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Bioengineering

생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성

doi: 10.3791/52901 Published: July 8, 2015

Summary

여기서 우리는 생물학적 조건하에 액체 배지에서 신규 한 고 종횡비 biocomposites를 합성 프로토콜을 제시한다. biocomposites 각각의 직경 및 길이에서 마이크로 나노 미터 스케일. 시스틴 결합 구리 나노 입자 (CNPS) 및 황산구리는 합성 용 핵심 부품이다.

Abstract

이 프로토콜의 목적은 높은 종횡비 구조를 갖는 두 개의 신규 biocomposites의 합성을 설명하는 것이다. biocomposites 구리 나노 입자 (CNPS) 또는 금속 성분을 기여 황산구리 중 하나와, 구리 및 시스틴 이루어져있다. 합성 생물학적 조건 (37 ° C)와 24 시간 후의 자기 조립 복합 형태 하에서 액상에서 수행된다. 형성되면, 이러한 복합 재료는 모두 액체 매체와 건조 폼에서 매우 안정적이다. 복합 길이 범위를 마이크로 -하는 나노에서 확장, 몇 미크론에서 직경 25 nm의. 에너지 분산 형 X 선 분광법 (EDX)을 전계 방출 주사 전자 현미경은 따라서 최종 나노 복합 재료에서의 황 원으로서 시스테인을 확인, 출발 CNP 재료 결석 동안 황, NP 유래의 선형 구조 내에 존재하는 것을 입증 . 이러한 선형 나노 및 마이크로 복합 재료의 합성, STR의 길이의 다양한 중uctures는 합성 용기 내에서 형성된다. 합성 후 액상 혼합물의 초음파 처리는 초음파 처리 시간 증가로 평균 길이를 감소하여 구조물의 평균 크기를 제어하는​​데 도움이 입증되었다. 형성된 구조는 고도로 응집하지 않는 안정한 액상이 형성되어 있기 때문에, 원심 분리는 또한 집중 형성된 복합체 편석을 돕기 위해 사용될 수있다.

Protocol

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실험 1. 계획

  1. 합성에 필요한 구리 나노 복합 재료의 양을 결정합니다. 그 기준으로, 작은 볼륨 플라스크 (25cm 2), 또는 자료의 준비에 아래에 표시된 바와 같이 더 큰 플라스크의 번호를 선택합니다.
  2. 이 합성에 대해, 5 % CO 2와 적어도 40 %의 습도와 37 ° C의 배양기를 사용한다. 이러한 보육이 가능하며 반복적으로 합성의 시간 (약 24 시간) 이상 방해되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
    주의 : 반복 열기 및 인큐베이터의 폐쇄 확실히 나노 복합 구조의 변형 합성 될 수 있습니다 온도 변화의 원인이됩니다.

