ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

Introduction

虚血および再灌流の両方に対する心臓応答の基礎となる事象の解明は、心筋梗塞¹および大動脈クロスクランプ^2を必要とする心臓の外科手術の治療の向上に不可欠です。虚血再灌流障害のin vivoモデルは、非常に有用なエンドポイント解析を可能にするが、それらはリアルタイムで急性虚血再灌流障害の機能的効果を研究するように有効ではありません。さらに、 インビボでの虚血再灌流モデルは、一般的に梗塞サイズで有意な変動を生成し、再灌流時の心臓への薬剤の直接送達は、困難です。虚血再灌流障害を研究するためのランゲンドルフ単離心臓システムの利用は薬理学的治療、梗塞組織の均一な領域と、直接心筋への薬物の瞬間デリバリーのリアルタイム機能評価を可能にします。

最初のBを記載1895年³中のyオスカーランゲンドルフ、ランゲンドルフ単離された心臓は、過去40年間^4,5のために、虚血再灌流研究に用いられている、虚血再灌流障害を研究するための堅牢なモデルです。ここでは、いくつかの変更は、機能解析のために、単離された心臓を最適化するために行われる。大動脈のその場挿管で心臓が鼓動を心臓が虚血再灌流試験⁶の結果を変化させる虚血プレコンディショニングを、経験していないことが保証されています。これを容易にするために、気管切開は、換気を可能にし、手術中、ラットの生理学的安定性を確保することが行われます。心臓は、その後、クレブスヘンゼライト緩衝液を大動脈に直接逆行性灌流を介して配信され、それを通してガラスウォータージャケットスパイラルカラムに取り付けられています。生理食塩水で満たされたバルーンを左心室に挿入し、心室AN内からの圧力の実時間測定を可能にする圧力トランスデューサーに取り付けられています。複数の機能パラメータのd計算。実験の終了時に、心臓が収縮し、DNA、RNAおよびタンパク質レベルのダウンストリーム解析を可能にするために、液体窒素中で急速冷凍を逮捕するために、冷生理食塩水でフラッシュされます。このように変更され、ランゲンドルフ灌流心臓は虚血再灌流障害の間に急性任意の時点での薬理学的介入の生理的効果を直接監視するための効果的なシステムとして機能します。

Protocol

ここに記載されたすべての手順は、サウスカロライナ医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。ここに記載した実験は、急性、非生存実験です。このように、そこに眼軟膏のない使用はありませんし、無菌手術室は必要ありません。安楽死は、心臓の収穫時に放血することによって達成されます。

