Summary
نحن هنا نقدم بروتوكول لتجميع الرواية، وارتفاع تبلغ نسبة أبعادها biocomposites في ظل الظروف البيولوجية ووسائل الإعلام السائلة. وbiocomposites مقياس من نانومتر إلى ميكرومتر في القطر والطول، على التوالي. النانوية النحاس (CNPS) وكبريتات النحاس جنبا إلى جنب مع السيستين هي المكونات الرئيسية للالتوليف.
Abstract
والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تركيب اثنين biocomposites جديدة مع هياكل ارتفاع نسبة الجانب. تتكون biocomposites من النحاس والسيستين، وإما النانوية النحاس (CNPS) أو كبريتات النحاس المساهمة عنصر معدني. ويتم تجميع في السائل تحت الظروف البيولوجية (37 ° C) وشكل المركبة الذاتي تجميعها بعد 24 ساعة. تشكلت مرة واحدة، هذه المركبات هي درجة عالية من الاستقرار في كل وسائل الإعلام السائلة وفي شكل المجففة. المركبة مقياس من النانوية لمجموعة الصغرى في الطول، ومن بضعة ميكرونات إلى 25 نانومتر في القطر. أظهر الانبعاثات مجال المجهر الإلكتروني مع التحليل الطيفي التشتت الطاقة الأشعة السينية (EDX) أن الكبريت كان حاضرا في هياكل خطية NP المشتقة، في حين أنه كان غائبا عن المواد CNP ابتداء، مما يؤكد سيستين كمصدر من الكبريت في nanocomposites النهائية . خلال توليف هذه النانوية والصغرى المركبة الخطية، مجموعة متنوعة من أطوال شارعيتم تشكيل uctures في السفينة التوليف. وقد تجلى صوتنة من الخليط السائل بعد التوليف للمساعدة في السيطرة على متوسط حجم الهياكل التي كتبها تناقص متوسط طول الوقت مع زيادة صوتنة. منذ البنى المتشكلة مستقرة للغاية، لا التكتل، وتتشكل في الطور السائل، ويمكن أيضا أن تستخدم الطرد المركزي للمساعدة في التركيز وعزل المركبات تشكيلها.
Protocol
1. التخطيط للتجارب
- تحديد حجم nanocomposites النحاس اللازمة لتخليق. على هذا الأساس، واختيار عدد من قوارير صغيرة الحجم (25 سم 2)، أو قوارير أكبر على النحو المبين أدناه في إعداد المواد.
- لهذا التوليف، استخدام 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2 و 40٪ على الأقل الرطوبة. ضمان أن مثل حاضنة متاح، وأنه لن تكون منزعجة بشكل متكرر خلال الفترة من التوليف (حوالي 24 ساعة).
تنبيه: افتتاح المتكررة وإغلاق الحاضنة بالتأكيد سوف يسبب التقلبات في درجات الحرارة مما قد يؤدي إلى تغير تركيب الهياكل بمركب متناهي في الصغر.
2. إعداد المواد
- إعداد جميع المواد الطازجة قبل بدء التجربة، وذلك بإضافة المواد الصلبة للمذيبات الحق قبل التوليف هو أن تبدأ. حفظ حلول المخزون من المواد السيستين والنحاس الانطلاق في السائل لزمن طويل بefore لا ينصح التجربة وربما يؤدي إلى نتائج متباينة. فتحت مرة واحدة من البائع، والحفاظ على المواد الأولية الجافة عن طريق لف الجزء العلوي من الحاويات مع parafilm.
ملاحظة: يتم استخدام بروتوكول التالي كمثال لردود الفعل في 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة باستخدام 7 ميكرولتر من السيستين، 6643 ميكرولتر من الماء المعقم، و 350 ميكرولتر من CNPS. - إعداد 2 ملغ / مل حل النانوية النحاس وزنها عن طريق لا يقل عن 2 ملغ من CNPS. ارتداء قفازات المتاح خلال هذه الخطوة لمنع اتصال ممكن من CNPS مع الجلد. وضع النانوية في فارغة معقمة 16 مل قارورة زجاجية.
- إلى القارورة التي تحتوي على CNPS، إضافة الماء منزوع الأيونات معقمة في حجم مناسب لجعل 2 ملغ / مل حل ودوامة الحل لمدة 20 ثانية لتوفير تشتت الجسيمات النانوية قبل بدء التوليف (يوصى 1 مل على الأقل إجمالي حجم). لا تملأ أكثر من نصف الطريق قنينة بالماء وهذا سوف تمنع الاختلاط من قبل vortexing. CNPS فيلل يستقر بسرعة إلى قاع القارورة وسوف تظهر داكنة اللون (الرمادي إلى الأسود).