재료 2. 준비

  1. 합성을 시작하는 것입니다 직전 용매에 고체 물질을 추가하여, 실험 시작하기 전에 신선한 모든 재료를 준비합니다. 긴 시간 B에 대한 액체에 시스틴과 구리 출발 물질의 재고 솔루션을 유지는 efore 실험은 권장되지 않으며 변수의 결과가 발생할 수 있습니다. 일단 파라 필름과 용기의 상단을 포장하여 건조 원료 공급 업체에서 계속 열었다.
    주 : 다음 프로토콜 시스틴 7 μL, 멸균 6643 μL 및 CNPS 350 μL를 사용하여 25cm 2 세포 배양 플라스크 내의 반응 예로서 사용된다.
  2. CNPS의 최소 2 mg의를 무게에 의해 구리 나노 입자의 2 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다. 피부에 CNPS 가능한 접촉을 방지하기 위해이 단계에서 일회용 장갑을 착용 할 것. 빈 멸균 16 mL 유리 병에 나노 입자를 놓습니다.
    1. CNPS이 들어있는 유리 병에, 2 ㎎ / ㎖ 용액을 합성 시작하기 전에 나노 입자의 분산을 제공하기 위해 20 초 동안 솔루션을 와동 적절한 볼륨에서 멸균 탈 이온수를 추가 (최소 1 ml의 총 부피 권장). 이 소용돌이로 교반하여 혼합 억제하므로 물을 유리 병의 절반 이상이 방법을 기입하지 마십시오. CNPS 줘야난 빠르게 유리 병의 바닥에 정착 (검정 회색) 색상 어두운 나타납니다.
    2. 합성의 시작하기 전에 CNPS의 최대 분산을 제공하기 위해 실온에서 17 분 동안 CNP 솔루션을 sonicate하세요. 주기적으로 CNPS은 초음파로 인해 혼합되어 있는지 확인하십시오. 성공적인 초음파 처리 후, CNPS 적어도 30 분 동안 용액에 현탁 상태로 유지하고, 용액의 색은 어두운 것이다.
  3. 합성 72.9 ㎎ / ㎖ 용액을 만들기 위해 충분한 시스틴의 질량을 단다. 시스틴 물에 직접 용해하지 않기 때문에, 대전 계량 용기에 칭량 시스틴 놓는다.
    1. 시스틴이 완전히 용해되도록 계량 용기 포함 시스틴에, 멸균, 1 M NaOH를 충분한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 72.9 ㎎ / ㎖ 용액을 만들기 위해, 1 M NaOH를 100 μL 완전히 시스틴 7.29 mg을 용해.
    2. 멸균 흐름 조직 문화 후드에서이 단계를 수행, 무균 상태를 유지합니다.
      주의 : 수산화 나트륨1 M 농도가 가성이다에서, 그래서 피부에 농축 된 수산화 나트륨의 접촉을 방지하기 위해이 단계에서 일회용 장갑을 착용
  4. 무균 조직 배양 후드에서 작업, 먼저 멸균 합성 플라스크에 멸균의 6643 μL과 시스틴의 7 μl를 추가하고, 플라스크 캡으로 37 ° C에서 인큐베이터에서 30 분 동안 품어 보자 효과 제공 (느슨한) 배출 혼합. CNPS는 초음파 단계 후에 정착하기 때문에, 30 초 동안 볼 텍싱하여 2 ㎎ / ㎖ 용액을 CNP 재현 탁.
    1. 합성을 시작하도록 25cm 2 세포 배양 플라스크에 멸균 수, 50 부 CNPS 및 949 부를 1 부품 시스틴 결합 : 다음의 성분 비율을 유지하기 위해 (무균 기술을 사용하여) 합성 플라스크에 충분한 CNP 용액을 추가한다. 예를 들어, 7 mL의 합성 볼륨, 시스틴 원액 7 μL, CNPS 350 μL, 멸균 물 6643 μL를 결합한다. 플라스크에 뚜껑을 교체하고 그래서 SECUR가 있음을 조전자.
    2. 합성을위한 모든 구성 요소를 조합 한 후, 가볍게 4-5 회 소용돌이에 의해 플라스크에 혼합한다. CO 2 배양기에서 플라스크를 놓고와 합성 동안 플라스크 중 가스 교환이 될 수 있도록 뚜껑을 풀어 플라스크를 배출.
  5. 합성이 약 24 시간 동안 인큐베이터에서 실행할 수 있습니다. 합성 중 하나는, 현미경과 눈으로, 높은 선형 복합의 형성을 관찰 할 수있다.
    주 : 구조체의 형성 과정은 구조가 초기에 감지하기 어려운 것을 의미에서 갑자기 발생할 수 후 외관 밀도 증가에 신속하게 진행한다. 형성은 따라서 24 시간 전에 발생할 수 있습니다. 큰 구조 및 그 밀도가 증가하게되면 프로세스는 육안으로 관찰 될 수있다. 구조물의 생성 이후 시점에서 현미경으로 눈에 의해 시간이 지남에 따라 관찰 될 수 있지만, 연속 합성 조건을 중단하고 온도 불량으로 이어질합성 결과.
  6. 단단히 합성 플라스크 상한 및 냉장고 (4 ℃)에서 선박을 저장하여 biocomposites의 합성을 종료합니다. 한번 생성 된 구조는 1 년 이상이 형태로 안정적으로 유지. 사용되는 구성 요소, 합성의 날짜 및 종료 전에 합성의 배양 시간을 포함하여 합성 조건과 플라스크 레이블.

