiteli 4 kolektif göç yönetmenlik işlev yara kenarında mezenkimal lideri hücrelerinin soy belirlemek için hareket edebilmektedir. Bu model de etkili yara iyileşmesini teşvik etmek ve anormal yara onarım 5 engelleyebilir terapötikleri belirlemek için bir platform sağlar.
Mevcut yara tamir modelleri bir dizi kültürü ve günümüzde yara onarım süreci hakkında bilinenlerin çoğu sağladı vivo, hem de zaten vardır. Böyle kornea 6-12 ve cilt 13-17 gibi hayvan modellerinde yaralanma, olarak, katkıları da dahil olmak üzere süreçte yer olabilir tüm tamir arabulucuların bağlamında yaralama doku yanıtını incelemek için fırsat var damarlar ve sinir sistemi. Ancak, bu deneyimlerden manipüle sınırlamalar vardırin vivo olarak zihinsel koşullar ve zaman içinde sürekli olarak, in vivo olarak onarım yanıtı görüntüleme çalışmaları yürütmek üzere henüz mümkün değildir. Bunun aksine, örneğin çizilmeye yara çok in vitro yara onarımı kültürü modelleri, kolayca manipüle edilebilir ve zaman içinde takip ancak in vivo dokusunda yara iyileşmesinin okuyan çevresel bağlamı yoksundur. Ex vivo modeller sürecinde herhangi bir zaman noktasında onarım moleküler regülatörleri modüle yeteneği ile birleştiğinde hücrelerin mikroçevresinin bağlamında zamanla sürekli yaralanma onarım işlemini okuyan avantajı sunarken, bu uygun birkaç model var parametreleri.
İşte fizyolojik yaralama bir epitel dokusunun yanıtını yeniden kültürleri şifa yüksek tekrarlanabilir ex vivo epitel yara oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Bir doku kaynağı, bir ex vivo moc olarak civciv embriyo lens kullanarakk katarakt cerrahisi yapılmaktadır. Lens avasküler, innerve ve eşlik eden stroma 18,19 serbest değil, o kendi kendine yeten bir kalın bazal membran kapsül içinde olduğundan bu çalışmalar için kullanılacak ideal bir dokudur. İnsan hastalıkta, katarakt cerrahisi nedeniyle lensin opasifikasyon için görme kaybı giderir ve lens toplu içermektedir lens fiber hücre kitlesinin, kaldırılmasını içerir. Aşağıdaki katarakt cerrahisi görme yapay göz içi lensi yerleştirilmesi yoluyla geri yüklenir. katarakt ameliyatı prosedürü, lif hücrelerinin çıkarılması, Fiber hücreleri tarafından işgal edilmiş olan mercek kapsülünün arka bölgenin yeniden epitelizasyon ile yanıt verir bitişik lens epitelyum, bir yaralanma tepkisini indükler. Katarakt cerrahisi, çoğu yara tamir yanıtları gibi, bazen lens Arka Capsu olarak bilinen miyofibroblastlar ortaya çıkması ile ilişkili yara iyileşmesi yanıt bir anormal fibrotik sonucunu ortaya çıkmaktadırle Opasitesi 20-22. Katarakt ameliyatı yara iyileşmesi modeli oluşturmak için, katarakt cerrahisi prosedürü fizyolojik bir yaralanma üretmek için civciv embriyo göz kaldırılır lenslerde taklit edilir. Mercek epitelyal hücreleri tarafından çevrelenmiş bir çok tutarlı dairesel bir yara bölgesinde lens elyaf hücrelerinin sonuçları Mikrocerrahi çıkarılması. Bu hücre popülasyonu sıkıca mercek bazal membran kapsüle bağlı kalır ve cerrahi prosedür ile yaralandı. epitel hücreleri lider hücreleri 1 olarak onarım sürecinde bilinen vimentin zengin mezenkimal hücre popülasyonu tarafından yönetilen yara, iyileşmek için endojen bazal membran arındırılır alan üzerine göç ederler. Bu model ile yaralanma bir epitel yanıtı kolaylıkla görülebilir ve hücrelerin mikroçevresinin bağlamında zamanla izledi. Hücreler ifadesi ya da yara iyileşmesi bir rol oynaması beklenmektedir moleküllerin aktivasyonu modifikasyonlara kolaylıkla temin edilebilir. Th bir güçlü özelliğiModel izole etmek ve yara iyileşmesi çerçevesinde göç özgü değişiklikleri incelemek için yeteneğidir olduğunu. çalışmalar için yaş uyumlu ex vivo olarak yara iyileşme kültürler çok sayıda hazırlanması için yeteneği, bu modelin bir diğer avantajdır. Böylece, bu model sistemi yara iyileşme süreci üzerindeki etkisi yara onarım mekanizmalarını ve test terapötik ayrı kızdırmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. ex vivo sahte katarakt cerrahisi modeli yaralanma tamir mekanizmaları çalışmak için kritik bir kaynak sağlayarak, geniş uygulama olması bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol Thomas Jefferson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Bildirimi ile uyumludur.