- يصوتن الحل CNP لمدة 17 دقيقة في RT لتوفير التشتت القصوى من CNPS قبل بداية التوليف. فحص دوري للتأكد من أن CNPS خلط المقرر أن صوتنة. بعد صوتنة ناجحة، CNPS تظل معلقة في حل لمدة 30 دقيقة على الأقل، وسوف يكون الحل داكنة اللون.
- تزن خارج كتلة كافية من السيستين لجعل الحل / مل 72.9 ملغ لتوليف. منذ سيستين ليست قابلة للذوبان في الماء مباشرة، ضع السيستين وزنه في سفينة وزنها التحجر.
- إلى وزنها عاء يحتوي سيستين، إضافة كمية كافية من عقيم، 1 M هيدروكسيد الصوديوم، بحيث سيستين يذوب تماما. على سبيل المثال، ويحل 7.29 ملغ من السيستين تماما في 100 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، لجعل 72.9 ملغ / مل حل.
- للحفاظ على ظروف معقمة، تنفيذ هذه الخطوة في العقيمة الأنسجة تدفق الثقافة غطاء محرك السيارة.
تنبيه: هيدروكسيد الصوديومفي 1 M التركيز هو الكاوية، وحتى ارتداء القفازات القابل للتصرف خلال هذه الخطوة لمنع الاتصال من المركز هيدروكسيد الصوديوم مع الجلد
- العمل في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة، إضافة 7 ميكرولتر من سيستين مع 6643 ميكرولتر من الماء المعقم لتركيب قارورة معقمة أولا، واسمحوا احتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع غطاء القارورة تنفيس (فضفاضة) لتوفير فعالة الاختلاط. Resuspend و2 ملغ / مل حل CNP قبل vortexing لمدة 30 ثانية، منذ CNPS واستقروا بعد خطوة صوتنة.
- إضافة حلا كافيا CNP إلى قارورة التوليف (باستخدام تقنية معقمة) للحفاظ على نسب المكون التالي: الجمع بين 1 أجزاء سيستين، 50 أجزاء CNPS، و 949 أجزاء من الماء المعقم في 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة لبدء عملية التجميع. على سبيل المثال، لحجم التوليف 7 مل، والجمع بين 7 ميكرولتر من محلول المخزون السيستين، و 350 ميكرولتر من CNPS، و6643 ميكرولتر من الماء المعقم. استبدال الغطاء على القارورة وتشديد بحيث يكون SECURه.
- بعد الجمع بين جميع المكونات لتركيب، مزيج برفق في قارورة من قبل يحوم 4-5 مرات. ضع قارورة في الحاضنة CO 2 وتنفيس القارورة من خلال تخفيف الغطاء بحيث يكون هناك تبادل الغازات داخل وخارج القارورة خلال التوليف.
- السماح التوليف لتشغيل في الحاضنة لمدة ما يقرب من 24 ساعة. خلال التوليف، يمكن للمرء أن يلاحظ، مع المجهر والعين، وتشكيل المركبة الخطية للغاية.
ملاحظة: عملية تشكيل الهياكل قد يحدث فجأة، بمعنى أن الهياكل من الصعب في البداية للكشف، ثم ظهور العائدات بسرعة إلى الكثافة المتزايدة. ولذلك قد يحدث قبل تشكيل 24 ساعة. ويمكن أيضا ملاحظة هذه العملية عن طريق العين مرة واحدة تصبح هياكل أكبر ويزيد من كثافتها. بينما جيل من الهياكل يمكن ملاحظتها على مر الزمن تحت المجهر والعين في نقطة زمنية لاحقة، انقطاع مستمر للشروط التوليف ودرجة الحرارة سوف يؤدي إلى الفقراءالنتائج التوليف. - إنهاء توليف biocomposites التي كتبها السد بإحكام القارورة تجميع وتخزين وعاء في الثلاجة (4 ° C). الهياكل، مرة واحدة ولدت، وتظل مستقرة في هذا النموذج لمدة سنة على الأقل. تسمية قارورة مع الظروف التوليف، بما في ذلك مكونات المستخدمة، تاريخ التوليف، وفترة حضانة من التوليف قبل الإنهاء.