구리 황산을 사용하여 3. 합성

  1. 황산구리 염 CNPS 대체하여 자기 조립 합성을 수행. 멸균 기법을 사용하여, 2 ㎎ / ㎖ 용액을 멸균 증류수 충분한 부피 황산구리 적어도 2 mg을 용해. 황산동 결정을 쉽게 농도로 용액에 들어가 있지만, 필요한 경우 바이알 와동 모든 결정체가 용해되어 육안으로 확인하기 위해 검사한다.
  2. 전술하지만 황산구리 CNPS 대체로서 황산동의 제조 후, 합성을 수행한다.
    주 : 출발 물질로서 황산 구리를 사용하여 자기 조립 된 나노 복합 재료가 CNPS 합성 구조물의 최종 형상보다 훨씬 더 일관되게 나타났다.
  3. CNP의 복합 재료로 구리 황산 biocomposites의 합성을 종료 (2.6 단계), 4 ℃에서 그들에게 장기를 저장합니다.

4. 특성화 및 Biocomposites 후 합성 처리

  1. CNPS에서 흰색 빛 현미경 (9)에 의해 구리 황산에서와 전자 현미경 (9)에 의해 유도 된 biocomposites을 특성화.
    1. 합성 플라스크 평 누워의 몇 분 이내에 플라스크의 바닥 표면에 정착하는 바와 같이 특성화 및 biocomposites 백색광 현미경으로 합성 후 검사를 들어, 거꾸로 현미경을 사용하여, 다음 포커스하게 할 수있다. biocomposites 및 액체 매질 사이의 대비를 극대화하기 위해 현미경의 시야 설정을 사용합니다. CNPS과 경찰에서 파생 된 복합황산 당 모두 색상의 불투명 분명 나타날 것입니다 만, 미 반응 CNP 집계 색상에 매우 어두운 나타납니다.
      1. 복합 이미지를 캡처하기 위해 현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용한다. 개별 구조물의 길이의 범위가 관찰됩니다.
    2. 특성화 및 biocomposites 합성 후 검사의 경우 4 ℃에서 저장 한 후, 플라스크 현미경 이미징을 수행하는 동안 집중 효과가 모호합니다 냉장고에서 제거에 처음 응축을 형성하므로 플라스크 적어도 15 분 동안 실온으로 올 수 있습니다. RT로 평형을 허용 한 후, 현미경 이미징 품질을 최대화하기 위해 깨끗한 종이 타월로 플라스크의 상부 및 하부 표면을 닦아.
    3. 냉장고에있는 동안 형성 복합 재료의 덩어리를 떼어 놓다 30 초 동안 장기 저장되어있는 또는 영상 복합, 소용돌이 플라스크를 작업 할 때. 텍싱 후, 반전 마이크와 구조를 검사roscope는 집계가 해리했는지 확인하고 필요 텍싱 반복합니다.
    4. CNPS를 사용하여 주어진 실험 합성의 효능을 평가하기 위해 반전 된 백색광 현미경을 사용한다. 예를 들어, 합성시와 같은 다른 파라미터를 가지는 플라스크에서 CNP 유래 biocomposites 사용 합성 플라스크 CNPS 미 반응의 유무를 기록.
      개별 CNPS는 광학 현미경으로 관찰하기에 너무 작지만 미 CNP은 높은 종횡비, 선형 형태를 가질 것이다 성공적으로 합성 CNP 합성물 달리, 둥근 모양과 어두운 객체로 나타난다 집계 한 참고 서로 다른 길이의 범위를해야합니다. 이것이 일단 형성되면 개별 구조로 분산시키는 것이 곤란하다 고도로 분지 "게"형 구조물을 초래할 것 같은 종료 전에 일정 기간 너무 오랫동안 합성을 수행 피한다.
