Summary
Her presenterer vi en protokoll for å syntetisere nye, high-sideforhold biocomposites under biologiske forhold og i flytende medier. De biocomposites skalere fra nanometer til mikrometer i diameter og lengde, henholdsvis. Kobber nanopartikler (CNPs) og kobbersulfat kombinert med cystin er de viktigste komponentene for syntesen.
Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive syntesen av to nye biocomposites med høy sideforhold strukturer. De biocomposites består av kobber og cystin, med enten kobber nanopartikler (CNPs) eller kobber bidrar den metalliske komponent. Syntesen utføres i flytende under biologiske betingelser (37 ° C) og selv-sammensatte kompositter formen etter 24 timer. Når dannet, disse kompositter er svært stabil i både flytende medier og i tørket form. Komposittene kalk fra nano- i mikro- varierer i lengde, og fra noen få mikron til 25 nm i diameter. Feltemisjons-scanning elektronmikroskopi med energi dispersive røntgenspektroskopi (EDX) viste at svovel var til stede i NP-avledede lineære strukturer, mens det var fraværende fra utgangs CNP materialet, noe som bekrefter cystin som kilde for svovel i slutt nanokompositter . Under syntese av disse lineære nano- og mikro kompositter, et variert utvalg av lengder på structures er dannet i-syntese-karet. Sonikering av den flytende blanding etter syntese ble påvist å hjelpe til i å kontrollere midlere størrelse av konstruksjonene ved å redusere den gjennomsnittlige lengde med øket tid for lydbehandling. Siden de dannede strukturene er meget stabile, ikke agglomererer, og er dannet i væskefase, kan også sentrifugering brukes til å hjelpe med å konsentrere seg og segregere dannet kompositter.
Protocol
1. Planlegging av eksperimenter
- Bestemme volumet av kobber nanokompositter som er nødvendig for syntese. På denne bakgrunn velger en rekke små volum kolber (25 cm 2), eller større kolber som angitt nedenfor i utarbeidelsen av materialer.
- For denne syntese, bruker et 37 ° C inkubator med 5% CO2, og minst 40% fuktighet. Sørg for at en slik inkubator er tilgjengelig, og at det ikke vil bli flere ganger forstyrret over en periode på syntese (ca. 24 timer).
FORSIKTIG: Gjentatt åpning og lukking av inkubatoren vil sikkert føre til temperatursvingninger som kan resultere i endret syntese av nanocomposite strukturer.
2. Utarbeidelse av Materials
- Forbered alle materialer frisk før starten av et eksperiment, ved å legge solide materialer mot løsemidler rett før syntese er å begynne. Holde stamløsninger av cystin og kobber utgangsstoffer i flytende i lange tider before eksperimentet ikke er anbefalt og kan føre til variable resultater. Når åpnet fra leverandøren, holde utgangsmaterialer tørre ved å pakke toppen av beholderen med Parafilm.
Merk: Den følgende protokoll benyttes som et eksempel for reaksjon i en 25 cm2 cellekulturflaske ved bruk av 7 pl av cystin, 6643 pl sterilt vann, og 350 ul av CNPs. - Forbered en 2 mg / ml løsning av kobber nanopartikler ved å veie ut minst 2 mg CNPs. Bruk engangshansker under dette trinnet for å hindre mulig kontakt mellom CNPs med huden. Plasser nanopartikler i en tom steril 16 ml hetteglass.
- Til flasken inneholdende CNPs, tilsett sterilt deionisert vann i passende mengde for å lage en 2 mg / ml oppløsning og virvle oppløsningen i 20 sekunder for å tilveiebringe dispersjon av nanopartikler før syntese starter (minst 1 ml total volum anbefales). Ikke fyll flasken mer enn halvveis med vann da dette vil hemme blanding av virvling. CNPs will raskt bosette til bunnen av flasken og vil vises mørk i fargen (grå til svart).
- Sonikere CNP løsningen for 17 minutter ved romtemperatur for å gi maksimal dispersjon av CNPs før starten av syntesen. Kontroller med jevne mellomrom for å være sikker på at CNPs blander grunn lydbehandling. Etter en vellykket sonikering, CNPs forbli suspendert i løsning i minst 30 minutter, og oppløsningen blir mørk i farge.
