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Bioengineering

एक जैविक तरल माध्यम में स्केलेबल, धातु उच्च पहलू अनुपात nanocomposites का सृजन

doi: 10.3791/52901 Published: July 8, 2015

Summary

यहाँ हम जैविक शर्तों के तहत और तरल मीडिया में उपन्यास, उच्च पहलू अनुपात biocomposites के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। biocomposites क्रमशः, व्यास और लंबाई में माइक्रोमीटर नैनोमीटर से पैमाने। Cystine के साथ संयुक्त कॉपर नैनोकणों (CNPs) और तांबा सल्फेट संश्लेषण के लिए प्रमुख घटक हैं।

Abstract

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के उच्च पहलू अनुपात संरचनाओं के साथ दो उपन्यास biocomposites के संश्लेषण का वर्णन करने के लिए है। biocomposites तांबा नैनोकणों (CNPs) या धातु घटक योगदान तांबा सल्फेट के साथ या तो, तांबा और cystine से मिलकर बनता है। संश्लेषण जैविक शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस) और 24 घंटे के बाद आत्म इकट्ठे कंपोजिट फार्म के नीचे तरल में किया जाता है। गठन के बाद, इन कंपोजिट दोनों तरल मीडिया में और एक सूखे के रूप में अत्यधिक स्थिर रहे हैं। कंपोजिट लंबाई में सीमा सूक्ष्म करने के लिए नैनो से पैमाने पर, और कुछ माइक्रोन से व्यास में 25 एनएम के लिए। ऊर्जा फैलानेवाला एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (EDX) के साथ क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी यह इस प्रकार अंतिम nanocomposites में सल्फर के स्रोत के रूप में cystine, पुष्टि शुरू कर CNP सामग्री से अनुपस्थित था, जबकि सल्फर, एनपी व्युत्पन्न रैखिक संरचनाओं में मौजूद था कि प्रदर्शन । इन रैखिक नैनो और सूक्ष्म कंपोजिट के संश्लेषण, एसटीआर की लंबाई की एक विविध रेंज के दौरानuctures संश्लेषण पोत में बनाई है। संश्लेषण के बाद तरल मिश्रण के sonication sonication के क्षेत्र की वृद्धि हुई समय के साथ औसत लंबाई ह्रासमान द्वारा संरचनाओं का औसत आकार को नियंत्रित करने में सहायता करने के लिए प्रदर्शन किया गया। का गठन संरचनाओं अत्यधिक agglomerate नहीं है, स्थिर, और तरल चरण में बनते हैं कर रहे हैं, centrifugation के भी ध्यान दे और गठन कंपोजिट को अलग करने में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

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प्रयोगों के 1. योजना

  1. संश्लेषण के लिए आवश्यक तांबा nanocomposites के मात्रा निर्धारण करते हैं। उस आधार पर, छोटी मात्रा बोतल (25 सेमी) 2, या सामग्री की तैयारी में नीचे संकेत के रूप में बड़ा बोतल के एक नंबर का चयन करें।
  2. इस संश्लेषण के लिए, 5% सीओ 2 और कम से कम 40% नमी के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर का उपयोग करें। ऐसी एक मशीन उपलब्ध है और यह बार बार संश्लेषण की अवधि (लगभग 24 घंटा) से अधिक परेशान नहीं किया जाएगा कि सुनिश्चित करें।
    चेतावनी: दोहराया खोलने और इनक्यूबेटर के समापन निश्चित रूप से nanocomposite संरचनाओं की बदल संश्लेषण में हो सकता है, जो तापमान के उतार चढ़ाव के कारण होगा।