    5. 효능을 평가하기 위해 반전 하얀 빛 현미경을 사용하여황산구리를 사용하여 주어진 실험 합성. 황산동이 프로토콜을 이용하여 용액에 완전히 나가기 때문에, 용액을 사용 CNPS 합성 용액으로부터보다 어둡게 나타날 것이다. 이러한 종료​​ 전에 합성 시간으로서 다른 합성 조건에 플라스크를 비교하여 황산구리 복합체의 크기와 정도를 문서화.
      참고 : 성공적으로 합성 된 복합 재료가 서로 다른 길이의 범위를 표시합니다. 이 "성게 같은"구조 될 것입니다 일부 복합의 높은 분기 집계 결과 바와 같이, 종료 전에 시간의 기간이 너무 오래 합성을 수행하지 않도록하고있는 일단 형성되면 개별 구조로 분산하기가 어렵습니다 .
  2. biocomposites를 합성 후, 원심 분리 튜브에서 원심 복합 솔루션을 집중. 15 ㎖의 원심 분리 관에 CNP 유래 구조 또는 구리 황산 파생 구조 중 6 ML을 추가합니다. 10 분 동안 원심 분리기RT 500 XG에 펠릿을 형성 하였다. 작은 볼륨의 경우, 0.6 ml의 크기의 튜브에 솔루션 구조의 500 μl를 추가합니다. 적어도 10 분 동안 실온에서 2000 XG에 원심 펠렛을 형성 하였다.
    1. 충분한 시간 동안 (microfuges 적어도 10 분)을 원심 분리 한 후, 구조가 심하게 펠릿 상기 상등액을 제거하여 농축 튜브의 하단에 관찰 된 펠릿을 저장한다. 구리 황산에서 파생 Biocomposite 구조는 색상과 CNPS에서 파생 된 구조의 청색 어두운 (검정 회색)되어 나타납니다.
    2. 이 튜브에 더 많은 복합 재료를 추가하고 필요한 경우 구조를 집중하기 위해 동일한 튜브의 과정을 반복한다. 농축 된 알약을 분산하기 위해 10 ~ 30 초 동안 원하는 튜브 용액의 부피, 소용돌이를 추가합니다.
  3. 초음파 처리 구조는 한번 값을 낮추는 구조의 인구 평균 크기 (길이)를 이동하도록 형성되어있다. 르 멸균 탈 이온수 및 초음파 처리에 넣어 구조AST 10 분. 시간이 지남에 따라이 공정을 이용하여, 구조가 단편화 및 평균 길이 (텍스트도 6 참조)에서 작아진다. 역 하얀 빛 현미경과 디지털 카메라를 사용하여 서로 다른 초음파 시간과 복합 크기의 문서 변경.

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Representative Results

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도 1은 본 연구에서 설명한 선형 biocomposites을 형성하는 합성 단계의 흐름도의 개략을 나타낸다. 출발 원료로 CNPS 또는 황산구리는 2 ㎎ / ㎖ 용액을 형성하기 위해 멸균 수와 함께,이 용액을 혼합하고 균일 혼합을 제공하는 초음파 처리하고,이 구리 용액을 합성에 대해 다음과 같은 비율로 혼합되어있다 : 949 부 멸균 물 : 50 부 구리 혼합물 : 1 부 시스틴 원액. 실제 볼륨은 확장 또는 최종 합성 수율을 확장 할 수있는 이러한 비율에 따라 증가 또는 감소 할 수있다. 시간이 지남에 따라 모양이 액체 용액 변화에 따라 정상 백색광 또는 현미경 하에서 육안으로 관찰 할 수있는 표시, 선형 biocomposite 구조가 형성된 적어도 2 시간 동안 배양 한 후.