- Vei opp tilstrekkelig masse av cystin å lage en 72,9 mg / ml oppløsning av syntesen. Siden cystin ikke er direkte løselig i vann, plasserer veide cystin i en antistatisk veiebeholder.
- Til veiebeholder inneholdende cystin, tilsett tilstrekkelig volum av steril, 1 M NaOH, slik at cystin fullstendig i oppløsning. For eksempel oppløses 7,29 mg cystin helt i 100 ul av 1 M NaOH, for å lage en 72,9 mg / ml oppløsning.
- For å opprettholde sterile forhold, å utføre dette trinnet i et sterilt strømnings vevskultur hette.
FORSIKTIG: NaOH1 M konsentrasjon er etsende, så bruke engangshansker under dette trinnet for å forhindre kontakt med konsentrert NaOH med hud
- Å arbeide i et sterilt vevskultur hette, tilsett 7 mL av cystin med 6643 mL sterilt vann til det sterile syntese kolben først, og la inkuberes i 30 minutter i inkubator ved 37 ° C med kolben utluftet hetten (løs) for å gi effektiv blanding. Resuspender 2 mg / ml løsning CNP ved å virvle i 30 sekunder, ettersom CNPs vil ha avgjort etter sonikeringstrinn.
- Tilsett tilstrekkelig CNP løsning syntesen kolbe (ved bruk av steril teknikk) for å opprettholde de følgende komponentforhold: kombinere en deler cystin, 50 deler CNPs, og 949 deler sterilt vann i en 25 cm2 cellekulturkolbe for å starte syntesen. For eksempel, for en 7 ml syntese volum, kombiner 7 ul av stamløsningen cystin, 350 ul CNPs og 6643 ul sterilt vann. Sett lokket på flasken og stram slik at det er sikke.
- Etter at en kombinasjon av alle komponenter for syntesen, bland forsiktig i kolben ved å svinge 4-5 ganger. Plasser flasken i CO 2 inkubator og luft i kolben ved å løsne lokket, slik at det blir gassutveksling i og ut av kolben i løpet av syntesen.
- Tillat syntese til å kjøre i kuvøse for ca 24 timer. Under syntesen, kan man observere, med mikroskopi og ved øyet, dannelse av sterkt lineære kompositter.
Merk: prosessen med dannelsen av strukturene kan skje plutselig i den forstand at strukturer er i utgangspunktet vanskelig å oppdage, så utseende fortsetter raskt økende tetthet. Formasjonen kan derfor forekomme før tjuefire timer. Prosessen kan også bli observert av øyet når strukturer blitt større og deres tetthet øker. Mens generering av strukturene kan observeres over tid under mikroskop og ved øyet ved senere tidspunkter kontinuerlig å avbryte syntesebetingelser og temperatur vil føre til dårligsyntese resultater. - Avslutte syntesen av biocomposites ved tett tildekking syntese kolben og lagring av beholderen i et kjøleskap (4 ° C). Strukturer, en gang generert, holder seg stabile i denne formen for minst ett år. Etikett kolben med syntesebetingelser, herunder komponenter som benyttes, dato for syntesen, og inkubasjonstiden for syntesen før terminering.
3. Synthesis Bruke Kobber sulfat
- Gjennomføre selvbygging syntese ved å erstatte CNPs med kobbersulfat salt. Ved å bruke steril teknikk, oppløse i det minste 2 mg kobbersulfat i tilstrekkelig volum av sterilt avionisert vann for å lage en 2 mg / ml oppløsning. Det kobbersulfatkrystaller lett gå i oppløsning ved denne konsentrasjonen, men vortex ampullen om nødvendig, og ved å inspisere øye for å sikre at alle krystallene oppløst.
- Etter fremstillingen av kobbersulfat, gjennomføre syntese som tidligere beskrevet, men ved å erstatte CNPs med kobbersulfat.