3. تجميع عن طريق كبريتات النحاس
- تنفيذ التوليف التجميع الذاتي عن طريق استبدال CNPS مع كبريتات النحاس والملح. باستخدام تقنية معقمة، ويحل على الأقل 2 ملغ من كبريتات النحاس بكميات كافية من الماء منزوع الأيونات عقيمة لجعل 2 ملغ / مل حل. بلورات كبريتات النحاس تذهب بسهولة إلى حل في هذا التركيز، ولكن دوامة القارورة إذا لزم الأمر، وتفتيش من قبل العين لضمان تذاب كل البلورات.
- بعد إعداد كبريتات النحاس وتنفيذ التوليف كما هو موضح سابقا، ولكن استبدال CNPS مع كبريتات النحاس.
ملاحظة: تم العثور على nanocomposites الذاتي تجميعها باستخدام كبريتات النحاس كمادة أولية ليكون أكثر اتساقا في شكل نهائي من لهياكل توليفها من CNPS. - إنهاء تركيب biocomposites كبريتات النحاس بالنسبة للمركبات CNP (الخطوة 2.6) وتخزينها على المدى الطويل في 4 ° C.
4. توصيف والتعامل مع Biocomposites بعد التوليف
- تميز biocomposites المستمدة من CNPS ومن كبريتات النحاس التي كتبها الضوء الأبيض المجهر 9 والإلكترون المجهري 9.
- لتوصيف والتفتيش على biocomposites بعد التوليف عن طريق المجهر الضوئي الأبيض، واستخدام مجهر مقلوب كما المركبة سوف تستقر في السطح السفلي من القارورة في غضون بضع دقائق من وضع قارورة شقة، ويمكن بعد ذلك جلبت الى التركيز. استخدام الإعداد حقل مشرق على المجهر لتحقيق أقصى قدر من التناقض بين biocomposites والمتوسطة السائل. المركبات المشتقة من CNPS وشرطيفي كبريتات سوف يظهر كل منهما واضحا للمبهمة في اللون، ولكن سوف المجاميع CNP غير المتفاعل تظهر مظلمة جدا في اللون.
- استخدام كاميرا رقمية متصلة المجهر لالتقاط الصور من المركبة. وسيراعى مجموعة من أطوال لهياكل الفردية.
- لتوصيف والتفتيش على biocomposites بعد التوليف وبعد تخزين عند 4 درجات مئوية، والسماح قوارير أن يأتي إلى RT لمدة 15 دقيقة على الأقل كما قوارير سوف تكثف في البداية على إزالة من الثلاجة، والتي سوف تحجب فعالية التركيز أثناء تأدية التصوير المجهري. بعد السماح موازنة لRT، ومسح الأسطح العلوية والسفلية من القارورة مع منشفة ورقية نظيفة لتحقيق أقصى قدر من جودة التصوير المجهري.
- عند العمل مع أو التصوير المركبة التي تم تخزينها على المدى الطويل، دوامة القارورة لمدة 30 ثانية إلى فصل كتل من المواد المركبة التي تشكل أثناء وجوده في الثلاجة. بعد vortexing ل، وفحص الهياكل مع هيئة التصنيع العسكري مقلوبroscope لضمان أن المجاميع وفصلها، وكرر vortexing لالضرورة.
- استخدام مقلوب المجهر الضوئي الأبيض لتقييم فعالية تجميع لتجربة معينة باستخدام CNPS. على سبيل المثال، وتوثيق وجود أو عدم وجود المتفاعل CNPS في قوارير التوليف تستخدم لbiocomposites CNP المستمدة من قوارير مع معلمات مختلفة مثل الوقت من التوليف.
ملاحظة: فردية CNPS صغيرة جدا أن نلاحظ مع المجهر الضوئي، ولكن غير المتفاعل CNP المجاميع سوف تظهر مستديرة الشكل والأشياء المظلمة، وعلى النقيض من توليفها بنجاح CNP-المركبة التي سيكون لها نسبة عالية الجانب، شكل خطي، و سيكون لديك مجموعة من أطوال مختلفة. تجنب إجراء توليف لفترة طويلة جدا لفترة من الوقت قبل إنهاء الخدمة، لأن هذا سيؤدي في تشعبت للغاية "قنفذ" الهياكل نوع، التي يصعب تفريق في الهياكل الفردية تشكلت مرة واحدة. - استخدام مقلوب الضوء الأبيض المجهر لتقييم فعاليةمن التوليف لتجربة معينة باستخدام كبريتات النحاس. منذ كبريتات النحاس يذهب تماما في حل باستخدام هذا البروتوكول، فإن الحل يبدو أقل المظلم من الحل من التوليف باستخدام CNPS. توثيق حجم ومدى المركبة كبريتات النحاس من خلال مقارنة قوارير مع الظروف التوليف مختلفة مثل الوقت من التوليف قبل الإنهاء.