도 2는 전체 세포 배양 매체 O 이러한 선형 구조물의 초기 탐색에서 대표적인 결과를 나타낸다82 시간의 기간을 VER. 우리의 실험은 세포와 암 세포를 정상에 CNPS 등 다양한 나노 물질의 잠재적 인 독성 평가를 실시하고,도 2에 도시 된 세포는 ATCC (CRL-2020)에서 급성장 뇌종양 세포주이다. 이 세포에 사용되는 전체 미디어의 핵심 보충이 선형 구조 (아래 참조 및 토론 섹션) 문화에서 형성 이유의 발견에 필수적인 구성 요소로 밝혀졌다 시스틴이다. 이는 신속하게 집계 마이크로 (도 2A와 2B)로, 작은 입자가 삭제되어 더 큰 집계 (도 2C2D)를 형성 시간에 CNPS의 초기에도 분산에서. 최종적으로, 미세 선형 구조를 갖는 큰 응집체는 비 BIOL을 사용 이전에 문헌에보고 "게"형 구조물을 형성하는 동일한 웰 (도 2E-H)에 표시ogical 방법 6. 69 및 82 시간에서 최종 두 시점의 비교는 (2G2H, 각각 피규어) 똑같은 필드 이미징으로 나타낸 바와 같이 큰 게 형 구조의 개발이 매우 안정적으로 유지 보여준다.

세포 배양에서의 이러한 조건이 게 같은 구조를 관찰하는 이유를 설명하기 위해 필수적인 요소가 분리 될 수 있는지 결정하기 위해 미디어 구성 요소를 제거하기 시작했다. 우리는 세포 배양 배지에 주요 구성 요소 및 보충 제거의 처리에 의해 최종적으로 자기 조립 공정에 필수 성분으로 확인되었다 시스틴 것을 발견했다. 합성 성분을 단순화하여 셀의 필요없이, 우리는 궁극적으로, 선형 형태로 나노 입자 형태로 변환하는 시간이 지남에 따라 도시 될 수있는 높은 종횡비 (선형) 액체의 구조 등을 형성 할 수 있었다 (도 1 참조), 또는 임의 다른 세포문화 구성 요소 (도 3A-C).

도 4는 나노 입자는 출발 물질 및 선형 나노 구조물을 (도 4a)을 형성 캡처 투과형 전자 현미경 (TEM) 이미지를 포함한 전자 현미경을 이용하여 발견 된 신규 한 구조의 특성을 도시한다. 주제 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지를 출발 물질 CNPS 위해 도시되어 황산구리 형성된 NP에, 선형 구조로부터 형성된 선형 구조물 (각각도 4B-F)을 출발 물질에게.

biocomposites는 복합 재료의 필수적인 생물학적 요소로 시스틴 또는 시스틴 유래 물질을 포함하는지 확인하려면, 형성된 구조는 SEM 현미경으로 EDX를 이용하여 분석 하였다. 분석 자료에서 대표 스크린 샷은 그림 5에 표시됩니다. 중요한 것은, CNPS에서 CNPS과 biocomposites을 비교할 때, 눈에 띄는재료 (도 5a)을 출발 CNP에 존재하지 황 피크 나타난다 (도 5B). 이 biocomposite위한 시스틴의 존재와 일치하는 물질 (도 5c), 탄소 및 질소의 피크 (도 5D) 표시를 시작으로 황산구리를 사용 biocomposites 들어.

이때, 합성시의 길이와 복합 재료의 크기를 제어하는​​ 방법이 발견되지 않았다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 그러나, 구조의 평균 크기는 합성 후 제어 할 수 있으면, 선형 biocomposites는 서로 다른 시간 동안 초음파 처리 하였다보고자 하였다. 초음파 증가 된 시간으로, 이는 선형 biocomposites의 평균 크기로 감소 것으로 나타났다 명 시야 현미경 (도 6A-D)에 의해 도시. 집중 및 형성된 복합체를 분리시키는 방법 으로서는, 원심 분리에 이용할 수 있고,로는도 6E에 도시-G, 가시 펠릿 사용 볼륨과 원심 분리의 힘에 따라 개발 될 수있다.

