Induktion och Bedömning av ischemi-reperfusion skada i Langendorff-perfusion Rat Hearts

Introduction

Klarläggande av de händelser som ligger bakom hjärt svar på både ischemi och reperfusion är väsentliga för att förbättra behandling av hjärtinfarkt ¹ och hjärtkirurgiska ingrepp som kräver aortatvärkläm ^2. Medan in vivo-modeller av ischemi reperfusionsskada tillåter mycket användbar ändpunktsanalys, är de inte lika effektiva för att studera de funktionella effekterna av ischemi reperfusionsskada akut i realtid. Dessutom, i vivo ischemireperfusion modeller producerar i allmänhet betydande variabilitet i infarktstorlek, och direkt leverans av läkemedel till hjärtat vid tidpunkten för reperfusion är en utmaning. Utnyttjandet av en Langendorff isolerade hjärtsystem för att studera ischemi reperfusionsskada möjliggör realtid funktionell bedömning av farmakologisk behandling, likformig yta på infarktvävnad, och momentan avgivning av läkemedel direkt till hjärtmuskeln.

Först beskrivs by Oscar Langendorff 1895 ^3, är Langendorff isolerade hjärtat en robust modell för att studera ischemireperfusionsskada, har använts i ischemireperfusion forskning under de senaste 40 åren ^4,5. Här är några ändringar gjorts för att optimera den isolerade hjärta för funktionell analys. In situ kanylering av aorta medan hjärta slår säkerställer att hjärtat inte uppleva ischemisk prekonditionering, som skulle kunna ändra resultatet av ischemireperfusion studier ^6. För att underlätta detta är en trakeotomi utförs, vilket tillåter ventilation och säkerställa fysiologisk stabilitet hos råttan under operation. Hjärtat fästes sedan till en glas vattenmantlad spiral kolonn genom vilken Krebs Henseleit-buffert levereras via retrograd perfusion direkt in i aorta. En saltlösningsfylld ballong införes i den vänstra ventrikeln och kopplad till en tryckomvandlare, som möjliggör realtidsmätning av tryck från insidan av ventrikeln end beräkning av multipla funktionella parametrar. Vid slutet av försöket, är hjärtat spolas med kall saltlösning för att arrestera kontraktion och snabbfrystes i flytande kväve för att möjliggöra nedströms analys av DNA, RNA och proteinnivåer. Sålunda modifierade, tjänar Langendorff perfunderades hjärtat som ett effektivt system för direkt övervakning av den fysiologiska effekten av farmakologiska interventioner som helst akut under ischemireperfusionsskada.

Protocol

Alla procedurer som anges här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid medicinska universitetet i South Carolina. De experiment som beskrivs här är akuta, experiment icke-överlevnad. Som sådan, finns det ingen användning av ögonsalva och en steril operations svit krävs inte. Eutanasi uppnås genom blodtappning under skörd av hjärtat.