माल की 2. तैयारी

  1. संश्लेषण शुरू हो रहा है ठीक से पहले सॉल्वैंट्स के लिए ठोस सामग्री जोड़कर, एक प्रयोग के शुरू होने से पहले नए सिरे से सभी सामग्री तैयार करते हैं। लंबे समय ख के लिए तरल में cystine और तांबे के शुरुआती सामग्री का जायजा समाधान रखते हुएefore प्रयोग अनुशंसित नहीं है और चर परिणामों को जन्म दे सकता है। एक बार जब Parafilm के साथ कंटेनर के ऊपर लपेटकर द्वारा सूखा शुरू सामग्री, विक्रेता से रखने के लिए खोला गया।
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल cystine के 7 μl, बाँझ पानी की 6643 μl, और CNPs के 350 μl का उपयोग कर एक 25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में प्रतिक्रिया के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  2. CNPs के कम से कम 2 मिलीग्राम बाहर वजन से तांबा नैनोकणों के 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है। त्वचा के साथ CNPs के संभावित संपर्क को रोकने के लिए इस कदम के दौरान डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें। एक खाली बाँझ 16 मिलीलीटर कांच की शीशी में नैनोकणों रखें।
    1. CNPs युक्त शीशी, एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए और संश्लेषण शुरू होने से पहले नैनोकणों के फैलाव प्रदान करने के लिए 20 सेकंड के लिए समाधान भंवर करने के लिए उचित मात्रा में बाँझ विआयनीकृत पानी जोड़ने के लिए (कम से कम 1 मिलीलीटर कुल मात्रा की सिफारिश की है)। इस vortexing द्वारा मिश्रण को बाधित करेगा के रूप में पानी के साथ शीशी के आधे से ज्यादा रास्ता भर नहीं है। CNPs wilएल जल्दी शीशी के नीचे बसा है और (काला करने के लिए ग्रे) रंग में अंधेरा दिखाई देगा।
    2. संश्लेषण की शुरुआत से पहले CNPs के अधिक से अधिक फैलाव प्रदान करने के लिए आरटी पर 17 मिनट के लिए CNP समाधान Sonicate। समय-समय पर CNPs sonication के की वजह से मिश्रण कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें। एक सफल sonication के बाद, CNPs कम से कम 30 मिनट के लिए समाधान में निलंबित रहेगा और समाधान रंग में अंधेरा हो जाएगा।
  3. संश्लेषण के लिए एक 72.9 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए cystine की पर्याप्त बड़े पैमाने पर वजन। Cystine पानी में सीधे घुलनशील नहीं है के बाद से, एक antistatic वजन पोत में तौला cystine जगह है।
    1. Cystine पूरी तरह घुल इतना है कि वजन पोत युक्त cystine करने के लिए, बाँझ, 1 एम NaOH के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें। उदाहरण के लिए, एक 72.9 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए, 1 एम NaOH के 100 μl में पूरी तरह से cystine की 7.29 मिलीग्राम भंग।
    2. एक बाँझ प्रवाह टिशू कल्चर हुड में इस कदम के लिए बाहर ले जाने, बाँझ की स्थिति बनाए रखने के लिए।
      चेतावनी: NaOH1 एम एकाग्रता कास्टिक है पर, तो त्वचा के साथ केंद्रित NaOH के संपर्क को रोकने के लिए इस कदम के दौरान डिस्पोजेबल दस्ताने पहनने
  4. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में काम करते हुए, पहले बाँझ संश्लेषण फ्लास्क बाँझ पानी की 6643 μl साथ cystine के 7 μl जोड़ें, और कुप्पी टोपी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते जाने प्रभावी प्रदान करने के लिए (ढीला) निकाल मिश्रण। CNPs sonication के कदम के बाद तय हो चुका है के बाद से, 30 सेकंड के लिए vortexing से 2 मिलीग्राम / एमएल CNP समाधान Resuspend।
    1. संश्लेषण शुरू करने के लिए एक 25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में बाँझ पानी, 50 भागों CNPs, और 949 1 भागों भागों cystine गठबंधन: निम्नलिखित घटक अनुपात बनाए रखने के लिए (बाँझ तकनीक का प्रयोग करके) संश्लेषण कुप्पी के लिए पर्याप्त CNP समाधान जोड़ें। उदाहरण के लिए, एक 7 मिलीलीटर संश्लेषण की मात्रा के लिए, cystine शेयर समाधान के 7 μl, CNPs के 350 μl, और बाँझ पानी की 6643 μl गठबंधन। कुप्पी पर टोपी की जगह है और इसलिए यह secur है कि कसनेई।
    2. संश्लेषण के लिए सभी घटकों के संयोजन के बाद, धीरे 4-5 बार घूमता द्वारा फ्लास्क में मिला लें। सीओ 2 इनक्यूबेटर में कुप्पी प्लेस और में और संश्लेषण के दौरान कुप्पी से बाहर गैस आदान-प्रदान किया जाएगा कि इतने टोपी ढीला द्वारा कुप्पी वेंट।
  5. संश्लेषण लगभग 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में चलाने की अनुमति दें। संश्लेषण के दौरान, एक, माइक्रोस्कोपी के साथ और आंखों से, उच्च रैखिक कंपोजिट के गठन का निरीक्षण कर सकते हैं।
    नोट: संरचनाओं के गठन की प्रक्रिया संरचनाओं का पता लगाने के लिए शुरू में मेहनत कर रहे हैं इस अर्थ में कि अचानक हो सकता है, तो उपस्थिति एक बढ़ती हुई घनत्व करने के लिए जल्दी से आय। गठन इसलिए 24 घंटा पहले हो सकती है। संरचनाओं बड़ा और उनके घनत्व बढ़ता बन एक बार प्रक्रिया भी आंखों से देखा जा सकता है। संरचनाओं की पीढ़ी के बाद के समय बिंदुओं पर खुर्दबीन के नीचे और आंखों से समय के साथ मनाया जा सकता है, लगातार संश्लेषण स्थितियों में दखल और तापमान गरीब को बढ़ावा मिलेगासंश्लेषण का परिणाम है।
  6. कसकर संश्लेषण कुप्पी कैपिंग और एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में पोत भंडारण के द्वारा biocomposites के संश्लेषण को समाप्त करें। एक बार उत्पन्न संरचनाएं, कम से कम एक वर्ष के लिए इस रूप में स्थिर रहते हैं। उपयोग घटकों, संश्लेषण की तारीख, और समाप्ति से पहले संश्लेषण की ऊष्मायन समय सहित संश्लेषण की स्थिति, साथ कुप्पी लेबल।