그림 1
합성 설계의 대표도 1의 흐름도의 Cu = NP에 구리 나노 입자.; 시스테인 = 시스틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
완전한 세포 배양 배지와 뇌종양 세포 배양 구리 biocomposite 구조도 2 주제 형성. 82 시간의 합계를 통해 추적 대표적인 실험 뇌종양 세포와 CNPS (50 μg의 / ㎖)를 함유하는 세포 배양 물에 나타낸다. 패널 A와 B 쇼시간 0에서 문화 우물, CNPS 후 잘 하단에 정착했다. 패널은 각각 17, 24, 36, 49, 69, 및 82 시간에서 후속 시점을 표시 CH. 패널 G와 H는 69, 82 시간에 같은 필드를 나타냅니다. 모든 이미지는 구리 재질의 콘트라스트를 향상시키기 위해 명 시야 현미경을 사용하여 얻어졌다. 스케일 바 = A + B 100 미크론, CE 50 미크론 및 F + G를 25 미크론. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
7 ml의 총 부피로도 1 및 프로토콜 부분에 표시된 바와 같이 선형 biocomposites에 CNPS의도 3. 변형. CNPS은 시스틴 및 물과 결합 하였다. 패널은 시간 0에서 합성 용기를 보여, 패널 B는 3 시간을 보여 주며, 패널 C 쉬6 시간을 OWS. 이미지가 표시된 눈금 막대 (50 미크론)와 브라이트 현미경을 사용하여 얻을 수 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 합성 biocomposites의 전자 현미경 특성 패널 (A). CNP의 TEM 형성 선형 복합 재료와 재료 (라운드를) 시작. 패널 (B)(C)는 SEM을 이용하여 출발 CNPS의 특성을 나타낸다. 패널 (C)는 (B)의 확대 된 이미지입니다. 패널 (D)는 CNPS과 시스틴에서 형성된 복합체의 SEM을 보여줍니다. 패널 (E) 및 황산구리 biocomposites의 (F)의 SEM보기. 패널 (F)는 zoome입니다(E)의 D 이미지. 스케일 바는 모든 이미지에 표시되고, (A)에서 = 200 nm 인, (B)에 1 미크론 (C)에서 500 nm 인, (D), (E) 2 미크론, 및 1 미크론에서 5 미크론 (F ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
출발 물질 및 합성 선형 복합체도 5. EDX (SEM) 분석. 원소 함유량에 대한 EDX 분석을 이용하여 샘플의 SEM 스캔 스크린 스냅 샷. 패널 (A) = CNPS 시작; 패널 (B)는 CNPS과 시스틴에서 biocomposites을 =; 패널 (C) = 황산구리 출발 물질, 및 패널 (D)의 합성을 이리저리 =m 황산구리 및 시스테인. 피크 라벨, C = 탄소, O = 산소, 구리 = 구리, S = 황, 및 N = 질소. 원소의 정체성에 대한 큰 레이블이보기 쉽도록 주요 봉우리 위에 배치되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
패널 (AD)에 도시 된 바와 같이 선형 복합 크기 및 농도 포스트 합성도 6. 변형. 황산구리 합성 선형 구조는, 각각 0, 15, 30 또는 60 분 동안 초음파 처리 하였다. 이미지는 모든 이미지에 표시된 200 마이크론의 규모 바 시야 현미경을 사용하여 얻을 수 있었다. 패널 (EG), biocomposites의 농도를 사용하여 원심 분리 : CNPS (에서 파생 된 선형 구조의 6 ml의 <강한> E), 왼쪽과 황산구리 (E를, 오른쪽) 10 분 후 중력 침전 표시됩니다. 500 XG에 원심 분리의 10 분으로 압축 된 펠렛 (패널 F)를 형성한다. (패널 G) (CNP 유래 구조가 오른쪽 튜브에서 왼쪽 튜브와 구리 황산염 유래의 구조에 도시되어있다). 도시 된 바와 같이 동일한 재료로 작은 부피 (500 μL)을 농축시키고, 큰 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 버전입니다.

