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Langendorff-perfused चूहा दिल में प्रेरण और ischemia-reperfusion की चोट का आकलन

Published: July 27, 2015 doi: 10.3791/52908
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Medicine/Cardiology, Gazes Cardiac Research Institute, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson VA Medical Center, Medical University of South Carolina

Introduction

दोनों ischemia और हृदय प्रतिक्रिया अंतर्निहित घटनाओं की व्याख्या महाधमनी पार clamping 2 की आवश्यकता है कि रोधगलन 1 और हृदय शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के उपचार में सुधार करने में आवश्यक हैं। Ischemia के reperfusion की चोट के vivo मॉडल बहुत उपयोगी समापन बिंदु विश्लेषण की अनुमति है, वे वास्तविक समय में तीव्रता से ischemia के reperfusion की चोट के कार्यात्मक प्रभाव के अध्ययन के लिए के रूप में प्रभावी नहीं हैं। विवो ischemia के reperfusion के मॉडल आम तौर पर reperfusion के समय में रोधगलितांश आकार में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता, और दिल के लिए दवा के प्रत्यक्ष प्रसव उत्पादन में साथ ही, चुनौती दे रहा है। ischemia के reperfusion की चोट के अध्ययन के लिए एक Langendorff पृथक दिल प्रणाली के उपयोग के औषधीय उपचार, infarcted ऊतक की वर्दी क्षेत्र है, और सीधे मायोकार्डियम के लिए दवा की तात्कालिक प्रसव के वास्तविक समय कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

पहले बी वर्णित1895 3 में y ऑस्कर Langendorff, Langendorff पृथक दिल पिछले 40 वर्षों 4,5 के लिए ischemia के reperfusion के अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है, ischemia के reperfusion की चोट के अध्ययन के लिए एक मजबूत मॉडल है। इधर, कुछ संशोधनों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पृथक दिल अनुकूलन करने के लिए बना रहे हैं। महाधमनी के सीटू केन्युलेशन में दिल की धड़कन दिल ischemia के reperfusion के परीक्षणों 6 के परिणाम बदल जाएगा जो इस्कीमिक शर्त का अनुभव नहीं है सुनिश्चित करता है। इस सुविधा के लिए, एक ट्रेकिआटमी वेंटिलेशन की अनुमति और सर्जरी के दौरान चूहे की शारीरिक स्थिरता सुनिश्चित किया जाता है। दिल तो क्रेब्स Henseleit बफर महाधमनी में सीधे प्रतिगामी छिड़काव के माध्यम से वितरित किया जाता है, जिसके माध्यम से एक गिलास पानी तख्ताबंदीवाला सर्पिल स्तंभ से जुड़ा हुआ है। एक नमकीन से भरे गुब्बारे बाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है और निलय एक के भीतर से दबाव के वास्तविक समय माप के लिए अनुमति देता है एक दबाव transducer, से जुड़ा हुआ हैकई कार्यात्मक मापदंडों के डी गणना। प्रयोग के समापन पर, दिल संकुचन और डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर के बहाव के विश्लेषण सक्षम करने के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ़्लैश गिरफ्तार करने के लिए ठंड नमक के साथ प्लावित है। इस प्रकार संशोधित, Langendorff perfused दिल ischemia के reperfusion की चोट के दौरान तीव्रता से किसी भी समय औषधीय हस्तक्षेप के शारीरिक प्रभाव की प्रत्यक्ष निगरानी के लिए एक प्रभावी प्रणाली के रूप में कार्य करता है।