Merk: Selv montert nanocomposites med kobbersulfat som utgangsmateriale ble funnet å være mye mer konsekvent i endelig form enn for strukturer syntetiserte fra CNPs. - Avslutte syntese av kobber sulfat biocomposites som for CNP kompositter (trinn 2.6) og lagre dem på lang sikt ved 4 ° C.
4. Karakterisering og håndtering av biocomposites Post-syntese
- Karakter biocomposites avledet fra CNPs og fra kobbersulfat av hvitt lys mikros 9 og ved elektronmikroskopi 9.
- For karakterisering og kontroll av biocomposites post-syntese ved hvitt lys-mikroskopi ved å bruke et invertert mikroskop som kompositter vil legge seg på bunnflaten av flasken i løpet av få minutter etter legging kolben flate, og kan deretter bringes i fokus. Bruk lyse feltet innstillingen på mikroskop for å maksimere kontrast mellom biocomposites og flytende medium. Kompositter avledet fra CNPs og copper sulfat vil både vises klart til ugjennomsiktig i farger, men ikke omsatte CNP aggregater vil vises veldig mørk i fargen.
- Bruke et digitalt kamera koblet til mikroskop for å ta bilder av kompositter. Et utvalg av lengder for de enkelte strukturene vil bli observert.
- For karakterisering og kontroll av biocomposites post-syntese, og etter lagring ved 4 ° C, lar kolber til å komme til romtemperatur i minst 15 min kolber som vil danne kondens i første omgang etter fjerning fra kjøleskapet, som vil skjule effektiv fokusering under utførelse av mikros imaging. Etter at likevekt til romtemperatur, tørke den øvre og nedre overflater av kolben med et rent papirhåndkle for å maksimere mikrosbildekvalitet.
- Når du arbeider med eller bilde kompositter som er lagret langsiktig, vortex Kolben i 30 sek å distansere klumper av kompositter som danner mens i kjøleskapet. Etter virvling, inspisere strukturer med en omvendt microscope å sikre at aggregater er dissosiert, og gjenta vortexblanding som nødvendig.
- Bruk invertert hvitt lys mikroskopi for å vurdere effekten av syntesen for et gitt eksperiment ved hjelp CNPs. For eksempel, dokumentere tilstedeværelse eller fravær av ureagert CNPs i syntese kolber som brukes for CNP-avledede biocomposites fra kolber med forskjellige parametre som tid for syntese.
Merk: Individuell CNPs er for små til å observere med et lysmikroskop, men ikke omsatt CNP aggregater vil fremstå som round-form og mørke objekter, i motsetning til de vellykket syntetiserte CNP-kompositter som vil ha en høy-sideforhold, lineær form, og vil ha en rekke forskjellige lengder. Unngå å utføre syntese for lenge i en periode før avslutning, da dette vil resultere i høyt forgrenede "bolle" type strukturer, som er vanskelige å dispergere i individuelle strukturene når dannet. - Bruk invertert hvitt lys mikroskopi for å vurdere effektenav syntesen for et gitt eksperiment ved bruk av kobbersulfat. Siden kobbersulfat går helt i oppløsning ved bruk av denne protokollen vil løsningen synes å være mindre enn den mørke løsningen fra syntesen ved anvendelse CNPs. Dokument størrelsen og utstrekningen kobbersulfat kompositter ved å sammenligne kolber med forskjellige syntesebetingelser som tid for syntese før terminering.
Merk: vellykket syntetisert kompositter viser en rekke forskjellige lengder. Unngå å utføre syntese for lenge i en periode før avslutning, da dette vil resultere i høyt forgrenede aggregater av kompositter, og noen av disse vil være "bollelignende" struktur, og som er vanskelige å dispergere i individuelle strukturene når dannet .
- For karakterisering og kontroll av biocomposites post-syntese ved hvitt lys-mikroskopi ved å bruke et invertert mikroskop som kompositter vil legge seg på bunnflaten av flasken i løpet av få minutter etter legging kolben flate, og kan deretter bringes i fokus. Bruk lyse feltet innstillingen på mikroskop for å maksimere kontrast mellom biocomposites og flytende medium. Kompositter avledet fra CNPs og copper sulfat vil både vises klart til ugjennomsiktig i farger, men ikke omsatte CNP aggregater vil vises veldig mørk i fargen.