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Discussion

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CNPS 포함 된 나노 물질의 잠재적 인 독성을 평가하는 동안, 이것은 장기적, CNPS는 큰 응집 형태로 초기에 더 분산 미립자 분포 (도 2)로 형질 전환시키고 있음을 관찰 하였다. 일부의 경우, 생물학적 조건 하에서 세포 배양 접시에서 생산 된 이러한 고도로 응집 된 구조물은 "게"를 포함하는 전술 구리 연상시키는 중앙 집합체에서 높은 선형 돌기를 형성 6. 그것은 여기에 나타낸 조건, CNPS 농도 따라서 배양에서 세포의 전부 사망하지 서브 최대였다 세포에 첨가 될 수 있음을 지적한다 (도 2 참조). 이러한 초기 관찰로부터, 실험은 합성에 필요한 O 나머지 주요 구성 요소를 찾기 위해 (그 자체를 포함하여 최종적으로 세포) 세포 배양 조건의 연속 이상의 성분을 제거함으로써 계속 하였다F 선형 구리 biocomposites.

우리는 시스틴, 원래 세포 배양 물의 보충 성분, 정확한 생체 조건 CNPS과 결합 될 때, EDX 분석에 의해 나타낸 바와 같이, 금속, 생화학 적 구성 요소를 모두 포함 고선형 biocomposite으로 나노 입자의 형태의 변형을 초래할 수 발견 제조 된 샘플의 전자 현미경 (도 5)에 의해 스캔. 따라서, CNP 출발 물질에 존재하지 황, 구리 및 생화학 물질 시스틴의 요소가 모두 선형 구조 형성에 필수적인 것을 나타내는 합성 biocomposites에서 두드러진 피크를 나타낸다.

이는 상기 합성 유사한 조건을 사용하지만, 황산구리 CNPS 대체함으로써, 높은 선형성 biocomposites도 형성 될 수 있음을 도시 하였다. 사실, 황산구리 및 시스테인을 사용하는 합성이 "깨끗한"초래하는 경향 EN황산구리가 여기에보고 합성의 모든 용매로 사용되었다 물에 완전히 용해하기 때문에 D 제품은 점에서 미 반응 CNPS는 이제까지 존재하지 않습니다. 또한, 구리 - 황산 biocomposites은 재료의 원심 분리에 따라 분명했다 푸른 색을 유지에 CNP 파생 복합로부터 자신을 구별.

다른 그룹은 이전에 구리 - 시스틴 단지를 공부하고 몇 가지 중요한 화학적 특성을 정의했습니다. 예를 들어, 칼러는 외. 건조시 명백하지만 용액 13 불안정 미세 섬유의 형태, 시스틴 구리 착물의 형성을 보였다. 다른 예에서, L 시스틴 및 다른 금속 양이온과 착물 화 연구는 수성 매질 (14) 내의 구리 및 시스틴 착물 형성을 확인하여 형성된 복합체는 복합체 형성 15에 기여 시스틴에서 황, 단핵 또는 다핵 수있다. 다수의 연구 보고서가생물학적 시스템에서 시스틴과 구리 사이 에드 상호 작용. 예를 들어, 생리 학적 pH에서, 구리 (II)의 아미노산을 함유하는 복합체 (16), 및 황을 형성하는 시뮬레이션 플라즈마 히스티딘 및 시스테인으로 좌표 이온 병아리 17 구리 독성에 대해 보호하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 결과는 구리 선형 biocomposites 형성 우리의 합성 방법에서, 출발 물질과의 복합체에서 시스틴 중요한 역할을지지한다.