ملاحظة: ستكون المركبة توليفها بنجاح تظهر مجموعة من أطوال مختلفة. تجنب إجراء توليف لفترة طويلة جدا لفترة من الوقت قبل إنهاء الخدمة، لأن هذا سيؤدي في المجاميع تشعبت للغاية من المواد المركبة، وبعضها سيكون "قنفذ مثل" في الهيكل، والتي يصعب تفريق في الهياكل الفردية تشكلت مرة واحدة .
- لتوصيف والتفتيش على biocomposites بعد التوليف عن طريق المجهر الضوئي الأبيض، واستخدام مجهر مقلوب كما المركبة سوف تستقر في السطح السفلي من القارورة في غضون بضع دقائق من وضع قارورة شقة، ويمكن بعد ذلك جلبت الى التركيز. استخدام الإعداد حقل مشرق على المجهر لتحقيق أقصى قدر من التناقض بين biocomposites والمتوسطة السائل. المركبات المشتقة من CNPS وشرطيفي كبريتات سوف يظهر كل منهما واضحا للمبهمة في اللون، ولكن سوف المجاميع CNP غير المتفاعل تظهر مظلمة جدا في اللون.
- على التركيز biocomposites بعد التوليف، حلول أجهزة الطرد المركزي المركبة في أنبوب الطرد المركزي. إضافة 6 مل من أي هياكل CNP المشتقة أو الهياكل المستمدة من كبريتات النحاس لأنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقةفي 500 x ج في RT لتشكيل بيليه. لأحجام أصغر، إضافة 500 ميكرولتر من الهياكل في حل إلى 0.6 مل أنابيب الحجم. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج في RT لمدة 10 دقيقة على الأقل لتشكيل بيليه.
- بعد الطرد المركزي لمدة ما يكفي من الوقت (10 دقيقة على الأقل لmicrofuges)، حفظ بيليه يمكن ملاحظتها في الجزء السفلي من الأنبوب حيث تتركز الهياكل عن طريق إزالة بعناية السائل طاف فوق بيليه. ويبدو أن الهياكل Biocomposite المستمدة من كبريتات النحاس الأزرق في اللون والهياكل المستمدة من CNPS هي أكثر قتامة (الرمادي إلى الأسود).
- إضافة المزيد من المواد المركبة لهذا الأنبوب وتكرار هذه العملية في نفس أنبوب للتركيز هياكل إذا رغبت في ذلك. لتفريق الكريات المركزة، إضافة حجم المطلوب من حل للأنبوب، ودوامة لمدة 10-30 ثانية.
- هياكل يصوتن بمجرد تشكيلها، لنقل متوسط حجم السكان (أطوال) من هياكل لخفض القيم. هياكل مكان في الماء منزوع الأيونات معقمة ويصوتن لفي LeAST 10 دقيقة. باستخدام هذه العملية، مع مرور الوقت، والهياكل تصبح مجزأة وأصغر في متوسط طول (انظر الشكل 6 من النص). تغييرات الوثيقة في أحجام المركبة مع أوقات صوتنة مختلفة باستخدام الأبيض مقلوب المجهر الضوء والكاميرا الرقمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 تخطيطي تدفق الرسم البياني للخطوات تركيب لتشكيل biocomposites الخطية الموصوفة في هذا العمل. CNPS أو كبريتات النحاس عن بدء مواد وجنبا إلى جنب مع الماء المعقم لتشكيل 2 ملغ / مل حل، وهذا الحل هو مختلطة وsonicated لتوفير حتى الخليط، ثم يتم خلط هذا الحل النحاس في نسبة التالية لتخليق: 949 أجزاء عقيمة الماء: 50 أجزاء خليط النحاس: 1 جزء محلول المخزون سيستين. وحدات التخزين الفعلية قد يزيد أو ينقص وفقا لهذه النسب لزيادة أو خفض العائد التجميع النهائي. بعد مرور فترة الحضانة لا يقل عن 2 ساعة كما هو مبين، تتشكل الهياكل biocomposite الخطية التي مع مرور الوقت يمكن ملاحظتها تحت المجهر الضوئي الأبيض العادي أو عن طريق العين والتغيرات في حل السائلة في المظهر.