कॉपर सल्फेट का प्रयोग 3. संश्लेषण

  1. तांबा सल्फेट नमक के साथ CNPs जगह से आत्म विधानसभा संश्लेषण बाहर ले। बाँझ तकनीक का उपयोग करना, एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए बाँझ विआयनीकृत पानी की पर्याप्त मात्रा में तांबा सल्फेट के कम से कम 2 मिलीग्राम भंग। तांबा सल्फेट क्रिस्टल आसानी से इस एकाग्रता में समाधान में जाना है, लेकिन अगर जरूरत शीशी भंवर, और सभी क्रिस्टल भंग कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए आँख से निरीक्षण किया।
  2. पहले से वर्णित है, लेकिन तांबा सल्फेट के साथ CNPs की जगह के रूप में तांबे सल्फेट की तैयारी के बाद, संश्लेषण के लिए बाहर ले।
    नोट: एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में तांबे सल्फेट का उपयोग कर आत्म इकट्ठे nanocomposites CNPs से संश्लेषित संरचनाओं के लिए की तुलना में अंतिम आकार में बहुत अधिक सुसंगत होना पाया गया है।
  3. CNP कंपोजिट के लिए के रूप में तांबे सल्फेट biocomposites के संश्लेषण के बर्खास्त (2.6 कदम) और 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें लंबी अवधि की दुकान।