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Protocol

यहां सूचीबद्ध सभी प्रक्रियाओं दक्षिण कैरोलिना के चिकित्सा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। यहाँ वर्णित प्रयोगों तीव्र, गैर अस्तित्व के प्रयोग कर रहे हैं। जैसे, वहाँ आँख मरहम का कोई उपयोग नहीं है और एक बाँझ ऑपरेटिंग सुइट की आवश्यकता नहीं है। इच्छामृत्यु दिल की कटाई के दौरान exsanguination द्वारा हासिल की है।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. एक निरंतर दबाव या निरंतर प्रवाह Langendorff छिड़काव उपकरण 4 या तो निर्धारित करें।
  2. संशोधित क्रेब्स Henseleit बफर के 4 एल तैयार (मिमी में: 112 NaCl, 5 KCl, 1.2 MgSO 4, 1 कश्मीर 2 HPO 4, 1.25 2 CaCl, 25 NaHCO 3, 11 डी ग्लूकोज, 0.2 octanoic एसिड, पीएच = 7.4)।
    1. 10x शेयर बफ़र्स बनाओ।
      1. 3 एल ultrapure पानी में सोडियम क्लोराइड, KCl, MgSO 4, और कश्मीर 2 HPO 4 भंग।
      2. 500 मिलीलीटर ultrapure पानी वाई में 2 CaCl भंग1 एन एचसीएल के 40 एमएल वें।
      3. धीरे धीरे 1.2.1.1 में किए गए बफर करने के लिए 2 CaCl समाधान जोड़ें। 4 एल कुल करने के लिए पर्याप्त ultrapure पानी जोड़ें 0.8 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर से पहले 1 घंटे के लिए हलचल करने की अनुमति दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      4. 4 एल ultrapure पानी में 3 NaHCO भंग। 0.8 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से छानने से पहले 1 घंटे के लिए हलचल करने की अनुमति दें। स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर
    2. 400 मिलीलीटर 10x 3 NaHCO बफर के साथ 400 मिलीलीटर 10x क्रेब्स Henseleit बफर का मिश्रण। क्रियाशीलता जबकि ग्लूकोज और octanoic एसिड भंग 4 एल कुल करने के लिए पर्याप्त ultrapure पानी जोड़ें। 0.8 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
  3. दिल के लिए तैयार करें।
    1. एक 4 एल बोतल के लिए फ़िल्टर बफर के 2 एल जोड़ें महाधमनी प्रवेशनी से जुड़ी पानी निकलने की टोंटी से ऊपर में 38 रखा। यह अनुशंसित छिड़काव दबाव 4 है जो दिल को 70-80 एमएमएचजी के छिड़काव दबाव वितरित करेंगे।
    2. बोतल में बफर में गैस फैलाव bubbler डालें।
    3. ट्यूबिंग अंदर से किसी भी बुलबुले को खत्म करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है, इस प्रणाली के माध्यम से बफर चलाएँ।
    4. दिल प्रणाली पर रखा जा रहा है इससे पहले गैस (95% 2 हे / 5% सीओ 2) कम से कम 30 मिनट पर मुड़ें। ऑक्सीजन संतृप्ति सत्यापित करने के लिए एक गैस प्रवाह जांच और रक्त गैस विश्लेषक का उपयोग करें।
  4. शल्य चिकित्सा की आपूर्ति और गुब्बारे तैयार करें।
    1. दिल की कटाई के लिए, 6.75 की एक जोड़ी "शल्य कैंची, 4.5 की एक जोड़ी" कैंची, 27 जी सुइयों, 0-गेज रेशम सीवन के 2 टुकड़े (लगभग 15 से hemostats के दो जोड़े, caramalt संदंश के दो सेट, दो सीरिंज तैयार लंबाई में सेमी), एक 1/16 इंच कांटेदार प्रवेशनी, और एक सांस की नली प्रवेशनी।
    2. सांस की नली प्रवेशनी को इकट्ठा करने के लिए, एक वाई-कनेक्टर के लिए 1/16 इंच व्यास प्लास्टिक टयूबिंग के एक छोटे टुकड़े गोंद।
    3. गुब्बारा तंत्र को इकट्ठा करने के लिए: 1/16 इंच ट्यूबिंग के एक टुकड़े के लिए एक gavage सुई देते हैं, तो दबाव transducer आवास के लिए ट्यूबिंग देते हैं। दबाव टीआर के दूसरे पक्ष से जुड़ी एक छोटी सी सिरिंजansducer आवास गुब्बारे की मुद्रास्फीति और संकुचन की अनुमति देगा।
      1. केंद्र में एक gavage सुई की प्लास्टिक की चादर और जगह टिप के एक वर्ग की कट। Gavage सुई के आसपास प्लास्टिक की चादर में लपेटकर।
      2. नमक के साथ गुब्बारे भरें और दो टांके के साथ बंद टाई। कोई लीक कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए गुब्बारा फुलाना। फुलाया गुब्बारे के भीतर खारा की मात्रा लगभग 200 μl होना चाहिए, लेकिन चूहे के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
      3. वैकल्पिक रूप से, प्लास्टिक की चादर के स्थान पर एक लेटेक्स उंगली खाट का उपयोग करें। , उंगली खाट भीतर gavage सुई प्लेस खारा के साथ भरने के लिए और बंद टाई।