Ex Vivo Yara Kültür Lensler 1. Kurulum ve Hazırlık
- Steril, laminer akış başlığı içinde üç adet 100 mm petri kapları yerleştirin. Oda sıcaklığında, yarım Tris / Dekstroz tamponu ile petri kutularının iki (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.7 mM Na-2 PO 4, 5 mM D-glikoz, 8.25 mM Tris baz, HCI ile 7.4'e pH td tamponu) doldurun Üçüncü boş bırakarak. Ön sıcak kültür ortamı 37 o C ye (Ortam 199,% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş)
Not: in vivo meydana geldiği gibi kültür ortamı iyileşme, standart bir yara, serumsuz olduğu; Bununla birlikte, yara onarımı kültürleri serum ya da diğer faktörleri de tanımlanmış ortam koşullarında başarıyla yetiştirilebilir. - Bereketli embriyonik d kaldıray inkübatör 15 beyaz leghorn civciv yumurta (hafif hafif sallanarak 37.7 ° C'de tutulan)
- Bir yıkama şişesinden laminar akış çeker ve% 70 etanol ile kabuğun temiz bir dış seçilen yumurta yerleştirin. Steril çözümleri ve araçları kullanarak, laminer akış kaputu aseptik koşullarda aşağıda tüm prosedürleri yürütün.
- Boş 100 mm petri içine yumurta ve yer içeriğini Crack. Standart forseps ve ince makas kullanılarak embriyo başını kesmek. TD tampon içeren bir petri civciv embriyo baş koyun ve düzgün embriyonun geri kalan atmayın. İsteğe bağlı, 15 dakika daha uzun, kısa bir süre için TD tamponda civciv embriyo başlarını tutun.
- Bir petri kapağı üzerinde civciv embriyo başını yerleştirin. Yüksek hassasiyetli forseps kullanarak, aşağıdaki sırayla göz ekli vitreus ile birlikte lensi çıkarın. Gözün arkasında küçük bir açıklık oluşturmak için forseps ile gözün arka sıkıştırın.
- Sonra, w vitreus mizah kavramaki forseps ve yavaşça bir yuvarlanma hareketi ile vitreus römorkör, ekli lens ile vitreus göz yerinden edilecektir. TD tampon içeren kalan petri vitreus yerleştirin objektif /. Lensler artık 30 dakika için TD tamponu içinde kalmasına izin verir.
- Bir mikroskop altında yeni bir petri kapak lensi hareket ettirin. Bu noktada bir mikroskop altında tüm adımları uygulayın. Yüksek hassasiyetli forseps dikkatle mercek dokusuna zarar vermemeye dikkat alarak forseps kenarı kullanılarak lens ile yerinden edilmiş herhangi siliyer cisim (pigmentli hücreler) uzakta fırça ile.