이때 합성 전략은 아직 직접 여기에 도시 된 개개의 선형 biocomposites의 길이를 제어 할 수있는 것을 발견되지 않았다. 그러나, 기술 된 합성에서 식별 중요한 단계는 포함 CNPS 통합 합성의 경우 원료의 초음파로 1) 양호한 분산; 2) 새롭게 제조 CNPS, 황산구리, 및 복합 재료의 효과적인 합성 시스테인의 사용; 3) 플라스크에 합성 incubat에 방해받지 유지 할 수 있도록적어도 6 시간; 4) 예방 "과잉 반응"조건이있는 "게"형, 집계 복합 형태의 분지.

합성이 완료되면, 그 구조의 초음파가 구조물의 평균 크기 (길이)를 감소하기 위해 효과적으로 이용 될 수 있음을 도시 하였다. 작은 구조는 세포 흡수 또는 다른 biocomposite - 세포 상호 작용과 같은 응용 프로그램에 도움이 될 수 있도록 초음파 처리. 이전에보고 된 바와 같이, 덜 충전 (음) 형태 9 긍정적 인에서 측정 된 제타 전위를 변경 시스틴과 결합하여 합성하는 동안 CNPS의 안정화를 부과합니다. 담당이 변경 형성된 복합 훨씬 더 편리한 구조의 처리를하게 건조 된 형태 또는 액체 매체에있는 약간의 응집을 보여 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이러한 CNP 유래 및 황산구리 유래 구조의보고 이후 합성 o를 실시UT는 액체 매질에서, 처리 구성 요소와 합성 조건의 정확한 비율로, 여기서 사용 밀리리터 합성 제조법은 확장 할 수있는 또는 아래 밀리리터 이상의 수백을 포함하고, 즉, 고도로 확장 될 수 있음을 예상된다 따라서뿐만 아니라, 더 많은 최종 제품을 수득 할 것으로 예상된다. 때문에 이러한 biocomposites의 금속 (구리) 구성 요소로,이를 원심 분리 (그림 6)에 의해 합성 제품을 집중하는 것은 매우 간단합니다. 출발 물질 CNP 형성 Biocomposites 한 번 가능성으로 인해 미 반응 구리 산화물 나노 입자 (그림 6)에, 펠릿에 집중 어두운 색상을 유지합니다. 이에 비해, 펠릿으로 농축 황산구리 biocomposites 수화 (18)의 다양한 레벨과 황산구리의 속성과 일치하는 청색을 갖는다.

여기에보고 된 신규 한 합성은 또한 의미에서 스케일 러블하다 자기 조립 LIN귀 구조는 전자 현미경 (도 4) 및 기존 백색광 현미경 사용하여 도시 된 바와 같이 마이크로 스케일의 나노 스케일에서 스케일링 (도 3 및도 6). 그것은 최근 설계 코일 코일 단백질 미세 섬유가 형성 섬유 형광 조명 (19)으로 관찰 할 수 있도록 허용 커큐민을 통합 할 수있는보고 된 것을주의하는 것이 재미있다. 유사한 전략이 이미징을위한 더 큰 구조 및 / 또는 향상된 생산을 제공하기 위해 여기에보고 선형 복합체에 스페이서 또는 태깅 에이전트를 포함하는 것이 가능할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mini Vortexer VWR (https://us.vwr.com) 58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2 VWR (https://us.vwr.com) Contact vendor Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge) Labnet (http://labnetinternational.com/) C2500-R Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K Labnet (http://labnetinternational.com/) Contact vendor Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner) Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/) 1510R-MTH
Balance Sartorius (http://dataweigh.com) Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope Olympus (http://olympusamerica.com TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives Olympus (http://olympusamerica.com Contact vendor
Scanning Electron Microscope Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html) model S-4800
Transmission Electron Microscope Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html) model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench Envirco (http://envirco-hvac.com) model PNG62675 Used for sterile cell culture technique

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References

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생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성
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Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).More

Cotton Kelly, K., Wasserman, J. R., Deodhar, S., Huckaby, J., DeCoster, M. A. Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium. J. Vis. Exp. (101), e52901, doi:10.3791/52901 (2015).

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