1. Försöks Framställning

1. Inrätta antingen ett konstant tryck eller konstant flöde Langendorff perfusionsapparat ^4.
2. Förbered 4 L av modifierad Krebs Henseleit-buffert (i mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO _4, 1 K ₂ HPO _4, 1,25 _CaCl2, 25 NaHCOj _3, 11 D-glukos, 0,2 oktansyra, pH = 7,4).
   1. Gör 10x stock buffertar.
      1. Lös NaCl, KCl, MgSO _4, och K ₂ HPO ₄ i 3 L ultrarent vatten.
      2. Lös _CaCl2 i 500 ml ultrarent vatten with 40 ml 1 N HCl.
      3. Tillsätt långsamt _{CaCl2-lösning} till bufferten som gjorts i 1.2.1.1. Tillsätt tillräckligt ultrarent vatten till totalt 4 L. Låt omröras under 1 h före filtrering genom ett 0,8 pm filter. Förvaras vid 4 ° C.
      4. Lös NaHCOs ₃ i 4 L ultrarent vatten. Rör om under 1 h före filtrering genom vid 0,8 ^ m filter. Förvaras vid 4 ° C
   2. Kombinera 400 ml 10x Krebs Henseleit buffert med 400 ml 10x NaHCO ₃ buffert. Tillsätt tillräckligt ultrarent vatten till totalt 4 L. Lös glukos och oktansyra under omrörning. Filtrera genom 0,8 pm filter.
3. Förbered systemet för hjärtat.
   1. Tillsätt 2 liter filtrerat buffert till en 4 L flaska placerades 38 i ovan kranen ansluten till aortakanylen. Detta kommer att ge ett perfusionstryck av 70-80 mmHg till hjärtat, vilket är den rekommenderade perfusionstryck ^4.
   2. Infoga gasdispersion bubblare i bufferten i flaskan.
   3. Kör bufferten genom systemet, var noga med att ta bort eventuella bubblor inifrån slangen.
   4. Slå på gas (95% _O2 / 5% CO ₂₎ minst 30 minuter före hjärta skall placeras på systemet. Använd ett gasflöde sond och blodgas analysator för att kontrollera syremättnad.
4. Förbered kirurgisk utrustning och ballong.
   1. För skörd av hjärta, förbereda ett par 6.75 "kirurgiska saxar, ett par på 4,5" sax, två par peanger, två uppsättningar av caramalt pincett, två sprutor med 27 G nålar, 2 st 0-gauge silkessutur (ca 15 cm i längd), en 1/16 tum hullingförsedda kanyl, och en trakeal kanyl.
   2. För att montera trakealkanylen, limma en kort bit av 1/16 tums diameter plaströr till en Y-koppling.
   3. För att montera ballongapparat: bifoga en sondmatning nål till en bit 1/16 tums slang och fäst sedan slangen till tryckgivare bostäder. En liten spruta fäst vid den andra sidan av tryck transducer bostäder kommer att tillåta uppblåsning och tömning av ballongen.
      1. Skär en kvadrat med plastfolie och placera spetsen av en sondmatning nål i centrum. Linda plastfolie runt sondmatning nålen.
      2. Fyll ballongen med saltlösning och fästa med två suturer. Pumpa ballong att säkerställa att det inte finns några läckor. Volymen av saltlösning inuti den uppblåsta ballongen bör ligga ca 200 pl, men kan variera beroende på storleken hos råttan.
      3. Alternativt kan du använda en latex finger barnsäng i stället för plastfolie. Placera sondmatning nålen i fingertuta, fyll med saltlösning och fästa.

2. Harvest hjärtat

1. Hindra en Sprague Dawley-råtta med hjälp av en decapicone eller annan manuell kvarhållande anordning. Väg råtta.
2. Administrera ketamin / xylazin-blandning (0,85 mg / kg ketamin och 0,15 mg / kg xylazin) via intraperitoneal injektion att söva råtta. Denna dos av bedövningsmedel skall ge tillräckliga anestesi för20-40 min, men förfarandet bör slutföras så snabbt som möjligt efter bedövningen bekräftas.
3. Bekräfta korrekt grad av anestesi genom att testa tå nypa reflex.
4. Trakeotomi
   1. Ta bort skinnet från mitten av framtassarna till basen av käken, med hjälp av peanger att höja päls och sax för att göra snitt. Håll skinnet förhöjda för att separera den från den underliggande muskeln, vilket tillåter en att skära längs skinnet och ta bort den.
   2. Med hjälp av peanger, lyft körtelvävnad och gör ett horisontellt snitt i fascia underlägsen den körtelvävnad. Använd peanger att sprida snitt öppet, noga med att inte nick de jugularvenerna.
   3. Använda peanger, nypa muskler överliggande luftstrupen, och med hjälp av sax göra en tvärgående snitt i muskeln strax under toppen av peanger. Med hjälp av peanger, sprida vävnad isär för att avslöja luftstrupen.
   4. Försiktigt in peanger enligt luftstrupen, clearing fascia samtidigt utvecklas genom att försiktigt framåt och dra tillbaka peanger.
   5. När peanger framgångsrikt placeras bakom luftstrupen, nypa 0-0 siden sutur med peanger och hemisect luftstrupen med en liten, vass sax.
   6. Infoga trakeal kanyl i hemisected trakea, dra suturen bakom luftstrupen, och knyta sutur runt den kanyle trakea, förankra suturen till Y-ljumske av kanylen med en kirurger knut.
   7. Med hjälp av en 27 G nål, injicera 1,000 U / kg heparin i halsvenen och låt cirkulera i 30 sekunder.
5. Torakotomi
   1. Ta bort skinnet från mitten av buken till mitten av framtassarna regionen genom att nypa med peanger och styckning med sax.
   2. Gör en ¾ tum tvärgående snitt i den abdominala muskeln vägg, precis under diafragman.
   3. Gör ett vertikalt snitt upp bukväggen och bröstkorgen, skärning längs bröstbenet.
   4. Skär membranet tillbaka bilateralt, spred sig sedan bröstkorg för att avslöja hjärta, klämma bröstkorg med peanger för att säkerställa att det förblir spridning. Med hjälp av peanger, försiktigt bort bräss, utsätta aortaascendens.
   5. Reta peanger genom aorta slinga, framåt och dra tillbaka peanger och försiktigt sprida fascia att tillåta spets peanger igenom.
   6. Använd peanger att dra 0-0 siden sutur bakom aortaascendens, slips sutur i en lös halvråbandsknop.
   7. Vrid kranen för att starta flöde av perfusionsbuffert, hemisect aorta och omedelbart sätta in kanylen i aorta lumen. Snabbt cinch en halvråbandsknop och slutföra knut, skärpning ordentligt.
   8. Använd en sax för att dissekera hjärta bort från de stora fartyg, ta bort hjärtat från bröstet och fäster perfusion kolumnen.
   9. Skär bort överflödigt lungvävnad och tillåter hjärtat att jämvikta på kolonnen under ca 15 min innan insättning av ballongen. Använd en normal flödeshastighet av buffert genom hjärtat av 10-20 ml / min.