1。実験の準備

1. 一定圧力または一定流量、ランゲンドルフ灌流装置⁴のいずれかを設定します。
2. （：112のNaCl、5 KClを、1.2 _硫酸マグネシウム、1 K ₂ HPO _4、1.25のCaCl _2、25のNaHCO _3、11 D-グルコース、0.2オクタン酸、pH値= 7.4ミリモル）に変更されたクレブスヘンゼライト緩衝液の4 Lを準備します。
   1. 10×ストックバッファを作成します。
      1. 3 Lの超純水に塩化ナトリウム、塩化カリウム、 _硫酸マグネシウム、及びK ₂ HPO _4を溶解します。
      2. 500ミリリットル超純水のwiでのCaCl _2を溶解1 N HClを40mlの目。
      3. ゆっくり1.2.1.1で行われたバッファへのCaCl ₂溶液を加えます。 4 L.合計するのに十分な超純水を追加し、0.8ミクロンフィルターを通して濾過する前に、1時間攪拌します。 4℃で保存します。
      4. 4 Lの超純水に_炭酸水素ナトリウム_を溶解します。 0.8μmのフィルターで通して濾過する前に1時間攪拌します。 4°Cで保存
   2. 400ミリリットル10倍クレブスヘンゼライト緩衝液を400mlの10倍のNaHCO ₃緩衝液で結合します。攪拌しながら、グルコースおよびオクタン酸を溶かし4 L.合計するのに十分な超純水を追加します。 0.8μmのフィルターを通して濾過します。
3. 心のためのシステムを準備します。
   1. 4 Lボトルにろ過し、バッファの2 Lを追加大動脈カニューレに取り付けられたコック上記に38を置きました。これは推奨灌流圧⁴である心臓に70〜80 mmHgでの灌流圧をお届けします。
   2. ボトル内のバッファにガス分散バブラーを挿入します。
   3. チューブの内部から気泡を除去するようにしてくださいされ、システムを介してバッファを実行します。
   4. 心臓の前に少なくとも30分（95％O _{2/5％CO 2）}ガスをオンにすると、システム上に配置されることになります。酸素飽和度を確認するために、ガス流プローブおよび血液ガス分析装置を使用します。
4. 外科的供給とバルーンを準備します。
   1. 心の収穫については、6.75「手術用はさみ、4.5の1対」ハサミ、止血の二対、caramalt鉗子の二組、27 G針を持つ2つのシリンジ、0 - ゲージ絹縫合糸の2個（約15の1組を準備長さはセンチ）、1 1/16インチ有刺カニューレ、1気管カニューレ。
   2. 気管カニューレを組み立てるには、Yコネクタに1/16インチ径のプラスチック管の短い断片を接着。
   3. バルーン装置を組み立てるには：1/16インチチューブの片に強制経口投与針を取り付け、その後、圧力変換器ハウジングにチューブを接続します。圧力TRの反対側に取り付けられた小型の注射器ansducerハウジングは、バルーンの膨張および収縮が可能になります。
      1. 中心部の強制経口投与針のプラスチックラップと場所先端の正方形をカットします。経管栄養針の周りにラップを包みます。
      2. 生理食塩水でバルーンを記入し、2本の縫合糸で縛ります。漏れがないことを確認するためにバルーンを膨らませます。膨張したバルーン内の生理食塩水の量​​は、およそ200μLであるべきであるが、ラットの大きさに依存して変化し得ます。
      3. あるいは、プラスチックラップの代わりにラテックス指サックを使用しています。指サックの中に強制経口投与針を置き、生理食塩水で満たし、縛ります。