ويبين الشكل 2 نتيجة تمثيلية من اكتشاف الأولي من هذه الهياكل الخطية في كامل وسائل الإعلام ثقافة الخلية سVER مدة 82 ساعة. مختبرنا كانت تحمل من تقييم السمية المحتملة للمواد متناهية الصغر مختلفة، بما في ذلك CNPS على الخلايا والخلايا السرطانية وضعها الطبيعي، والخلايا هو موضح في الشكل رقم 2 هي خط خلية ورم في المخ سريعة النمو من ATCC (CRL-2020). ملحق رئيسي في وسائل الإعلام كاملة المستخدمة لهذه الخلايا هو سيستين، والتي تحولت إلى أن تكون عنصرا أساسيا لاكتشاف لماذا هذه الهياكل الخطية كانت تشكل في الثقافات (انظر أدناه والفرع المناقشة). من التشتت حتى الأول من CNPS التي سرعان ما مجموع المباراتين إلى المجهرية (أرقام 2A و 2B)، مع مرور الوقت يتم مسح جسيمات أصغر وتتشكل مجاميع الكبيرة (أرقام 2C و 2D). أخيرا، يبدو أن المجاميع الكبيرة مع والهياكل الخطية الجميلة في نفس الآبار (أرقام 2E-H)، وتشكيل الهياكل نوع "قنفذ" ذكرت سابقا في الأدب باستخدام غير بيولطرق ogical 6. مقارنة النهائية نقطتين الوقت، في 69 و 82 ساعة (2G أرقام و2H، على التوالي)، تبين أن تطوير الهياكل نوع قنفذ كبيرة لا تزال مستقرة تماما، كما يتبين من تصوير نفس المجال المحدد.
ليشرح لماذا لوحظت هذه الهياكل مثل قنفذ في ظل هذه الظروف في مزارع الخلايا، بدأنا القضاء على مكونات وسائل الإعلام لتحديد ما إذا كان يمكن عزل العناصر الأساسية. اكتشفنا أن عنصرا أساسيا ومكملا للوسائل الإعلام ثقافة الخلية كان سيستين، الذي قبل عملية الإزالة تم تحديدها في نهاية المطاف باعتبارها عنصرا أساسيا لعملية التجميع الذاتي. من خلال تبسيط مكونات التوليف (انظر الشكل 1)، ونحن يمكن أن تشكل في نهاية المطاف ارتفاع نسبة الجانب (الخطية) الهياكل في السائل، ويمكن أن يظهر مع مرور الوقت لتتحول من شكل جسيمات متناهية الصغر إلى النموذج الخطي، من دون الحاجة إلى الخلايا، أو أي من خلية أخرىمكونات الثقافة (أرقام 3A-C).
ويبين الشكل 4 توصيف الهياكل الجديدة المكتشفة باستخدام المجهر الإلكتروني، بما في ذلك انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) التقاط صورة جسيمات متناهية الصغر تبدأ المادية وتشكيل النانو الخطية (الشكل 4A). وتظهر الممثلة مجهرية الإلكتروني الماسح (SEM) وصور للمواد ابتداء CNPS والهياكل الخطية تشكلت من مصادر القدرة النووية، والهياكل الخطية التي تشكلت من كبريتات النحاس تبدأ مادة (أرقام 4B-F، على التوالي).
للتحقق من أن biocomposites الواردة السيستين أو المواد المشتقة من السيستين كعنصر البيولوجي أساسيا من المركبة، تم تحليل البنى المتشكلة باستخدام EDX مع SEM المجهري. وأظهرت لقطات الشاشة تمثيلية من المواد التي تم تحليلها في الشكل (5). والأهم من ذلك عند مقارنة CNPS وbiocomposites من CNPS، أحد أبرزيظهر الذروة الكبريت (الشكل 5B)، وهي ليست موجودة في CNP بدءا مادة (الشكل 5A). لbiocomposites باستخدام كبريتات النحاس في بدء المواد (الشكل 5C)، تظهر قمم الكربون والنيتروجين (الشكل 5D)، وهو ما يتسق مع وجود السيستين لهذا biocomposite.
في هذا الوقت، ولم يتم التعرف على طريقة للسيطرة على طول وحجم المركبة خلال التوليف. ومع ذلك، من أجل التحقيق فيما إذا بلغ متوسط حجم الهياكل يمكن السيطرة عليها بعد التوليف، وsonicated biocomposites الخطية لفترات زمنية مختلفة كما هو موضح في الشكل (6). مع زيادة وقت صوتنة، تبين أن متوسط حجم biocomposites الخطية انخفض، كما أظهرت بواسطة المجهر حقل مشرق (أرقام 6A-D). كوسيلة لتركيز وفصل المركبة تشكيلها، الطرد المركزي يمكن استخدامها، وكما هو مبين في الشكلين 6E-G، يمكن تطويرها بيليه المرئي تبعا لأحجام وقوات الطرد المركزي المستخدمة.