- Å konsentrere biocomposites post-syntese, sentrifuger løsninger av kompositter i et sentrifugerør. Tilsett 6 ml av enten CNP-avledede strukturer eller kobbersulfat-avledede strukturer til et 15 ml sentrifugerør. -Sentrifuge i 10 minved 500 xg ved romtemperatur for å danne en pellet. For mindre volumer, tilsett 500 mL av strukturer i løsningen på 0,6 ml store rør. Sentrifuger ved 2000 xg ved romtemperatur i minst 10 min for å danne en pellet.
- Etter sentrifugering i tilstrekkelig tid (minst 10 min for microfuges), lagre den observerbare pellet på bunnen av røret, hvor strukturene er konsentrert ved å forsiktig fjerne den overliggende væske over pelleten. Biocomposite strukturer som stammer fra kobbersulfat vises blå i fargen og strukturer som stammer fra CNPs er mørkere (grå til svart).
- Legg flere kompositter til dette røret, og gjenta prosessen i samme rør til å konsentrere strukturer hvis ønskelig. Å spre konsentrerte pellets, legge til ønsket volum av løsningen på røret, og vortex i 10-30 sek.
- Sonicate strukturer gang dannet, for å flytte den gjennomsnittlige befolkningsstørrelse (lengde) av strukturene til lavere verdier. Plasser strukturer i sterilt avionisert vann og sonicate for på least 10 min. Ved hjelp av denne prosessen, over tid, strukturer bli fragmentert og mindre i gjennomsnittlig lengde (se figur 6 i teksten). Dokumentendringer i kompositt størrelser med ulike ultralyd ganger med en invertert hvitt lys mikroskop og digitale kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skjematisk flytdiagram av syntesefremgangsmåten for å danne de lineære biocomposites som er beskrevet i dette arbeidet. CNPs eller kobbersulfat som utgangsmaterialer er kombinert med sterilt vann for å danne en 2 mg / ml oppløsning, blandes denne løsningen, og ultralydbehandlet for å gi en jevn blanding, og denne kobberløsningen blir deretter blandet i følgende forhold for syntese: 949 deler steril vann: 50 deler kobber blanding: en del cystin stamløsning. De faktiske mengder kan økes eller minskes i henhold til disse forhold for å skalere opp eller nedskalere den endelige synteseutbyttet. Etter inkubering i minst 2 timer som er angitt, er lineære biocomposite strukturer dannes som over tid kan iakttas ved vanlig hvitt lys-mikroskopi eller ved øyet som flytende oppløsning endringer i utseendet.
Figur 2 viser et representativt resultat fra den første oppdagelsen av disse lineære strukturer i fullstendig cellekulturmedier over en periode på 82 timer. Våre laboratorie utførte vurdering av den potensielle toksisitet av forskjellige nanomaterialer, deriblant CNPs på normale celler og kreftceller, og cellene som er vist i figur 2 er en raskt voksende hjernetumorcellelinje fra ATCC (CRL-2020). En viktig supplement til den fullstendige media som brukes for disse cellene er cystin, som viste seg å være den avgjørende komponent for å oppdagelsen av at disse lineære strukturer ble dannet i kulturene (se nedenfor og diskusjon avsnitt). Fra en innledende enda dispersjon av CNPs som raskt samlet inn i mikrostrukturene (figurene 2A og 2B), over tid, de mindre partiklene er fjernet og større aggregater dannes (figurene 2C og 2D). Endelig større aggregater med fine lineære strukturer vises i samme brønnene (figur 2E-H), som danner den "bolle" type strukturer som tidligere er rapportert i litteraturen ved bruk av ikke-Biological metoder seks. Sammenligning av de siste to tidspunkter, ved 69 og 82 timer (figurene 2G og 2H, henholdsvis), viser at utvikling av store bollelignende strukturer fortsatt ganske stabil, som indikert med CCD de samme felt.