Not: siliyer gövde çıkarılması lens endojen olmayan hücre tipleri, yara onarımı kültürü dahil olmasını sağlar. - Arka lens kapsülü ile dernekten vitreus vücudu kapalı kısma yüksek hassasiyetli forseps ile vitreus mercek ayırın.
- Yüksek hassasiyet kullanarak küçük bir damla içine lensi transferi forsepsbir 35 mm doku kültürü çanağı içinde TD tamponu (yaklaşık 200 ul).
2. Sahne Mock Katarakt Cerrahisi
- Yukarı bakacak şekilde lensin ön yönü ile 35 mm çanak TD tampon damla lensi yönlendirin.
Not: merceğin ön kolay lens epitelyum ön ve ekvator bölgesi arasındaki sınır notlar dokuda yoğun halkasının mevcudiyeti ile tanımlanır. Bunun aksine, mercek elyaf hücrelerinin bağlı olduğu mercek kapsülünün arka işaretlerin yokluğu vardır. - , Her el bir forseps ile doku tutarak iki yüksek hassasiyetli forseps ön lens kapsülü, objektif dokusunu çevreleyen kalın bazal membran ve ilişkili lens ön epitel merkezinde küçük bir kesi (yaklaşık 850μm) yapmak kullanma ve yavaşça karşıt yönlerde asılarak.
- Lens dokusu, dislod kısmını oluşturan lif hücre kütlesi, KaldırLens epitel eklerinde onu ging ve (Şekil 1A modellenmiş klasik katarakt cerrahisinde kullanılan bir yaklaşım,) hidro-elüsyon lens kapsülü çevreleyen.
- TD tampon 300 ul bir 27.5 g bir iğne ucu ile bir 1 ml şırınga doldurun. Anteryor mercek kapsülünün yapılan kesi içine iğne ucu yerleştirin ve yaklaşık yarım lens içine.
- Yavaşça mercek fiber hücre kitlesinin içine TD tampon enjekte şırınga basınız. 50 ila 200 ul TD, ve asla fazla 300 ul enjekte edilir. Epitel ve lens kapsülünün kendisini gevşeterek lif hücre kütlesi gözlemleyin.
- Yüksek hassasiyetli forseps kullanarak, ön kesi sitesi aracılığıyla objektiften gevşetti lif hücre kütlesi kaldırın.
Not: Bu yordam, bu siteye sadece komşu lif hücreleri ekli hücrelerin soyulmuş edilmişti posterior lens bazal membran kapsülü ve bir yaralı lens epitel bırakır.
3. PreparinEx Vivo Kültür g Yaralı Objektif
- Kapsül çanta ön yüzünde beş kesim yaparak, kültür tabağına yukarıda açıklanan katarakt cerrahisi, hücre tarafı yukarı kaynaklanan objektif kapsül çanta düzleştirin.
- Lensin ekvatora kadar orijinal kesi dik kesin. Aşağı kültür çanak kapsül tarafında takılı epiteli hücre tarafı yukarı ile mercek kapsülünün sonuçtaki beş "flep" dümdüz. Bir yıldızın ya da flowerlike şekli (Şekil 1B bakınız) almalı şimdi ex vivo yaralı lensi unutmayın.
- Yıldızın her noktada usulca aşağı forseps ile, çanak basın kapsülü sabitlemek için. Bu eksplant beş en dış ucunda küçük bir girinti yapmak ve yemek için sürekli eki neden olur.
Not: Bu işlem sırasında kapsül zarar mümkündür ve böylece fla uçlarına yakın çanak kapsülü sabitlemek için önemlidirmümkün olduğunca PS yanı sıra mümkün olduğunca emniyet noktalarının en az miktarda yapmak için (genellikle iki, flep başına üç maksimum). - 35 mm çanak TD tamponunu çıkarın ve önceden ısıtılmış ortam 1,5 mi ile değiştirin. Inkübatör, kapağı ve yer ile 35 mm çanak Kapak (37 ° C,% 5 CO2).