4. विशेषता और Biocomposites पोस्ट-संश्लेषण की हैंडलिंग

  1. CNPs से और सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी 9 से तांबा सल्फेट से और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 9 से व्युत्पन्न biocomposites की विशेषताएँ।
    1. कंपोजिट कुप्पी फ्लैट बिछाने के कुछ ही मिनटों के भीतर कुप्पी के नीचे की सतह का आदी हो जाएगा के रूप में लक्षण वर्णन और biocomposites सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पोस्ट-संश्लेषण के निरीक्षण के लिए, एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, और उसके ध्यान में लाया जा सकता है। Biocomposites और तरल माध्यम के बीच इसके विपरीत अधिकतम करने के लिए माइक्रोस्कोप पर उज्ज्वल क्षेत्र सेटिंग का उपयोग करें। CNPs और पुलिस से प्राप्त होता कंपोजिटसल्फेट प्रति दोनों रंग में अपारदर्शी करने के लिए स्पष्ट दिखाई देगा, लेकिन unreacted CNP समुच्चय रंग में बहुत अंधेरा दिखाई देगा।
      1. कंपोजिट की छवियों पर कब्जा करने के लिए माइक्रोस्कोप से जुड़ा एक डिजिटल कैमरे का उपयोग करें। अलग-अलग संरचनाओं के लिए लंबाई की एक श्रृंखला मनाया जाएगा।
    2. लक्षण वर्णन और biocomposites के बाद संश्लेषण के निरीक्षण के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद, बोतल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग जबकि बाहर ले जाने ध्यान केंद्रित प्रभावी अस्पष्ट होगा, जो फ्रिज से हटाने, पर शुरू में संक्षेपण होगा फार्म के रूप में बोतल में कम से कम 15 मिनट के लिए आरटी के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं। आरटी के लिए संतुलन अनुमति के बाद, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए एक साफ कागज तौलिया के साथ कुप्पी के ऊपर और नीचे सतहों पोंछे।
    3. फ्रिज में है, जबकि कि फार्म कंपोजिट के clumps अलग कर देना करने के लिए 30 सेकंड के लिए लंबे समय तक संग्रहीत किया गया है उस के साथ या इमेजिंग कंपोजिट, भंवर कुप्पी काम कर रहे है। Vortexing के बाद, एक औंधा mic के साथ संरचनाओं का निरीक्षणroscope समुच्चय अलग है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, और आवश्यक के रूप में vortexing दोहराने के लिए।
    4. CNPs का उपयोग करते हुए एक भी प्रयोग के लिए संश्लेषण की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए उल्टे सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, इस तरह के संश्लेषण के समय के रूप में विभिन्न मापदंडों के साथ बोतल से CNP व्युत्पन्न biocomposites के लिए प्रयोग किया जाता संश्लेषण बोतल में unreacted CNPs की उपस्थिति या अनुपस्थिति दस्तावेज़।
      व्यक्तिगत CNPs एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ पालन करने के लिए बहुत छोटे हैं, लेकिन unreacted CNP एक उच्च पहलू अनुपात, रैखिक फार्म होगा जो सफलतापूर्वक संश्लेषित CNP-कंपोजिट के विपरीत, गोल आकार और अंधेरे वस्तुओं के रूप में दिखाई देगा समुच्चय, और ध्यान दें: अलग लंबाई की एक श्रृंखला है। इस बार का गठन व्यक्ति संरचनाओं में फैलाने के लिए मुश्किल हो जाता है, जो अत्यधिक branched "साही" प्रकार संरचनाओं, में परिणाम होगा, के रूप में समापन से पहले समय की अवधि के लिए भी लंबे समय संश्लेषण से बाहर ले जाने से बचें।
    5. प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए उल्टे सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करेंतांबे सल्फेट का उपयोग करते हुए एक भी प्रयोग के लिए संश्लेषण की। तांबा सल्फेट इस प्रोटोकॉल का उपयोग समाधान में पूरी तरह से चला जाता है के बाद से, समाधान CNPs का उपयोग कर संश्लेषण से समाधान की तुलना में कम अंधेरा दिखाई देगा। ऐसी समाप्ति से पहले संश्लेषण के समय के रूप में अलग संश्लेषण शर्तों के साथ बोतल की तुलना द्वारा तांबा सल्फेट कंपोजिट के आकार और हद दस्तावेज़।
      नोट: सफलतापूर्वक संश्लेषित कंपोजिट अलग लंबाई की एक श्रृंखला दिखाई देंगे। इस "साही की तरह" संरचना में हो जाएगा, जिनमें से कुछ कंपोजिट, का अत्यधिक branched समुच्चय में परिणाम होगा, के रूप में समापन से पहले समय की अवधि के लिए भी लंबे समय संश्लेषण से बाहर ले जाने से बचें, और जो एक बार का गठन व्यक्ति संरचनाओं में फैलाने के लिए मुश्किल हो जाता है ।
  2. Biocomposites के बाद संश्लेषण, एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में कंपोजिट के सेंट्रीफ्यूज समाधान ध्यान केंद्रित करने के लिए। एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब CNP व्युत्पन्न संरचनाओं या तांबा सल्फेट व्युत्पन्न संरचनाओं या तो के 6 मिलीलीटर जोड़ें। 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्रआरटी पर 500 XG पर एक गोली के रूप में। छोटे संस्करणों के लिए, 0.6 मिलीलीटर आकार ट्यूब का हल में संरचनाओं के 500 μl जोड़ें। कम से कम 10 मिनट के लिए आरटी पर 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र एक गोली के रूप में।
    1. पर्याप्त समय के लिए (microfuges के लिए कम से कम 10 मिनट) centrifuging के बाद, संरचनाओं ध्यान से गोली ऊपर सतह पर तैरनेवाला तरल को हटाने के द्वारा केंद्रित कर रहे हैं, जहां ट्यूब के नीचे नमूदार गोली बचाने के लिए। तांबा सल्फेट से निकाली गई Biocomposite संरचनाओं रंग और CNPs से व्युत्पन्न संरचनाओं में नीले गहरे रंग (काला करने के लिए ग्रे) कर रहे हैं दिखाई देते हैं।
    2. इस ट्यूब के लिए और अधिक कंपोजिट जोड़ें और अगर वांछित संरचनाओं ध्यान केंद्रित करने के लिए एक ही ट्यूब में इस प्रक्रिया को दोहराने। केंद्रित छर्रों को तितर-बितर करने के लिए, 10-30 सेकंड के लिए वांछित ट्यूब के समाधान की मात्रा, और भंवर जोड़ें।
  3. Sonicate संरचनाओं एक बार मूल्यों को कम करने के लिए संरचनाओं की औसत जनसंख्या आकार (लंबाई) ले जाने के लिए, का गठन किया। पर Le के लिए बाँझ विआयनीकृत पानी और sonicate में रखें संरचनाओंAST 10 मिनट। समय के साथ, इस प्रक्रिया का उपयोग करना, संरचनाओं खंडित और औसत लंबाई (पाठ की चित्रा 6 देखें) में छोटे हो जाते हैं। एक औंधा सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोप और डिजिटल कैमरे का उपयोग अलग sonication के समय के साथ समग्र आकार में दस्तावेज़ में परिवर्तन।

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Representative Results

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चित्रा 1 इस काम में वर्णित रैखिक biocomposites के लिए फार्म का संश्लेषण कदम की एक प्रवाह चार्ट योजनाबद्ध दिखाता है। सामग्री के रूप में शुरू CNPs या तांबा सल्फेट एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान के लिए फार्म बाँझ पानी के साथ संयुक्त, इस समाधान मिश्रित है और एक भी मिश्रण प्रदान करने के लिए sonicated, और इस तांबा समाधान तो संश्लेषण के लिए निम्नलिखित अनुपात में मिलाया जाता है कर रहे हैं: 949 भागों बाँझ पानी: 50 भागों तांबे का मिश्रण: 1 हिस्सा cystine शेयर समाधान। वास्तविक संस्करणों को पैमाने पर या अंतिम संश्लेषण उपज नीचे पैमाने पर करने के लिए ये अनुपात के हिसाब से वृद्धि हुई है या कम किया जा सकता है। समय के साथ दिखने में तरल समाधान परिवर्तन के रूप में सामान्य सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत या आंखों से देखा जा सकता है जो संकेत दिया है, रैखिक biocomposite संरचनाओं का गठन कर रहे हैं के रूप में कम से कम 2 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद।