2. हार्वेस्ट दिल

  1. एक decapicone या अन्य पुस्तिका संयम उपकरण का उपयोग कर एक Sprague Dawley चूहे को नियंत्रित करना। चूहे वजन।
  2. चूहे anesthetize को intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से ketamine / xylazine मिश्रण (0.85 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 0.15 मिलीग्राम / किग्रा xylazine) प्रशासन। संवेदनाहारी की यह खुराक के लिए पर्याप्त संज्ञाहरण प्रदान करेगा20-40 मिनट है, लेकिन प्रक्रिया के रूप में जल्दी से संज्ञाहरण की पुष्टि की है संभव के रूप में के बाद पूरा किया जाना चाहिए।
  3. परीक्षण के पैर के अंगूठे चुटकी पलटा द्वारा संज्ञाहरण के उचित डिग्री की पुष्टि करें।
  4. ट्रेकिआटमी
    1. चीरा बनाने के लिए खाल और कैंची तरक्की के लिए hemostats का उपयोग कर, जबड़े के आधार पर मध्य forepaw से खाल निकालें। खाल के साथ काटा और इसे दूर करने के लिए एक, की अनुमति अंतर्निहित मांसपेशियों से अलग करने के लिए ऊपर उठाया खाल रखें।
    2. Hemostats का उपयोग करना, ग्रंथियों के ऊतकों उठा और ग्रंथियों के ऊतकों को प्रावरणी में एक क्षैतिज चीरा अवर बनाते हैं। निक के लिए नहीं कंठ नसों ख्याल रख रही है, खुला चीरा प्रसार करने के लिए hemostats का प्रयोग करें।
    3. , Hemostats का उपयोग करते हुए चुटकी मांसपेशी ट्रेकिआ overlying, और का उपयोग कैंची सिर्फ hemostats की नोक के नीचे मांसपेशियों में एक अनुप्रस्थ चीरा बनाते हैं। Hemostats का उपयोग करना, श्वासनली प्रकट करने के लिए अलग ऊतक फैल गया।
    4. ध्यान से धीरे आगे बढ़ रहा है और hemostats के retracting से प्रगति जबकि प्रावरणी समाशोधन, श्वासनली के तहत hemostats डालें।
    5. Hemostats के सफलतापूर्वक श्वासनली के पीछे रखा जाता है एक बार, hemostats के साथ 0-0 रेशम सीवन चुटकी और कैंची का एक छोटा सा, तेज जोड़ी के साथ श्वासनली Hemisect।
    6. , Hemisected श्वासनली में सांस की नली प्रवेशनी डालें श्वासनली के पीछे सीवन खींच, और एक सर्जन गाँठ के साथ प्रवेशनी के वाई-कमर को सिवनी प्रस्तोता, cannulated श्वासनली के आसपास सीवन टाई।
    7. एक 27 जी सुई का प्रयोग, गले नस में 1,000 यू / किलो हेपरिन इंजेक्षन और 30 सेकंड के लिए प्रसारित करने की अनुमति देते हैं।
  5. Thoracotomy
    1. Hemostats के साथ बन्द रखो और कैंची से काटने से मध्य forepaw क्षेत्र के मध्य पेट से खाल निकालें।
    2. बस डायाफ्राम नीचे, पेट की मांसपेशियों दीवार में एक ¾ इंच अनुप्रस्थ चीरा बनाओ।
    3. उरोस्थि के साथ काटने, पेट की दीवार और छाती की दीवार के ऊपर एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ।
    4. वापस द्विपक्षीय डायाफ्राम कट, तो दिल, यह फैल रहता है सुनिश्चित करने के लिए hemostats के साथ दबाना ribcage प्रकट करने के लिए ribcage फैल गया। Hemostats का प्रयोग, धीरे आरोही महाधमनी उजागर थाइमस हटा दें।
    5. Hemostats की नोक के माध्यम से अनुमति देने के लिए प्रावरणी प्रसार धीरे आगे बढ़ रहा है और hemostats के retracting और, महाधमनी पाश के माध्यम से hemostats के छेड़ो।
    6. आरोही महाधमनी के पीछे 0-0 रेशम सीवन खींच एक ढीला आधा वर्ग गाँठ में सीवन टाई करने के लिए hemostats का प्रयोग करें।
    7. छिड़काव बफर, Hemisect महाधमनी का प्रवाह शुरू किया और तुरंत महाधमनी लुमेन में प्रवेशनी डालने के लिए पानी निकलने की टोंटी मुड़ें। तेजी से एक आधा वर्ग गाँठ प्रभाव और अच्छी तरह से कस, गाँठ को पूरा करें।
    8. दूर महान जहाजों से दिल टुकड़े करना सीने से दिल को हटाने और छिड़काव स्तंभ के लिए संलग्न करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
    9. अतिरिक्त फेफड़े के ऊतकों दूर ट्रिम और दिल के गुब्बारे की प्रविष्टि के बारे में पहले 15 मिनट के लिए स्तंभ पर संतुलित करने की अनुमति देते हैं। 10-20 मिलीग्राम / मिनट के दिल के माध्यम बफर के एक सामान्य प्रवाह की दर का प्रयोग करें।