Arka Kapsül Yaralı Alanı Yeniden epitelizasyon Kantitatif Analiz Lens Epitel Hücreleri Orjinal Ek Zonu (OAZ), dan, oluşuyor Orta Göç Bölgesi (CMZ), 4. ayrılması.
Not: hücreler, hasara tepki olarak, hemen CMZ bölgeye doğru hareket etmeye başlar. Kültürde günden yeterince hücrelerin mikro diseksiyon 23 ile CMZ ve Oaz ayrılması sonrasında, moleküler ve biyokimyasal analiz için CMZ genelinde göç vardır. Bu protokol, kapsülün yaralı bölgeden bir seferde bir kanat (OAZ) kaldırılmasını içerir.
- Bir Demar gözlemleyinkatyondur, OAZ ve Cmz arasında mikroskop altında açıkça görülebilir (Şekil 2A). İki yüksek hassasiyetli forseps kullanılarak, çizginin her iki tarafında, OAZ / CMZ hattı, başka bir hemen yanında bir kenarına, her iki forseps ile kavramak (Şekil 2A, B, ok).
- Bir elinizi kullanarak / CMZ tarafta bir forseps Öte yandan / forseps ile yavaşça OAZ / CMZ hattı boyunca Oaz çekerken, yaralı kültüre tutunmaya devam ediyor. CMZ kolayca bu hat boyunca Oaz ayrılır. Iki bölge tamamen ayrılır kadar tüm kültür etrafında bu çizgi boyunca devam edin.
- Örneğin Western blot veya ko-immünopresipitasyon 23,25 gibi RNA Dizi 24 veya biyokimyasal analizler gibi moleküler analiz için ayrıldı OAZ ve CMZ fraksiyonlar incelenmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex Vivo Model hücrelerin doğal mikroçevresinin yara iyileşme sürecini incelemek için oluşturulan
Hücrelerin doğal mikroçevresinin içinde epitel yara iyileşmesini düzenleyen katılan mekanizmalarını araştırmak için, klinik olarak anlamlı ex vivo sahte katarakt cerrahisi modeli oluşturuldu. Bu model nedeniyle yapısal özellikleri konusunda pek çok avantajlar sunmaktadır mercek dokularından oluşturulur: 1) objektif mercek kapsülü olarak adlandırılan kalın bir taban zan ile sarılmış bir kendi kendine yeten bir organdır; 2) avasküler, 3) innerve değil ve 4) ilişkili stroma ücretsizdir. Bu nedenle, incelenen onarım işlemi uygun bir lens doğuştan olan hücreler ile sınırlıdır. Bu modeli oluşturmak için, lenslerin bir embriyonik (E) gün 15 civciv embriyo (Şekil 1A) çıkarılır. Küçük bir kesik lensi elyaf hücre kütlesi çıkartıldığı anterior mercek kapsülü ve ilişkili mercek epitelyal hücreleri yapılırhidro-elüsyon, bir fizyolojik olarak ilgili yaralama (Şekil 1A) oluşturur klasik katarakt hazırlandı. vimentin zengin mezenkimal onarım hücre atalarıdır 1 endojen nüfusu ile birlikte fiber hücre kütlesi, çevredeki ön boyunca hücre ve mercek kapsülünün ekvatoral yönlerini sürekli tek tabaka olarak mevcut lens epiteli, sırasında lens kalır Lif hücrelerinde (Şekil 1 A) ile tedavi edilmiştir. Fiber hücre kitlesinin çıkarılmasından sonra, beş keser mercek kapsülünün anteryor açıdan yapılır ve epitel orta bakan kadar hücre tarafı düzleştirilmiş. Bu prosedür time-lapse mikroskobu (Video 1) dahil olmak üzere çeşitli mikroskobik yaklaşımlar, tarafından yaralanan epitel yanıt görüntüleme sağlar. Ön mercek kapsülünde Bu ek kesintiler cen fiber hücre kütlesini kaldırarak tarafından oluşturulan sirküler yara ile yaralı lensin bir yıldız şekilli eksplant oluşturmakeksplant (Şekil 1B) ter. Post-katarakt cerrahisi ve doku düzleşmesi, yaralı epitel Orijinal Ek Bölge (OAZ) olarak adlandırılır yıldız, noktalarında bulunan (Şekil 1A, B).