चित्रा 2 पूरा सेल संस्कृति मीडिया संगठनों में इन रैखिक संरचनाओं की आरंभिक खोज से एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है82 घंटा की अवधि देखें। हमारी प्रयोगशाला कोशिकाओं और कैंसर की कोशिकाओं को सामान्य पर CNPs सहित विभिन्न nanomaterials, के संभावित विषाक्तता के मूल्यांकन के बाहर ले जा रहा था, और चित्रा 2 में दिखाया कोशिकाओं ATCC (सीआरएल-2020) से एक तेजी से बढ़ती मस्तिष्क ट्यूमर सेल लाइन कर रहे हैं। इन कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया पूरा मीडिया के लिए एक प्रमुख पूरक इन रैखिक संरचनाओं (नीचे देखें और चर्चा अनुभाग) संस्कृतियों में गठन किया गया था क्यों की खोज करने के लिए आवश्यक घटक है जो निकला Cystine, है। जो जल्दी से कुल microstructures (आंकड़े 2A और 2 बी) में, छोटे कणों मंजूरी दे दी है और बड़ा समुच्चय (आंकड़े -2 सी और 2 डी) का गठन कर रहे हैं समय के साथ CNPs की एक शुरुआती भी फैलाव से। अंत में, ठीक है, रैखिक संरचनाओं के साथ बड़ा समुच्चय गैर-बॉय का उपयोग करते हुए पहले से साहित्य में सूचना दी "साही" प्रकार संरचनाओं बनाने, एक ही कुओं (आंकड़े 2 ई-एच) में दिखाई देते हैंogical विधियों 6। 69 और 82 घंटा में अंतिम दो समय अंक की तुलना, (2 जी और 2H, क्रमशः आंकड़े) एक ही सटीक क्षेत्र इमेजिंग द्वारा संकेत के रूप में बड़े साही प्रकार की संरचनाओं के विकास, काफी स्थिर बनी हुई है कि पता चलता है।

सेल संस्कृतियों में इन शर्तों के तहत इन साही संरचनाओं की तरह मनाया गया समझाने के लिए क्यों, हम आवश्यक तत्वों को अलग किया जा सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए मीडिया के घटकों को नष्ट करने शुरू कर दिया। हम सेल संस्कृति मीडिया के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है और पूरक समाप्त करने की प्रक्रिया से अंततः आत्म विधानसभा की प्रक्रिया के लिए एक आवश्यक घटक के रूप में पहचान की थी जो Cystine, था कि खोज की। संश्लेषण घटकों को सरल बनाने के द्वारा कोशिकाओं की आवश्यकता के बिना, हम अंत में, रैखिक प्रपत्र को nanoparticle रूप से परिणत करने के लिए समय के साथ दिखाया जा सकता है कि उच्च पहलू अनुपात (रैखिक) तरल में संरचनाओं, फार्म सकता है (चित्रा 1 देखें), या के किसी भी अन्य सेलसंस्कृति घटकों (आंकड़े 3 ए-सी)।

चित्रा 4 nanoparticle सामग्री शुरू करने और रैखिक nanostructures (चित्रा -4 ए) के गठन पर कब्जा करने के एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) छवि सहित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए खोज की उपन्यास संरचनाओं के लक्षण वर्णन से पता चलता है। प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ SEM) (छवियों सामग्री शुरू CNPs के लिए दिखाए जाते हैं, तांबा सल्फेट से गठित एनपीएस, और रैखिक संरचनाओं से गठित रैखिक संरचनाओं (क्रमश: आंकड़े 4 बी-एफ) सामग्री शुरू।

Biocomposites कंपोजिट का एक आवश्यक जैविक घटक के रूप में cystine या cystine व्युत्पन्न सामग्री है कि निहित सत्यापित करने के लिए, का गठन संरचनाओं SEM के माइक्रोस्कोपी के साथ EDX का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। विश्लेषण किया माल से प्रतिनिधि स्क्रीन शॉट्स चित्रा 5 में दिखाया जाता है। महत्वपूर्ण बात है, CNPs से CNPs और biocomposites की तुलना करते समय, एक प्रमुखसामग्री (चित्रा 5A) शुरू करने CNP में मौजूद नहीं है जो सल्फर शिखर प्रकट होता है (चित्रा 5 ब),। इस biocomposite के लिए cystine की उपस्थिति के साथ संगत है, जो सामग्री (चित्रा 5C), कार्बन और नाइट्रोजन चोटियों (चित्रा 5D) दिखाई देते हैं, के रूप में शुरू तांबे सल्फेट का प्रयोग कर biocomposites लिए।

इस समय, संश्लेषण के दौरान लंबाई और कंपोजिट के आकार को नियंत्रित करने के लिए एक विधि की पहचान नहीं की गई है। 6 चित्र में दिखाया के रूप में हालांकि, संरचनाओं का औसत आकार संश्लेषण के बाद से नियंत्रित किया जा सकता है, रैखिक biocomposites समय के विभिन्न अवधियों के लिए sonicated थे जांच करने के लिए। Sonication के वृद्धि की समय के साथ, यह रेखीय biocomposites का औसत आकार के रूप में कमी आई है, दिखाया गया था कि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (आंकड़े 6A-डी) के द्वारा दिखाया गया है। ध्यान दे और गठन कंपोजिट को अलग करने के लिए एक विधि के रूप में, centrifugation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और के रूप में आंकड़े 6E में दिखाया गया हैजी, एक दृश्य गोली का इस्तेमाल किया संस्करणों और centrifugation बलों के आधार पर विकसित किया जा सकता है।