For å forklare hvorfor disse bollelignende strukturer under disse forholdene i cellekulturer ble observert, begynte vi å eliminere media komponenter for å avgjøre om de grunnleggende elementene kunne isoleres. Vi har oppdaget at en viktig komponent og supplement til cellekulturmedia var cystin, som ved prosessen med eliminering slutt ble identifisert som en essensiell komponent for selvbygging prosess. Ved å forenkle syntese komponenter (se figur 1), kan vi til slutt danne høyt sideforhold (lineær) strukturer i væske, som kan bli vist over tid for å transformere fra nanopartikkel formen til lineær form, uten behov for celler, eller en hvilken som helst av den andre cellenkomponenter kultur (Figurene 3A-C).
Figur 4 viser karakteriseringen av de påviste nye strukturer ved hjelp av elektronmikroskopi, inkludert et transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bildeopptaksnanopartikkelutgangsmaterialet og danner lineære nanostrukturer (figur 4A). Representative scanning-elektronmikroskopi (SEM) bilder er vist for utgangsmaterialet CNPs, lineære strukturer dannet fra NPS, og lineære strukturer dannet fra kobbersulfat utgangsmaterialet (figurene 4B-F, respektivt).
Å verifisere at biocomposites inneholdt cystin eller cystin-avledet materiale som en viktig biologisk komponent av kompositter ble dannet strukturer analysert ved hjelp EDX med SEM mikroskopi. Representative skjermbilder fra analysert materiale er vist i figur 5. Viktigere, når man sammenligner CNPs og biocomposites fra CNPs, en fremtredendesvovel topp vises (Figur 5B), som ikke er tilstede i CNP utgangsmaterialet (figur 5A). For biocomposites med kobbersulfat som utgangsmateriale (figur 5C), karbon og nitrogen topper synes (figur 5D), som er i overensstemmelse med tilstedeværelsen av cystin for denne biocomposite.
På denne tiden, har en fremgangsmåte for å styre lengden og størrelsen av kompositter under syntesen ikke blitt identifisert. Imidlertid, for å undersøke om gjennomsnittlig størrelse av strukturer kan styres etter syntese, ble lineære biocomposites sonikert i forskjellige tidsperioder, som vist i figur 6. Med økt tid av sonikering, ble det vist at den gjennomsnittlige størrelsen av de lineære biocomposites redusert, så vist ved lysfelt-mikroskopi (figurene 6A-D). Som en metode for konsentrering og segregere dannet kompositter, sentrifugering kan anvendes, og som vist i figurene 6E-G, Kan en synlig pellet utvikles avhengig av volum og sentrifugeringskrefter brukt.
Figur 1. Representant flytskjema for syntese utforming Cu NPS = kobber nanopartikler.; Cys = cystin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative dannelsen av kobber biocomposite strukturer i hjernetumorcellekulturer med fullstendig cellekulturmedier. Et representativt eksperiment spores over en total av 82 timer er vist i cellekultur inneholdende hjernetumorceller og CNPs (50 ug / ml). Paneler A og B-showkulturbrønnene ved tiden 0, etter CNPs har slått seg ned til bunnen av brønnen. Paneler CH viser påfølgende tidspunkter på 17, 24, 36, 49, 69, og 82 timer, henholdsvis. Paneler G og H representerer det samme felt ved 69 og 82 timer. Alle bildene ble innhentet ved hjelp av lysfelt mikroskopi for å øke kontrasten kobber materiale. Skala barer = 100 mikron for A + B, 50 mikron for CE, og 25 mikron for F + G. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Transformasjon av CNPs lineær biocomposites. CNPs ble kombinert med cystin og vann som vist i figur 1 og i protokollen seksjon med et totalt volum på 7 ml. Panel A viser syntesen fartøyet ved tid 0, viser felt B 3 timer, og panel C shstrømmer 6 hr. Bilder ble innhentet ved hjelp av lysfelt mikroskopi med skala bar indikert (50 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Elektronmikroskopi karakterisering av syntetiserte biocomposites Panel (A):. TEM CNP av utgangsmaterialet (rundt) med formings lineære kompositter. Paneler (B) og (C) viser karakterisering av utgangs CNPs ved hjelp av