arka mercek kapsülünün üzerindeki eki sitesinden lif hücre kitlesinin kaldırılması yaralı epiteli ile çevrili bazal membran üzerinde bir yüksek tekrarlanabilir yara alanı yaratır (Şekil 1B, C). Lif hücreleri ekli nerede sadece komşu lens ekvator epitel maruz kenarı, yara öncü olduğunu. Hemen yaralanmasından sonra, vimentin zengin mezenkimal onarım hücrelerin bir alt devreye girer ve epiteli 1 yara kenarına geçirir. Lens epiteli, bunların ön kenarda, bu mezenkimal onarım hücreleri ile, hızlı bir şekilde, endojen b hücresiz bölge üzerine hareket ederasement membran kapsül, Orta Göç Alan (CMZ), yara iyileşme başlayacak. Lens epitel hücreleri substrat boyunca uzantılar uzatmak ve yara iyileşme sürecini doğrudan mezenkimal hücreler lideri 1 liderliğindeki CMZ içine bir yaprak gibi, topluca hareket (F 1D, Video 1 ŞEKIL). Yara iyileşmesi kültür 1 gün yaraya (% 67) (Şekil 1C) önemli bir alanı kapsayan ilerledikçe, ve tipik olarak kültür içinde 3 gün (Şekil 1B, C) içinde tamamlanır.
Net bir fiziksel ayırım gibi erken bu iki bölgeye (Şekil 2A, ok) arasında bir kırışık veya buruşukluk olarak çizilmiş günden 1 olarak OAZ ve CMZ bölgeler arasında yapılabilir. Bu olgu olarak bu alanları ayırmak için bir kılavuz sağlar Yara iyileşme sürecinde herhangi bir nokta. Ince uçlu forseps kullanarak, kültürler Separ mikro-disseke olabilirBu farklı bölgelerde (Şekil 2B) arasındaki moleküler farklılıkları analiz etmek için OAZ ve CMZ bölgelerini yedik. Bu yara onarımı ile ilişkili göç özgü değişiklikleri tanımlamak için kullanılır olmuştur güçlü bir yaklaşımdır. Daha önce, bu işlem, 5 yara iyileşmesi sırasında ex vivo olarak yaralı kültürlerde Fokal Adezyon Kinazı (FAK) aktivasyonunda bir artış olduğu bulunmuştur. FAK, hücre göçü 26-29 bir köklü bir role sahiptir. CMZ şimdi FAK aktivasyonu bu artış göç özgü CMZ bölgeye özgü olup olmadığını incelemek mümkün kılan vs yeteneği Oaz için zenginleştirmek için. (Yara iyileşmesi süreci boyunca) 3 ve FAK aktivasyonunun (FAK pY397) biyokimyasal değişiklikler için analiz - Bu çalışma için, OAZ ve CMZ bölgeleri 1 gün ile ayrılmıştır. Sonuçlar FAK aktivasyonunun artışı geçiş spesifik CMZ bölgesi (Şekil 2C) ile ilişkili olduğunu göstermiştir.Burada anlatılan ex vivo model sistem yara onarım işlemini koordine rol oynayan moleküler programları araştırmak için benzersiz bir ve değerli bir fırsat sunuyor.