2.収穫の心

1. decapiconeまたは他の手動の拘束装置を使用して、スプラーグドーリーラットを抑制する。ラットを計量。
2. ラットを麻酔するために腹腔内注射を介して、ケタミン/キシラジン混合物（0.85ミリグラム/ kgのケタミンおよび0.15ミリグラム/ kgのキシラジン）を管理します。麻酔薬のこの用量は、のために十分な麻酔を提供します20〜40分が、麻酔が確認された後の手順では、可能な限り迅速に完了する必要があります。
3. つま先ピンチ反射をテストすることによって、麻酔の適切度を確認してください。
4. 気管切開
   1. 切開を作るために毛皮やはさみを上昇させるために止血剤を使用して、顎のベースに半ば前足から毛皮を削除します。一つは毛皮に沿って切断し、それを削除することができ、基礎となる筋肉からそれを分離するために上昇した毛皮を保管してください。
   2. 止血剤を使用して、腺組織を持ち上げ、腺組織に筋膜の横切開が悪くなります。ニックにない頸静脈を注意しながら、オープン切開部を広げるために止血剤を使用してください。
   3. 、止血剤を使用してピンチの筋肉の気管の上にあるし、使用してハサミだけで止血の先端下の筋肉に横切開を行います。止血鉗子を使用して、気管を明らかに離れて組織を広げます。
   4. 静かに止血を前進および後退させることによって進行しながら、筋膜をクリアし、気管の下に止血剤を慎重に挿入します。
   5. 止血剤が正常気管の後ろに配置されると、止血剤で0-0絹縫合糸をつまんではさみの小さな、鋭いペアで気管を二等分します。
   6. 二等分気管に気管カニューレを挿入し、気管の後ろに縫合糸を引っ張ると、カニューレを挿入し、気管の周りに縫合糸を結ぶ、外科医の結び目とカニューレのY-鼠径部に縫合糸を固定します。
   7. 27 G針を使用して、頸静脈に千U / kgのヘパリンを注入し、30秒間を循環させています。
5. 開胸
   1. 止血剤でピンチとハサミで切断することにより、ミッド前足領域に半ば腹部から毛皮を削除します。
   2. ちょうどダイヤフラムの下に、腹部の筋肉壁に¾インチ横切開を加えます。
   3. 胸骨に沿って切断し、腹壁と胸の壁まで縦切開を行います。
   4. 左右のバックダイアフラムをカットし、それが普及のまま確保するために止血剤と心を明らかにするために胸郭、クランプ胸郭を広げます。 止血剤を使用して、静かに上行大動脈を露出し、胸腺を削除します。
   5. 進退止血剤を、ゆっくりと止血の先端を介してできるように筋膜を広げ、大動脈ループを介して止血をいじめます。
   6. 、上行大動脈の後ろに0-0絹縫合糸を引っ張る緩い半正方形の結び目に縫合糸を結ぶために止血剤を使用してください。
   7. 灌流バッファ、二等分する大動脈の流れを開始し、すぐに大動脈内腔にカニューレを挿入するためにコックを回します。急速半正方形の結び目を締める、徹底的に締め、結び目を完了します。
   8. 、離れて大血管から心臓を解剖胸から心臓を除去し、灌流列に接続するはさみを使用してください。
   9. 過剰な肺組織を切り取ると、心臓がバルーンの挿入前に約15分間カラムに平衡化することができます。 10〜20ミリリットル/分の中心部を介してバッファの通常の流量を使用してください。

3.ランゲンドルフ灌流と虚血再灌流障害

1. LV前の配置ssureバルーン
   1. 円錐状に回転させながらバルーンを収縮し、バルーンが収縮したまま確保するためにコックを回します。
   2. 消費税​​は、僧帽弁へのアクセスを露出するようにはさみの小さなペアで心房を残しました。
   3. 左心房と左心室に僧帽弁を介してバルーンを挿入します。
   4. 圧力監視ソフトウェアを起動します（LabChartプロ）。
   5. コックを開け、ゆっくりとマイクロマノメーターから拡張期圧の読みがゼロを超えるまでバルーンに生理食塩水の量​​を増加させることにより、バルーンを膨らませます。
   6. ゆっくりと収縮、長さ張力応答を確認75 mmHgでの拡張期圧にゆっくりバルーンを膨張させるために、一回繰り返します。
   7. バルーンに生理食塩水の量​​を調節することによって、10 mmHgでの拡張期圧を設定します。インフレのこのレベルでバルーンをシールし、LVのバルーンと圧力変換器との間の閉鎖圧力システムを維持するためにコックを回します。
   8. プラスチックと加熱室とカバー室内への低い心。
2. 広告虚血再灌流障害の奉仕
   1. 加熱室の底部を接続し、チャンバが流出し、バッファを充填することを可能にします。
   2. バッファが心を沈めたときに、全体的虚血を誘導する、心臓にバッファの流れを止めるためにストップコックを回します。虚血時間は、実験の目的に依存して変化し得ます。
   3. 虚血の30分後、再灌流を開始し、心臓にバッファの流れを回復するためにコックを回します。
   4. 実験を終了する前に1時間、心臓の再灌流を可能にします。実験の目的に応じて、変数の再灌流時間を使用してください。
3. 実験の終了および組織の収穫
   1. 栓の側面ポートを使用して、心臓を停止させるために10ml /分の速度で心臓に4℃でリン酸緩衝生理食塩水を10mlを投与。
   2. 残りの心房組織を切り取る、潅流カラムから心臓を取り出します。
   3. ペンシルベニア州で覆い、ステンレス鋼の組織スライスマトリックスに心を置きます8分間、または心臓まで-80℃でrafilm、および場所は、マシュマロのような一貫性を持っています。
   4. 冷凍庫からブロックを削除し、2mmのスライスに心をスライスする行列をスライスにrazorbladesを挿入します。組織ブロックは2ミリメートル以外のスライスサイズで購入することができます。
   5. スライスを一度に1つを削除して、生化学的研究のための凍結をフラッシュする液体窒素の中にドロップします。梗塞染色のための頂点から第三脳室のスライスを保持します。
   6. 生化学実験に使用するまで-80℃で液体窒素とストアから組織を削除します。
4. 梗塞染色
   1. 37℃で15分間/ Vの塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）の1％w 10mlに第心室切片をインキュベートします。
      注：TTCでのインキュベーションは、有効¹⁵変化なしで15または30分間行うことができます。
   2. 10％緩衝ホルマリンにTTCから組織切片を移し、室温で一晩インキュベートすることができます。最適な結果を得るために、聞きますTSは、ホルマリンから取り出し、24時間以内に⁴画像化されるべきです。
   3. 写真はスライスを染色し、製造業者のプロトコルに従って梗塞の大きさを推定するために、このようなImageJのようなソフトウェアを使用しています。色素が時間をかけてフェードインしますように、固定後できるだけ早く写真を撮ります。