الشكل 1. الرسم البياني الممثل للتصميم تركيب النحاس مصادر القدرة النووية النانوية = النحاس؛ السيستئين = سيستين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويظهر الشكل 2. تشكيل الممثل هياكل النحاس biocomposite في الدماغ الثقافات الخلايا السرطانية مع كامل وسائل الإعلام ثقافة الخلية. تجربة تمثيلية تعقب على ما مجموعه 82 ساعة في زراعة الخلايا التي تحتوي على خلايا ورم في المخ وCNPS (50 ميكروغرام / مل). لوحات A و B المعرضالآبار الثقافة في وقت 0 بعد CNPS استقروا في قاع البئر. لوحات CH تظهر نقاط زمنية لاحقة في 17، 24، 36، 49، 69، و 82 ساعة، على التوالي. لوحات G و H يمثل نفس المجال في 69 و 82 ساعة. تم الحصول على جميع الصور باستخدام brightfield المجهري لتعزيز النقيض من مادة النحاس. الحانات النطاق = 100 ميكرون لA + B، 50 ميكرون لCE، و 25 ميكرون لF + G. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الجمع بين الشكل 3. تحول CNPS إلى biocomposites الخطية. CNPS مع السيستين والماء كما هو مبين في الشكل 1 و في قسم البروتوكول مع الحجم الكلي لل7 مل. لوحة ويظهر السفينة التوليف في وقت 0، لوحة B يظهر 3 ساعة، ولوحة C SHالدودة الحلزونية 6 ساعات. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر brightfield مع شريط نطاق وأشارت (50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الإلكترون المجهري توصيف biocomposites توليفها لوحة (A): TEM من CNP ابتداء المواد (جولة) مع المركبة الخطية تشكيل. لوحات (B) و (C) تظهر توصيف CNPS بدءا باستخدام SEM. لوحة (C) هو صورة مكبرة أو مصغرة من (B). لوحة (D) معارض SEM من المواد المركبة التي تشكلت من CNPS والسيستين. لوحات (E) و (F) عرض SEMS من biocomposites كبريتات النحاس. لوحة (F) هو zoomeد صورة (E). يشار إلى الحانات واسعة النطاق في جميع الصور و= 200 نانومتر في (A)، 1 ميكرون في (ب) و 500 نانومتر في (C)، و 5 ميكرون في (D)، 2 ميكرون في (E)، و1 ميكرون في (F ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. EDX (SEM) تحليل المواد الأولية والمواد المركبة الخطية توليفها. قطات الشاشة من العينات الممسوحة ضوئيا SEM باستخدام تحليل EDX عن المحتوى العنصري. لوحة (A) = بدءا CNPS. لوحة (B) = biocomposites من CNPS والسيستين. لوحة (C) = مادة كبريتات النحاس ابتداء، ولوحة (D) = المركبة جيئة وذهابام كبريتات النحاس والسيستين. لوضع العلامات الذروة، C = الكربون، O = الأكسجين، النحاس = النحاس، S = الكبريت، وN = النيتروجين. وقد تم وضع ملصقات أكبر للهوية عنصري فوق القمم الرئيسية لسهولة المشاهدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم sonicated الرقم 6. تعديل خطي حجم المركب والتوليف آخر التركيز. الهياكل الخطية توليفها من كبريتات النحاس ل0، 15، 30، أو 60 دقيقة، على التوالي، كما هو موضح في لوحات (AD). تم الحصول على الصور باستخدام المجهر brightfield مع شريط حجم 200 ميكرون هو مبين في جميع الصور. لوحات (EG)، وتركيز biocomposites باستخدام الطرد المركزي: 6 مل من الهياكل الخطية المستمدة من CNPS (<قوي> E، يسار) وكبريتات النحاس (E، أليس كذلك يتم عرض) تسوية تحت الجاذبية بعد 10 دقيقة. مع 10 دقيقة من الطرد المركزي في 500 x ج، تشكيل بيليه المضغوط (لوحة F). وتركز وحدة تخزين أصغر (500 ميكرولتر) من نفس المادة كما هو مبين في (لوحة G) (تظهر الهياكل CNP المشتقة في البنى المشتقة من كبريتات النحاس أنبوب واليسرى في الأنبوب الأيمن). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء تقييم الآثار السامة المحتملة للمواد متناهية الصغر بما في ذلك CNPS، لوحظ أن أكثر على المدى الطويل، تحولت CNPS من توزيع الجسيمات في البداية أكثر تشتتا ل، مجمعة أكبر (الشكل 2). في بعض الحالات، وهذه التشكيلات شديدة التجميع التي أنتجت في طبق زراعة الخلايا، في ظل ظروف البيولوجية، شكلت التوقعات الخطية للغاية من مجموع المركزي، تذكرنا نحاسية الموصوفة سابقا تحتوي على "قنافذ" 6. وينبغي الإشارة إلى أنه في ظل الظروف هو موضح هنا، وتركيز CNPS تضاف إلى الخلايا بلغت أقصاها الفرعي، وبالتالي لا قتل جميع الخلايا في الثقافة (انظر الشكل 2). من هذه الملاحظات الأولية، وبعد ذلك استمرت التجارب من خلال القضاء على التوالي أكثر من مكونات الشروط زراعة الخلايا (بما في ذلك في نهاية المطاف الخلايا نفسها) للعثور على المكونات الرئيسية المتبقية اللازمة لتخليق سو biocomposites النحاس الخطية.