चित्र 1
संश्लेषण डिजाइन की चित्रा 1. प्रतिनिधि प्रवाह चार्ट घन एनपीएस = तांबा नैनोकणों। Cys = cystine। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
पूरा सेल संस्कृति मीडिया के साथ मस्तिष्क ट्यूमर सेल संस्कृतियों में तांबे biocomposite संरचनाओं के चित्रा 2. प्रतिनिधि गठन। 82 घंटा की कुल पर नज़र रखी एक प्रतिनिधि प्रयोग मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं और CNPs (50 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त सेल संस्कृति में दिखाया गया है। पैनलों ए और बी शोसमय 0 पर संस्कृति कुओं, CNPs के बाद अच्छी तरह से नीचे करने के लिए तय हो चुका है। पैनलों में क्रमश: 17, 24, 36, 49, 69, और 82 घंटा में बाद के समय बिंदुओं को दिखाने CH। पैनलों जी और एच 69 और 82 घंटा में इसी क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। सभी छवियों तांबा सामग्री के विपरीत बढ़ाने के लिए brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त किया गया। स्केल सलाखों = ए + बी के लिए 100 माइक्रोन, सीई के लिए 50 माइक्रोन, और एफ + जी के लिए 25 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
7 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ चित्रा 1 में और नयाचार अनुभाग में संकेत के रूप में रेखीय biocomposites को CNPs की चित्रा 3। परिवर्तन। CNPs cystine और पानी के साथ संयुक्त थे। पैनल एक समय 0 पर संश्लेषण पोत से पता चलता है, पैनल बी 3 घंटा पता चलता है, और पैनल सी श6 घंटा OWS। छवियाँ संकेत दिया पैमाने पर पट्टी (50 माइक्रोन) के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त किया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. संश्लेषित biocomposites की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लक्षण वर्णन पैनल (ए):। CNP के मंदिर के गठन रैखिक कंपोजिट साथ सामग्री (दौर) शुरू। पैनल (बी) और (सी) SEM का उपयोग शुरू कर CNPs के लक्षण वर्णन दिखा। पैनल (सी) (बी) के एक जूम छवि है। पैनल (डी) CNPs और cystine से गठित कंपोजिट के SEM पता चलता है। पैनल (ई) और तांबे सल्फेट biocomposites (एफ) में शो एसईएम। पैनल (एफ) एक zoome है(ई) के डी छवि। स्केल सलाखों सभी छवियों में संकेत कर रहे हैं और (ए) में = 200 एनएम, (बी) में 1 माइक्रोन, (सी) में 500 एनएम, (डी), (ई) में 2 माइक्रोन, और में 1 माइक्रोन में 5 माइक्रोन (एफ )। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
शुरू होने वाले माल और संश्लेषित रैखिक कंपोजिट चित्रा 5। EDX (SEM) के विश्लेषण। मौलिक सामग्री के लिए EDX विश्लेषण का उपयोग SEM के स्कैन किया नमूनों की स्क्रीन फोटो। पैनल (ए) = CNPs शुरू कर; पैनल (बी) CNPs और cystine से biocomposites =; पैनल (सी) = कॉपर सल्फेट शुरू सामग्री, और पैनल (डी), fro कंपोजिट =एम तांबा सल्फेट और cystine। शिखर लेबलिंग, सी = कार्बन, हे = ऑक्सीजन, घन = तांबा, एस = सल्फर, और एन = नाइट्रोजन के लिए। मौलिक पहचान के लिए बड़े लेबल को देखने में आसानी के लिए कुंजी चोटियों के ऊपर रखा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
पैनल (ई) के रूप में दिखाया रेखीय समग्र आकार और एकाग्रता पद संश्लेषण की चित्रा 6। संशोधन। तांबा सल्फेट से संश्लेषित रैखिक संरचनाओं, क्रमश: 0, 15, 30, या 60 मिनट के लिए sonicated थे। छवियाँ सभी छवियों में संकेत दिया 200 माइक्रोन के पैमाने पर पट्टी के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त किया गया। पैनल (ईजी), biocomposites की एकाग्रता का उपयोग कर centrifugation: CNPs (से निकाली गई रैखिक संरचनाओं के 6 मिलीग्राम <मजबूत> ई), छोड़ दिया और तांबे सल्फेट (ई, दाएं) 10 मिनट के बाद गुरुत्वाकर्षण के तहत निपटाने दिखाए जाते हैं। 500 XG पर centrifugation के 10 मिनट के साथ, एक ठोस गोली (पैनल एफ) का गठन किया है। (पैनल जी) (CNP व्युत्पन्न संरचनाओं सही ट्यूब में छोड़ दिया ट्यूब और तांबे सल्फेट व्युत्पन्न संरचनाओं में दिखाया जाता है)। के रूप में दिखाया ही सामग्री की एक छोटी मात्रा (500 μl) केंद्रित था एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण।