3. Langendorff perfusion och ischemireperfusionsskada

1. Placering av LV pressure ballong
   1. Töm ballongen medan rulla in en konisk form och vrid kranen för att säkerställa ballongen förblir tömd.
   2. Punkt vänstra förmaket med en liten sax för att exponera tillgång till mitralisklaffen.
   3. Sätt ballong genom vänster förmak och mitralisklaffen i vänster kammare.
   4. Börja tryck övervakning programvara (LabChart Pro).
   5. Pumpa ballongen genom att öppna kranen och försiktigt ökande mängd saltlösning i ballongen tills diastoliskt tryck läsning från Micromanometer överstiger noll.
   6. För att kontrollera längd-spänning svar blåsa ballongen långsamt till ett diastoliskt tryck på 75 mmHg, tömma långsamt, upprepa en gång.
   7. Ställ diastoliska trycket till 10 mm Hg genom att modulera mängden saltlösning i ballongen. Vrid kranen för att täta ballongen på denna nivå av inflation och underhålla slutet system tryck mellan LV ballongen och tryckgivare.
   8. Lägre hjärta i uppvärmd kammare och lock kammare med plast.
2. Adstrerar ischemireperfusionsskada
   1. Koppla ned i den upphettade kammaren och tillåta kammare att fylla med utströmmade buffert.
   2. När bufferten har nedsänkt hjärta, vrid kranen för att stoppa flödet av bufferten in i hjärtat, förmå global ischemi. Ischemi Tiden kan variera beroende på målen för försöket.
   3. Efter 30 minuter av ischemi, vrid kranen för att återställa flödet av buffert i hjärtat, initiera reperfusion.
   4. Tillåt reperfusion av hjärtat under 1 timme innan att avsluta experimentet. Använd variabla reperfusion gånger, beroende på målen för försöket.
3. Uppsägning av experiment och Skörd av Tissue
   1. Använda sidoport av kranen, administrera 10 ml fosfatbuffrad saltlösning vid 4 ° C in i hjärtat med en hastighet av 10 ml / min för att stoppa hjärtat.
   2. Ta bort hjärtat från perfusion kolumnen klippa bort resterande förmaksvävnad.
   3. Placera hjärta i en rostfri vävnadsskivmatris, täck med PaRåfilm, och rum vid -80 ° C under 8 minuter, eller tills hjärtat har en marshmallow liknande konsistens.
   4. Ta bort kvarter från frysen och sätter rakblad i skiv matris att skära hjärtat i 2 mm skivor. Vävnads block kan också köpas med andra än 2 mm slice storlekar.
   5. Ta bort skivor en i taget och släppa i flytande kväve blinka frysa för biokemiska studier. Behåll den tredje kammar skiva från spetsen för infarkt färgning.
   6. Avlägsna vävnad från flytande kväve och förvara vid -80 ° C fram till användning i biokemiska experiment.
4. Infarkt Färgning
   1. Inkubera den tredje kammarsegment i 10 ml av 1% vikt / volym trifenyltetrazoliumklorid (TTC) vid 37 ° C under 15 minuter.
      Obs: Inkubation i TTC kan utföras för 15 eller 30 minuter med någon förändring i effektivitet ^15.
   2. Överför vävnadsskiva från TTC till 10% buffrad formalin och låt inkubera vid rumstemperatur över natten. För bästa resultat, hörats bör tas ur formalin och avbildas inom 24 timmar ^4.
   3. Fotografera målat skiva och använda program som ImageJ att uppskatta infarktstorleken enligt tillverkarens protokoll. Ta fotografier så snart som möjligt efter fixering, eftersom färgen kommer att blekna med tiden.