SEM. Panel (C) er et zoomet bilde av (B). Panel (D) viser SEM av kompositter dannet fra CNPs og cystin. Paneler (E) og (F) viser SEM av kobbersulfat biocomposites. Panel (F) er et zoomeD bilde av (E). Skala barer er indikert på alle bildene, og = 200 nm i (A), en mikron i (B), 500 nm i (C), 5 mikron i (D), 2 mikrometer i (E), og 1 mikron i (F ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. EDX (SEM) analyse av utgangsmaterialer og syntetiske lineære kompositter. Screen snapshots av SEM skannede prøver ved hjelp EDX analyse for elementære innhold. Panel (A) = starter CNPs; Panel (B) = biocomposites fra CNPs og cystin; Panel (C) = kobbersulfat utgangsmaterialet, og Panel (D) = kompositter from kobbersulfat og cystin. For peak merking, C = karbon, O = oksygen, Cu = kobber, S = svovel, og N = nitrogen. Større etiketter for elementær identitet har blitt plassert ovenfor sentrale topper for enkel visning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Modifisering av lineær sammensatt størrelse og konsentrasjon post-syntese. Lineære strukturer syntetisert fra kobbersulfat ble sonikert i 0, 15, 30 eller 60 min, henholdsvis, slik som vist i paneler (AD). Bilder ble innhentet ved hjelp av lysfelt mikroskopi med skala bar på 200 mikrometer indikert i alle bilder. Paneler (EG), konsentrasjonen av biocomposites bruker sentrifugering: 6 ml av lineære strukturer som stammer fra CNPs (<strong> E, venstre) og kobbersulfat (E, høyre) vises settling under gravitasjon etter 10 min. Med 10 min sentrifugering ved 500 xg, er en komprimert pellet dannet (panel F). En mindre volum (500 mL) av det samme materialet ble konsentrert som vist i (panel G) (CNP-avledet strukturer er vist i venstre rør og kobber sulfat-avledet strukturer i riktig tube). Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens evaluere potensielle toksiske effekter av nanomaterialer inkludert CNPs, ble det observert at på lang sikt, CNPs ble forvandlet fra en i utgangspunktet mer spredt partikkelfordelingen til et større, aggregert form (figur 2). I noen tilfeller er disse svært aggregerte formasjonene som ble produsert i cellekulturskål, under biologiske betingelser, dannes sterkt lineære fremspring fra den sentrale aggregat, som minner om tidligere beskrevne kobberholdige "bollene" 6. Det skal påpekes at under de betingelser som er vist her, er konsentrasjonen av CNPs tilsatt til cellene var sub-maksimal, således ikke drepe alle cellene i kultur (se figur 2). Fra disse innledende observasjoner, ble eksperimenter deretter fortsatte ved å eliminere suksessivt flere bestanddeler i forhold cellekultur (herunder slutt cellene selv) for å finne de resterende viktige komponenter som trengs for syntese of lineære kobber biocomposites.
Vi har oppdaget at cystin, en supplert komponent av den opprinnelige cellekulturer, når kombinert med CNPs under riktige biologiske betingelser, kan det resultere i transformasjonen av nanopartikkel form i en sterkt lineær biocomposite som inneholdt både metallet og biokjemiske komponenter som indikert ved EDX-analyse ved scanning-elektronmikroskopi av de fremstilte prøver (figur 5). Således svovel, som ikke er tilstede i utgangsmaterialet CNP, viser en fremtredende topp i de syntetiserte biocomposites, noe som indikerer at både kobber og komponenter av biokjemisk material cystin er avgjørende for de dannede lineære strukturer.
Det ble videre vist at ved anvendelse av lignende syntesebetingelser, men ved å erstatte CNPs med kobbersulfat, sterkt lineære biocomposites kan også bli dannet. Faktisk syntese ved anvendelse av koppersulfat og cystin tendens til å resultere i "renere" nod produkter, ved at ingen ureagert CNPs var stadig tilstede, siden koppersulfat er fullstendig oppløselig i vann, som ble brukt som løsningsmiddel i alle syntesene som er rapportert her. Videre utmerker kobbersulfat biocomposites seg fra CNP-avledet kompositter i beholder en blå farge som var synlig ved sentrifugering av materialet.