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Discussion

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CNPs सहित nanomaterials के संभावित विषाक्त प्रभाव का मूल्यांकन है, यह लंबे समय से अधिक, CNPs एक बड़ा, एकत्रित प्रपत्र को शुरू में एक अधिक बिखरे कण वितरण (चित्रा 2) से बदल रहे थे कि मनाया गया। कुछ मामलों में, जैविक शर्तों के तहत, सेल संस्कृति डिश में उत्पादन किया गया है, जो इन अत्यधिक एकत्रित संरचनाओं, "अर्चिन" युक्त पहले वर्णित कॉपर की याद ताजा केंद्रीय सकल से उच्च रैखिक अनुमानों का गठन 6। यह यहाँ दिखाया शर्तों के तहत, CNPs की एकाग्रता इस प्रकार संस्कृति में कोशिकाओं के सभी को मारने नहीं, उप अधिक से अधिक था कोशिकाओं को जोड़ा कि बताया जाना चाहिए (चित्र 2 देखें)। इन प्रारंभिक टिप्पणियों से, प्रयोगों तो संश्लेषण ओ के लिए आवश्यक शेष प्रमुख घटकों को खोजने के लिए (जो खुद को अंततः कोशिकाओं सहित) सेल संस्कृति शर्तों का क्रमिक अधिक घटकों को नष्ट करने से जारी रखा गयाएफ रैखिक तांबा biocomposites।

हम चाहते हैं कि Cystine, मूल सेल संस्कृतियों के एक पूरक घटक, सही जैविक शर्तों के तहत CNPs के साथ संयुक्त, EDX विश्लेषण से संकेत के रूप में धातु और जैव रासायनिक घटकों दोनों निहित है कि एक उच्च रैखिक biocomposite में nanoparticulate फॉर्म के परिवर्तन में परिणाम सकता है की खोज तैयार नमूनों की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) को स्कैन करके। इस प्रकार, शुरू करने CNP सामग्री में मौजूद नहीं है जो सल्फर, तांबा और जैव रासायनिक सामग्री cystine के घटकों दोनों गठन रैखिक संरचनाओं के लिए आवश्यक हैं यह दर्शाता है कि संश्लेषित biocomposites में एक प्रमुख शिखर से पता चलता है।

यह आगे भी इसी तरह का संश्लेषण शर्तों का उपयोग, लेकिन तांबा सल्फेट के साथ CNPs जगह से, उच्च रैखिक biocomposites भी गठन किया जा सकता है कि दिखाया गया था। वास्तव में, तांबा सल्फेट और cystine का उपयोग कर संश्लेषण "स्वच्छ" में परिणाम हो जाती थी एनतांबा सल्फेट यहां बताया संश्लेषण के सभी में एक विलायक के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो पानी में पूरी तरह से घुलनशील है के बाद से घ उत्पादों, उस में कोई unreacted CNPs, कभी भी मौजूद थे। इसके अलावा, तांबा सल्फेट biocomposites सामग्री की centrifugation पर स्पष्ट किया गया था, जो एक नीले रंग बनाए रखने में CNP व्युत्पन्न कंपोजिट से खुद को प्रतिष्ठित किया।

अन्य समूहों में पहले से तांबा cystine परिसरों का अध्ययन किया और कुछ महत्वपूर्ण रासायनिक गुणों को परिभाषित किया है। उदाहरण के लिए, Kahler एट अल। सुखाने पर स्पष्ट है, लेकिन समाधान 13 में अस्थिर थे जो ठीक फाइबर के रूप में तांबे cystine परिसरों के गठन का प्रदर्शन किया। अन्य उदाहरण में, एल Cystine और विभिन्न धातु फैटायनों साथ complexation पढ़ाई एक जलीय मध्यम 14 में तांबे और cystine जटिल गठन की पुष्टि करता है और गठन परिसरों जटिल गठन 15 के लिए योगदान दे cystine से सल्फर के साथ, मोनोन्यूक्लियर या polynuclear हो सकता है। अध्ययन का एक नंबर रिपोर्टजैविक प्रणालियों में cystine और तांबे के बीच एड बातचीत। उदाहरण के लिए, शारीरिक पीएच पर, तांबा (द्वितीय) अमीनो एसिड से युक्त परिसरों 16, और सल्फर के लिए फार्म नकली प्लाज्मा में हिस्टिडीन और cystine के साथ समन्वय स्थापित आयनों लड़कियों 17 में तांबे की विषाक्तता के खिलाफ रक्षात्मक होना दिखाया गया। इन निष्कर्षों को इस प्रकार तांबा रैखिक biocomposites के गठन के लिए हमारे संश्लेषण तरीकों में सामग्री शुरू करने के साथ complexing में cystine की अनिवार्य भूमिका का समर्थन करते हैं।