Representative Results

Den vänstra ventrikulära ballonganordningen möjliggör realtidsövervakning av det tryck som utvecklas av den upphandlande vänstra ventrikeln (Figur 1). Såsom beskrivits tidigare ^7, kan denna tryck spår användas för att beräkna många av parametrarna av kammarfunktionen. Dessa beräkningar kan göras i utgångsfasen samt reperfusionsfasen genomsnitt över flera spår inom varje grupp, och jämförs för att avgöra om farmakologisk intervention ledde till hjärt prekonditionering, som vi har gjort tidigare ^9. En sådan parameter är det utvecklade trycket, beräknad som skillnaden mellan det systoliska trycket och det slutdiastoliska trycket. Den utvecklade trycket i normala perfuserade råtthjärtan kan variera från 70 till 130 mm Hg (Figur 1A). Efter en ischemisk skada, är det utvecklade trycket minskas och slutdiastoliska tryck höjer (Figur 1B). När råttorna äradministreras en känd förkonditionering förening, såsom en klass I och IIb HDAC-inhibitor SAHA (vorinostat) ¹⁸ före utskärning av hjärtat, är reduktionen i utvecklad tryck och förhöjning av slutdiastoliska tryck i samband med ischemireperfusionsskada försvagade (Figur 1C). Andra åtgärder av vänsterkammarfunktion, såsom graden av tryck generationen (dP / dt _max), graden av tryck avkoppling (-dP / dt _max), och priset tryckprodukten (RPP) kan erhållas direkt eller beräknas från programvara utgång (Figur 2). Den ischemiska fasen kan även följas i realtid, med den uppenbara upphörande av tryck generation inom några minuter från starten av ischemi. Ischemisk kontraktion kan även följas genom att mäta tiden till debut av kontraktion och tiden till maximal kontraktion.

Trifenyltetrazoliumklorid (TTC) används ofta för att skilja mellan metaboliskt enctive och inaktiv vävnad och används här för infarkt färgning. När absorberas i vävnaden TTC reduceras med metabola enzymer, vrida aktiv vävnad rött. Inaktiva vävnad minskar inte TTC, och som sådan kommer att färga vitt ^8. Langendorff perfusion råtthjärtan som inte har utsatts för ischemisk skada inte visar några vita områden (ej visade), medan hjärtan utsattes för ischemireperfusionsskada visar betydande områden färgas vit, indikerar infarktvävnad (Figur 3).

Figur 1: Representativa tryck spår från vänsterkammarballongtryck registreras av LV ballong på ventrikelsammandragning.. Hjärtan som inte utsatts för ischemi (A) upplever en mindre förlust av kontraktila förmåga över tiden. Hearts utsatts för ischemi (B) visar OmgIate tryckfall generation, följt av tonic kontraktion. Vid reperfusion dessa hjärtan upplever förhöjd EDP och minskade utvecklat tryck. Hearts förkonditioneras med SAHA och utsatts för ischemi (C) visar dämpning av ischemireperfusionsskada. N = 1 per grupp.