اكتشفنا أن سيستين، وهو مكون تستكمل الثقافات الخلية الأصلية، وعندما يقترن CNPS في ظل الظروف البيولوجية الصحيحة، يمكن أن يؤدي إلى التحول من شكل الجسيمات النانوية إلى biocomposite الخطي للغاية التي تحتوي على كل من المعادن والعناصر الكيميائية الحيوية كما هو مبين من خلال تحليل EDX عن طريق مسح المجهر الإلكتروني لعينات مستعدة (الشكل 5). وهكذا، والكبريت، وهي ليست موجودة في المواد CNP ابتداء، ويظهر الذروة بارزة في biocomposites توليفها، مشيرا إلى أن كلا من مكونات سيستين المواد الكيميائية الحيوية النحاس وضرورية لهياكل خطية تشكيلها.
وقد تبين أيضا أن باستخدام الظروف توليف مماثلة، ولكن استبدال CNPS مع كبريتات النحاس، ويمكن أيضا أن يتم تشكيل biocomposites الخطية للغاية. في الواقع، والتوليف باستخدام كبريتات النحاس والسيستين تميل إلى يسفر عن "نظافة" ENد المنتجات، في أنه لا يوجد غير المتفاعل CNPS الحالي من أي وقت مضى، منذ كبريتات النحاس قابل للذوبان في الماء تماما، والتي كانت تستخدم كمادة مذيبة في جميع التوليفات ذكرت هنا. وعلاوة على ذلك، ميزت biocomposites النحاس وكبريتات أنفسهم من المركبة CNP المشتقة في الإبقاء على اللون الأزرق الذي كان واضحا على الطرد المركزي للمادة.
ومجموعات أخرى درست سابقا المجمعات النحاس والسيستين وتحديد بعض الخصائص الكيميائية الأساسية. على سبيل المثال، كالر وآخرون أظهرت تشكيل المجمعات النحاس والسيستين في شكل الألياف الدقيقة، والتي كانت واضحة على تجفيف لكن غير مستقر في حل 13. في أمثلة أخرى، ودراسات complexation مع L-السيستين والكاتيونات المعدنية المختلفة تؤكد تشكيل النحاس والسيستين مجمع في وسط مائي 14 و قد تكون شكلت المجمعات الوحيدات أو متعددة النوى، مع الكبريت من السيستين المساهمة في تشكيل معقد 15. وهناك عدد من الدراسات أن يكون التقريرالتفاعلات بين إد السيستين والنحاس في النظم البيولوجية. على سبيل المثال، عند درجة الحموضة الفسيولوجية والنحاس (II) أيونات التنسيق مع الحامض الاميني والسيستين في البلازما محاكاة على شكل مجمعات 16، والكبريت التي تحتوي على الأحماض الأمينية وأظهرت أن وقائية ضد سمية النحاس في الدجاج 17. وبالتالي هذه النتائج تدعم الدور الأساسي للالسيستين في كومبليكسينج مع النحاس بدأت المواد في أساليب التوليف من أجل تشكيل biocomposites الخطية.
في هذا الوقت لم يتم بعد تحديد استراتيجية التوليف التي يمكن التحكم بشكل مباشر على طول biocomposites الخطية الفردية هو موضح هنا. ومع ذلك، فإن الخطوات الحاسمة التي تم تحديدها في التوليف المذكورة ما يلي: 1) تشتت جيدة صوتنة من المواد الأولية في حالة تركيب دمج CNPS. 2) استخدام الطازجة CNPS، كبريتات النحاس، والسيستين لتخليق فعالة من المواد المركبة. 3) السماح التوليف في قارورة أن تظل دون عائق في incubatأو لمدة 6 ساعات على الأقل. و4) تجنب الظروف "الإفراط في رد الفعل" التي تشعبت "قنفذ" من نوع، شكل المركبة المجمعة.