Andre grupper har tidligere studert kobber-cystin komplekser og definert noen viktige kjemiske egenskaper. For eksempel, Kahler et al. Viste dannelsen av kobber-cystin-komplekser i form av fine fibre, som var tydelig etter tørking, men ustabil i oppløsning 13. I andre eksempler pleksdannende studier med L-cystin og forskjellige metallkationer bekrefter kobber og cystin kompleksdannelse i et vandig medium 14 og dannet komplekser kan være mononukleær eller flerkjernet, med svovel fra cystin bidrar til kompleksdannelse 15. En rekke studier har rapported interaksjoner mellom cystin og kobber i biologiske systemer. For eksempel, ved fysiologisk pH, ioner kobber (II) koordinere med histidin og cystin i simulert plasma til å danne komplekser 16, og svovelinneholdende aminosyrer ble vist å være beskyttende mot kobber toksisitet hos kyllinger 17. Disse funnene støtter således den vesentlige rollen som cystin i kompleksdannelse med kobber utgangsmateriale i våre syntesefremgangsmåter for å danne lineære biocomposites.
På denne tiden har ennå ikke blitt identifisert en syntese strategi som kan direkte kontrollere lengden på enkelte lineære biocomposites vist her. Men de kritiske trinn som er identifisert i den beskrevne syntese omfatter: 1) god spredning ved sonikering av utgangsmaterialer når det gjelder syntesen som omfatter CNPs; 2) Bruk av nylaget CNPs, kobber sulfat, og cystin for effektiv syntese av kompositter; 3) å tillate syntese i kolben for å forbli uforstyrret i incubateller i minst 6 timer; og 4) unngå "over-reaksjon" tilstander der forgrenet "bolle" -type, aggregerte kompositter skjemaet.
Etter at syntesen er fullført, ble det vist at sonication av strukturene kan utnyttes effektivt for å redusere den gjennomsnittlige størrelse (lengde) av strukturene. Sonicating å gjøre mindre strukturer kan hjelpe til applikasjoner som celleopptak eller andre biocomposite-cellulære interaksjoner. Som har blitt tidligere rapportert, lade stabilisering av CNPs løpet av denne syntesen ved å kombinere med cystin endret målt zeta potensialet fra positiv til et mindre belastet (negativ) form 9. Endringen i ladning kan forklare hvorfor de dannete komposittene viser svært lite aggregering i tørket form eller flytende medier, noe som gjør håndteringen av strukturene mye mer praktisk.
Siden rapporterte syntesen av disse CNP-avledet og koppersulfat-avledede strukturer er utført oUT i flytende media, er det ventet at fremgangsmåten kan være svært skalerbar, noe som betyr at med riktig forhold av komponenter og syntesebetingelser, kunne milliliter syntesen oppskriften benyttet her skaleres opp eller ned for å inkludere mange hundre milliliter eller mer, og ville derfor være forventet å gi mer sluttprodukt, så vel. På grunn av den metall (kobber) komponenten i disse biocomposites, er det ganske enkelt å konsentrere produktet syntetisert ved sentrifugering (figur 6). Biocomposites dannet fra CNP utgangsmaterialet beholde en mørkere farge når konsentrert til en pellet, muligens på grunn av ureagert kobber oksid nanopartikler (figur 6). Til sammenligning, når koppersulfat biocomposites konsentrert til en pellet har en blå farge, i samsvar med egenskapene til kobbersulfat med forskjellige nivåer av fuktighet 18.
Romanen syntese rapportert her er også skalerbar i den forstand at den selv montert linøret strukturer skalere fra nano-skala til mikro-skala som vist ved hjelp av elektronmikroskopi (figur 4) og tradisjonell hvit lysmikroskopi (figur 3 og 6). Det er interessant å merke seg at nylig utviklet coiled-spole protein mikrofiber ble rapportert som kunne innlemme curcumin som er tillatt for de dannede fibrene må følges til fluorescens belysning 19. Lignende strategier kan være mulig å innlemme avstandsstykker eller tagging agenter i de lineære kompositter rapportert her for å gi produksjon av større strukturer og / eller forbedringer for bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M.
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al.