Representative Results

左心室のバルーン装置は、左心室収縮（ 図1）によって開発された圧力のリアルタイムモニタリングを可能にします。先に⁷に説明したように、この圧力トレースは、心室機能のパラメータの多くを計算することができます。これらの計算は、ベースライン期と同様に再灌流段階で行うことができ、各グループ内で複数のトレース上で平均し、我々は以前に^9を行っているような薬理学的介入は、心臓のプレコンディショニングをもたらしたかどうかを決定するために比較しました。そのようなパラメータは、収縮期血圧と拡張末期圧との差として計算し発生する圧力です。通常の灌流ラット心臓における開発の圧力は70〜130 mmHgの（ 図1A）の範囲とすることができます。虚血性傷害後、発生圧力が減少し、拡張末期圧が上昇（ 図1B）されます。ラットがある場合このようなクラスIおよび^18は、心臓を切除する前に、先進の圧力の低下や虚血再灌流障害に関連した拡張末期圧の上昇が減衰しているのIIb HDAC阻害剤SAHA（ボリノスタット）（ 図1C）として知られている前処理剤を投与しました。このような圧力発生（DP / dtの_最大 ）の速度と左心室機能の他の測定は、圧力緩和（-dP / dtが_最大 ）の速度、及び速度圧力積（RPP）が直接得られるか、から算出することができますソフト出力（ 図2）。虚血性相はまた、虚血の発症後数分以内に圧力発生の見かけの停止と、リアルタイムでモニターすることができます。虚血性収縮も収縮と収縮のピークまでの時間の発症までの時間を測定することによってモニターすることができます。

塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）は、一般的に、代謝の間で区別するために使用されctiveおよび不活性組織、および梗塞染色のためにここで使用されます。いったんアクティブな組織赤色になり、TTCは、代謝酵素によって還元される組織に吸収。非アクティブな組織は、TTCを低下させない、そのように白^8を染色します。虚血再灌流障害のショーの実質的な領域にかけ心は（ 図3）梗塞組織を示し、白染色しながら、虚血性傷害に供されていないランゲンドルフ灌流ラット心臓は、任意の白い部分（図示せず）は表示されません。

図1：左心室のバルーンからの代表的な圧力トレース心室収縮時にLVのバルーンによって記録された圧力。虚血（A）が施されていない心は時間をかけて収縮能のわずかな損失が発生します。虚血（B）にかけハーツIMMEDを表示します強直性収縮に続いて圧力発生のiate損失、。再灌流時には、これらの心の経験がEDPを上昇し、先進の圧力を減少させました。ハーツSAHAで前処理し、虚血（C）にかけ虚血再灌流傷害の減衰を示します。 N =グループあたり1。