इस समय एक संश्लेषण रणनीति अभी तक सीधे यहाँ दिखाया गया व्यक्ति रैखिक biocomposites की लंबाई को नियंत्रित कर सकते हैं कि पहचान नहीं की गई है। हालांकि, वर्णित संश्लेषण में पहचान महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: CNPs शामिल संश्लेषण के मामले में प्रारंभिक सामग्री के sonication द्वारा 1) अच्छा फैलाव; 2) हौसले से तैयार CNPs, कॉपर सल्फेट, और कंपोजिट के प्रभावी संश्लेषण के लिए cystine का उपयोग करें; 3) फ्लास्क में संश्लेषण incubat में अबाधित रहने के लिए अनुमतिया कम से कम 6 घंटे के लिए; और 4) से परहेज "पर प्रतिक्रिया" की स्थिति में जो "साही" प्रकार, एकत्रित कंपोजिट फार्म branched।

संश्लेषण के बाद पूरा हो, यह संरचनाओं के sonication संरचनाओं का औसत आकार (लंबाई) में कमी करने के लिए प्रभावी ढंग से उपयोग किया जा सकता है कि दिखाया गया था। छोटे संरचनाओं जैसे सेल तेज या अन्य biocomposite-सेलुलर बातचीत के रूप में आवेदन में सहायता कर सकते हैं बनाने के लिए sonicating। जैसा कि पहले बताया गया है, एक कम शुल्क (नकारात्मक) फार्म 9 सकारात्मक से मापा जाता है जीटा संभावित बदल cystine के साथ संयोजन के द्वारा इस संश्लेषण के दौरान CNPs के स्थिरीकरण के प्रभारी। आरोप में यह परिवर्तन का गठन कंपोजिट और अधिक सुविधाजनक संरचनाओं की हैंडलिंग बनाता है जो सूखे के रूप या तरल मीडिया में बहुत कम एकत्रीकरण दिखाने क्यों समझाने में सहायता कर सकते हैं।

इन CNP-ली गई है और तांबे सल्फेट व्युत्पन्न संरचनाओं की सूचना संश्लेषण के बाद से ओ किया जाता हैकेन्द्र शासित प्रदेशों के तरल मीडिया में, यह प्रक्रिया घटकों और संश्लेषण की स्थिति की सही अनुपात के साथ, यहां इस्तेमाल मिली लीटर संश्लेषण नुस्खा को बढ़ाया जा सकता है या नीचे मिलीलीटर या उससे अधिक के कई सैकड़ों शामिल करने के लिए है, और जिसका अर्थ है कि उच्च स्केलेबल हो सकता है कि अनुमान है इस प्रकार के रूप में अच्छी तरह से, और अधिक अंतिम उत्पाद उपज की उम्मीद होगी। कारण इन biocomposites की धातु (तांबा) घटक के लिए, यह centrifugation (चित्रा 6) द्वारा संश्लेषित उत्पाद ध्यान केंद्रित करने के लिए काफी सरल है। सामग्री शुरू CNP से गठित Biocomposites एक बार संभवतः कारण unreacted तांबे ऑक्साइड नैनोकणों (चित्रा 6) के लिए, एक गोली में केंद्रित एक काले रंग बरकरार रहती है। इसकी तुलना में, एक गोली में केंद्रित जब तांबे सल्फेट biocomposites जलयोजन 18 के विभिन्न स्तरों के साथ तांबा सल्फेट के गुणों के साथ लगातार एक नीले रंग की है।

यहां बताया उपन्यास संश्लेषण भी अर्थ में स्केलेबल है कि आत्म इकट्ठे लिनकान संरचनाओं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) और पारंपरिक सफेद प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में दिखाया सूक्ष्म पैमाने पर करने के लिए नैनो पैमाने से स्केल (आंकड़े 3 और 6)। यह हाल ही में, इंजीनियर कुंडलित-कुंडली प्रोटीन microfibers का गठन तंतुओं प्रतिदीप्ति रोशनी 19 के तहत मनाया जा करने के लिए अनुमति दी है जो curcumin के शामिल कर सकता है कि सूचित किया गया है कि नोट करने के लिए दिलचस्प है। इसी प्रकार रणनीतियों इमेजिंग के लिए व्यापक ढांचे और / या संवर्द्धन के उत्पादन प्रदान करने के लिए यहाँ की सूचना दी रैखिक कंपोजिट में स्पेसर्स या टैगिंग एजेंटों को शामिल करने के लिए संभव हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mini Vortexer VWR (https://us.vwr.com) 58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2 VWR (https://us.vwr.com) Contact vendor Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) Labnet (http://labnetinternational.com/) C2500-R Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K Labnet (http://labnetinternational.com/) Contact vendor Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner) Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) 1510R-MTH
Balance Sartorius (http://dataweigh.com) Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope Olympus (http://olympusamerica.com TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Scanning Electron Microscope Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) model S-4800
Transmission Electron Microscope Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench Envirco (http://envirco-hvac.com) model PNG62675 Used for sterile cell culture technique

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References

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Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).More

Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).

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