Şekil 1. fizyolojik yaralama yanıt hücrelerin doğal mikroçevresinin içindeki yara iyileşme sürecini incelemek için bir ex vivo modelin oluşturulması. Mock katarakt cerrahisi E15 civciv lensler üzerinde gerçekleştirildi. Lens elyaf hücre kütlesi (beyaz) hidro-elüsyon ile anteryor kapsülün bir kesi aracılığıyla çıkarılır. Bu süreç mercek kapsülünün ve hücreler yara (A) iyileşmek için göç edecek olan üzerine bir hücre soyulmuş bazal membran (BM) sıkıca yapışık kalır epitel hücreleri (yeşil) geride bırakıyor. Epiteline yapılan Beş keser dışarı dümdüz ve biçimli ex vivo kült bir yıldız oluşturmak için ure (B). yıldız noktalarının dolgu bakiye mercek epitelyal hücreleri özgün ekleme bölgesinin (OAZ) olarak ifade edilir (A, B). Hücreler Orta Göç Bölgesi (CMZ) olarak adlandırılır göç edecek olan üzerine soyulmuş BM (A, B). Hemen yaralanmaya yanıt olarak hücreler, hücre soyulmuş Kriter (B) CMZ bölgeye hareket etmeye başlar. açık yara alanı (C) 'de zaman içinde ölçülür. Yara iyileşmesi genellikle kültür (B, C) D3 tamamlanır. (B, C) T0 yaralama zamanı işaret eder olarak, D 1-3 gün 1-3 anlamına gelir. Cmz içinde, hücrelerin iki popülasyonu, alt-tabaka (D) boyunca uzantıların uzanan mercek epitelyal hücreleri ve yara kenarına lokalize mezenkimal lideri hücreleri ayırt edilebilir. Bu rakam Menko ark 23 den yeniden basıldı.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OAZ ve CMZ bölgelerin Şekil 2. Ayırma yara iyileşmesi ile ortaya çıkan geçiş spesifik değişiklikleri tespit etmek., OAZ ve CMZ bölgeleri birbirinden ayırt edilebilir günde 1 ile ayrılması için bir kılavuz olarak kullanılabilir bir kırışık (ok) ile Bu bölgeler (A). Bu bağlantı yeri olarak, ince uçlu forseps kavrama OAZ / CMZ hattının kenar kullanılabilir. Kültür OAZ ve CMZ bölgeleri (B) 'nin izolasyonu sağlayan, bu çizgi boyunca ayrılabilir. Mikro-diseksiyon günlük Oaz ve CMZ bölgesinin günde 1 (D1) den - günlük 3 (D3) FAK aktivasyonu göç özgü değişiklikler yara tamir bölgesinde meydana olmadığını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Her bir bölgeden Lizatlar FAK aktivasyonunun ya da Western blot analizi (pFAK Y39 ile incelendi7) veya toplam FAK ifadesi (C). Toplam FAK düzeylerindeki küçük bir değişiklik gözlenmiştir birlikte, FAK aktivasyonunun bir artış geçiş spesifik CMZ bölgesinde (C) ile ilişkili bulunmuştur.
Video 1 ex vivo sahte katarakt cerrahisi modelinde Yara iyileşmesi yaralanma sonrası yara alanının merkezine bakıldığında gün 3. Yara kapatılması yoluyla zaman 0 dan time-lapse mikroskobu ile takip edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
- Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).
- Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds. Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).
- Sherrard, E. S. The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma. Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).
- Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).
- Escamez, M. J., et al. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).
- Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse. The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).
- Tarin, D., Croft, C. B. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships. Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).
- Croft, C. B., Tarin, D. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour. Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).
- Winstanley, E. W. The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog. Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).
- Wormstone, I. M., Wride, M. A. The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K.
- Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).
- Walker, T. D. Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review. Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).
- Schmidbauer, J. M., et al.
- Menko, A. S., et al. A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium. Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).
- Chauss, D., et al. Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens. G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).
- Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).
- Sieg, D. J., et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).
- Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration. Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).
- Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion). IUBMB life. 53, 115-119 (2002).
- Zhao, X., Guan, J. L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis. Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).
- Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury. Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Ferguson, M. W., O'Kane, S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).
- Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).
- Nodder, S., Martin, P. Wound healing in embryos: a review. Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