図2：心室機能の計算パラメータレート圧力発生（A）、圧力緩和（B）、発生圧力（C）、およびレート圧力物（D）の比率から算出することができる心室機能のいくつかのパラメータがあるの。圧力監視ソフトウェア。

図3：梗塞領域のTTC染色。

Discussion

単離された灌流ラット心臓が正常虚血再灌流傷害⁹心臓プレコンディショニングにおける薬理学的介入の効果を研究するために使用することができます。しかし、再現可能な結果を​​保証するために標準化されなければならない手順をいくつかの重要なステップがあります。システム内で37.4℃の温度を維持することはあっても軽度の低体温と高体温が心臓プレコンディショニング^10,11の原因となりますので、非常に重要です。ケタミンへの長時間の暴露が、心臓のプレコンディショニング¹²を妨げる可能性の心臓の切除に麻酔薬の注射からの経過時間全体を最小限に抑える必要があります。 その場での大動脈のタイムリーな挿管は、心臓切除の前に心臓や動物の放血内の低酸素症の発症を予防するために不可欠です。全体的に、最初の切開からの心臓の除去に時間がもう6-8分以内とします。左心室のBAlloonは、各実験の前に漏れがないかチェックし、必要に応じて交換する必要があります。システムは、細心の注意を払って、各実行後に蒸留水で装置全体をフラッシュするとチューブの内部の漏れや汚染を防止するために、必要に応じて使い古されたチューブを交換するなど、維持されなければなりません。

単離された心臓は、蛍光画像^13、NMR分光法^7、および他の多くの間で光学的マッピング¹⁴を含む新規な用途の任意の数のために修飾することができます。システムはまた、マウスなどの別の動物から心臓を灌流するように変更することができます。それはトランスジェニックマウスを用いた実験を可能にするように、この変更は、特に便利です。マウス心臓のためのシステムを変更するには、より小さなカニューレと小さい灌流列は、他の修正に加えて、使用する必要があります。マウス心臓のためのランゲンドルフ法を利用する方法の詳細な説明は他の場所で^16,17発表されています。の他の修飾このプロトコルは、異なる時点で様々な薬物の投与を含みます。薬理学的プレコンディショニングまたはポストコンディショニングを引き起こす薬剤の能力を調査するときには、虚血再灌流障害に関連して、異なる時点での薬剤を投与することが不可欠です。薬物は、心臓を切除する前に動物に投与し、または薬物は、再灌流時に存在するように心臓がカラム上または虚血性段階の間に配置されているいずれかの前にバッファに混合してもよいです。代わりに、サイドポートプロトコル中の任意の時点で薬剤のボーラスを投与するために使用することができます。さらに、プロトコルは、虚血、再灌流、またはその両方の持続時間を変更するように変更することができます。これは、複数の時点で、機能的および生化学的データの分析を可能にし、薬物の急性効果の時間経過を追跡するために使用することができます。再灌流期間が変更される場合には、再灌流の少なくとも60分neceであることに注意することは重要ですTTC染色のためssaryを効果的に梗塞領域^15を描写します。

虚血再灌流傷害の点で、単離された心臓モデルの主な制限は、 インビボでの虚血再灌流の設定に存在する全身性因子の多くを考慮しないことです。全身影響のこの排除は、ランゲンドルフモデル​​を用いて生成されたデータの分析において考慮されなければならないが、虚血およびその後の再灌流に筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞の応答に関する新たな質問に答えるために、モデルの能力を排除するものではありません。単離された心臓モデルは、短い時間間隔にわたって心臓に対する機能的効果のリアルタイム分析に加えて、虚血再灌流障害に影響を与える変数の多くの完全な操作を可能にします。単離された心臓のシステムを使用して生成されたデータは、薬理学的プレコンディショニングまたはポストコンディショニングの理解に非常に貴重です様々な医薬介入に応答して心。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8