بعد اكتمال تركيب، تبين أن صوتنة من الهياكل يمكن استخدامها بشكل فعال لتقليل متوسط الحجم (طول) من الهياكل. Sonicating لجعل قد تساعد هياكل أصغر في تطبيقات مثل امتصاص الخلايا أو غيرها من التفاعلات biocomposite الخلوية. وكما ذكر سابقا، تهمة استقرار CNPS خلال هذا التوليف عن طريق الجمع بين مع السيستين غيرت إمكانات زيتا قياس من الموجب إلى أقل اتهم (سلبي) شكل 9. هذا التغيير في تهمة قد يساعد على تفسير لماذا تظهر المركبة شكلت تجميع القليل جدا في شكل المجففة أو السائلة وسائل الإعلام، الأمر الذي يجعل التعامل مع هياكل أكثر ملاءمة.
منذ التوليف ذكرت هذه الهياكل المستمدة من كبريتات النحاس CNP المشتقة ويتم سالتحرير في وسائل الإعلام السائل، ومن المتوقع أن العملية قد تكون تدرجية عالية، وهذا يعني أنه مع نسبة الصحيح من المكونات والشروط التوليف، ويمكن توسيع نطاق التوليف صفة ملليلتر المستخدمة هنا أعلى أو لأسفل لتشمل عدة مئات من ملليلتر أو أكثر، و وبذلك من المتوقع أن تسفر عن مزيد من المنتج النهائي، كذلك. نظرا لعنصر المعدن (النحاس) من هذه biocomposites، فمن واضحة تماما للتركيز المنتج تصنيعه بواسطة الطرد المركزي (الشكل 6). Biocomposites تشكلت من CNP ابتداء من المواد تحتفظ لونا أغمق تتركز مرة واحدة في بيليه، وربما يعود ذلك إلى جزيئات أكسيد النحاس غير المتفاعل (الشكل 6). في المقابل، biocomposites كبريتات النحاس عندما تتركز في بيليه يكون لها لون أزرق، بما يتفق مع خصائص كبريتات النحاس مع مستويات مختلفة من الماء 18.
تركيب الرواية الواردة هنا هي أيضا قابلة بمعنى أن لين الذاتي تجميعهاهياكل الأذن مقياس من مقياس النانو إلى الصغيرة الحجم كما هو موضح باستخدام المجهر الإلكتروني (الشكل 4) والتقليدية المجهر الضوئي الأبيض (أرقام 3 و 6). ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا، المهندسة ملفوف لفائف microfibers البروتين يمكن أن تتضمن الكركمين الذي يسمح للألياف شكلت التي يتعين مراعاتها تحت مضان الإضاءة 19. قد تكون استراتيجيات مماثلة من الممكن دمج الفواصل أو وكلاء العلامات في المركبة الخطية ذكرت هنا لتقديم إنتاج الهياكل و / أو التحسينات الكبيرة للتصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini Vortexer | VWR (https://us.vwr.com) | 58816-121 | |
| CO2 Incubator Model # 2425-2 | VWR (https://us.vwr.com) | Contact vendor | Current model calalog # 98000-360 |
| Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) | Labnet (http://labnetinternational.com/) | C2500-R | Model Prism R |
| Cell Culture Centrifuge Model Z323K | Labnet (http://labnetinternational.com/) | Contact vendor | Current model Z206A catalog # C0206-A |
| Sonicator (Ultrasonic Cleaner) | Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) | 1510R-MTH | |
| Balance | Sartorius (http://dataweigh.com) | Model CP225D similar model CPA225D | |
| Olympus IX51 Inverted Light Microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Olympus DP71 microscope digital camera | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| external power supply unit - white light for Olympus microscope | Olympus (http://olympusamerica.com | TH4-100 | |
| 10X, 20X, and 40X microscope objectives | Olympus (http://olympusamerica.com | Contact vendor | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) | model S-4800 | |
| Transmission Electron Microscope | Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) | model Libra 120 | |
| Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco (http://envirco-hvac.com) | model PNG62675 | Used for sterile cell culture technique |
References
- Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
- Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M.
- Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
- Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
- Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
- Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
- Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
- Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
- Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
- Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
- Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
- Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
- Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
- Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
- Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
- Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
- Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604 (2008).
- Hume, J., et al.