Figur 2: Beräknade parametrar för kammarfunktion Rate tryck generationen (A), graden av tryck avkoppling (B), utvecklade tryck (C), och hastighetstryckprodukt (D) är en del parametrar för kammarfunktion som kan beräknas från. övervakningsmjukvara tryck.

Figur 3: TTC färgning för infarktområdet.

Discussion

Den isolerade perfunderade råtthjärta kan med framgång användas för att studera effekten av farmakologisk intervention på hjärt förkonditionering i ischemireperfusionsskada ^9. Det finns dock några viktiga steg till förfarandet som måste standardiseras för att säkerställa reproducerbara resultat. Upprätthållande av en temperatur av 37,4 ° C i systemet är kritisk, eftersom även mild hypotermi och hypertermi kan orsaka hjärt förkonditionering ^10,11. Den totala tid som förflyter från injektion av bedövningsmedel till excision av hjärtat måste hållas till ett minimum, som långvarig exponering för ketamin kan störa hjärt prekonditionering ^12. Rätt tid kanylering av aorta in situ är väsentlig för att förhindra utvecklingen av hypoxi inom hjärtat eller blodtömning av djuret före hjärt excision. Sammantaget bör tiden från första snittet avlägsnande av hjärtat inte vara längre än 6-8 minuter. De vänsterkammar balloon måste kontrolleras för läckor före varje experiment, och bytas ut vid behov. Systemet måste minutiöst bibehållas, spolning av hela anordningen med destillerat vatten efter varje körning och ersätta utslitna slangar som krävs för att förhindra läckage eller kontaminering av det inre av slangen.

Det isolerade hjärtat kan modifieras för ett obegränsat antal nya användningsområden, inklusive fluorescens avbildning ^13, NMR-spektroskopi ^7, och optisk kartläggning ¹⁴ bland många andra. Systemet kan också modifieras för att perfundera hjärtan från olika djur, inklusive möss. Denna modifiering är särskilt användbar eftersom den tillåter för experiment med användning av transgena möss. För att ändra systemet för mus hjärtan, mindre kanyler och en mindre perfusion kolumnen ska användas, utöver andra ändringar. Detaljerade beskrivningar av hur man kan använda Langendorff metod för mus hjärtan har publicerats någon annanstans ^16,17. Andra modifieringar avdetta protokoll innefattar administrering av olika läkemedel vid olika tidpunkter. Vid undersökningen av förmågan hos ett läkemedel för att orsaka farmakologisk förkonditionering eller post-konditionering, är det nödvändigt att administrera läkemedlet vid olika tidpunkter i förhållande till ischemi reperfusionsskada. Läkemedlet kan administreras till djuret innan hjärtat skärs ut, eller blandas in i bufferten antingen före hjärtat placeras på kolonnen eller under den ischemiska fasen så att läkemedlet är närvarande vid reperfusion. Alternativt kan en sidoport användas för att administrera en bolus av läkemedlet när som helst punkt under protokollet. Dessutom kan protokollet modifieras för att ändra längden på ischemi, reperfusion, eller båda. Detta tillåter analys av funktionella och biokemiska data vid multipla tidpunkter och kan användas för att spåra tidsförloppet för den akuta effekten av ett läkemedel. Om reperfusionsperioden ändras, är det viktigt att notera att minst 60 minuter av reperfusion är necessary för TTC färgning för att effektivt avgränsa infarktområdet ^15.

Den största begränsningen av den isolerade hjärtmodellen i termer av ischemi reperfusionsskada är att den inte tar hänsyn till många av de systemiska faktorer som är närvarande i inställningen av ischemireperfusion in vivo. Denna eliminering av systemisk påverkan måste beaktas i analysen av data som genereras med hjälp av Langendorff modellen, men utesluter inte möjligheten av modellen för att svara på nya frågor om svaret från myocyter, fibroblaster och endotelceller till ischemi och efterföljande reperfusion. Den isolerade hjärtmodellen möjliggör fullständig manipulering av många av de variabler som påverkar ischemi reperfusionsskada förutom realtidsanalys av de funktionella effekter på hjärtat över korta tidsintervall. De data som genereras med hjälp av isolerade hjärtat systemet är ovärderlig för att förstå farmakologisk prekonditionering eller efter konditionering avhjärta som svar på olika farmaceutiska interventioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8