3. Langendorff छिड़काव और ischemia reperfusion की चोट

  1. एल.वी. पूर्व की नियुक्तिssure गुब्बारा
    1. एक शंकु आकार में रोलिंग जबकि गुब्बारा खंडन करना और गुब्बारे पिचकाकर रहता है सुनिश्चित करने के लिए पानी निकलने की टोंटी बारी है।
    2. आबकारी माइट्रल वाल्व के लिए उपयोग बेनकाब करने के लिए कैंची के एक छोटे से जोड़ी के साथ अलिंद छोड़ दिया है।
    3. बाएं आलिंद और बाएं वेंट्रिकल में माइट्रल वाल्व के माध्यम से गुब्बारा डालें।
    4. दबाव की निगरानी सॉफ्टवेयर प्रारंभ (LabChart प्रो)।
    5. पानी निकलने की टोंटी खोलने और धीरे micromanometer से पढ़ डायस्टोलिक दबाव शून्य से अधिक है जब तक गुब्बारे में नमक की मात्रा में वृद्धि से गुब्बारा फुलाना।
    6. धीरे-धीरे खंडन करना, लंबाई-तनाव की प्रतिक्रिया की जांच 75 एमएमएचजी के डायस्टोलिक दबाव को धीरे-धीरे गुब्बारा फुलाना, एक बार दोहराएँ।
    7. गुब्बारे में खारा की राशि modulating द्वारा 10 एमएमएचजी को डायस्टोलिक दबाव सेट करें। मुद्रास्फीति के इस स्तर पर गुब्बारा सील करने के लिए पानी निकलने की टोंटी बारी, और एल.वी. गुब्बारे और दबाव transducer के बीच बंद दबाव प्रणाली को बनाए रखने।
    8. प्लास्टिक के साथ गर्म कक्ष और कवर के चेंबर में लोअर दिल।
  2. विज्ञापनIschemia reperfusion की चोट के कार्य संपादन
    1. गरम कक्ष के नीचे प्लग और चैम्बर effused बफर के साथ भरने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. बफर दिल जलमग्न हो गया है, वैश्विक ischemia के उत्प्रेरण, दिल में बफर के प्रवाह को रोकने के लिए पानी निकलने की टोंटी बारी है। Ischemia समय प्रयोग के लक्ष्यों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    3. Ischemia के 30 मिनट के बाद, reperfusion की शुरुआत दिल में बफर के प्रवाह को बहाल करने के लिए पानी निकलने की टोंटी बारी है।
    4. प्रयोग बर्खास्त करने से पहले 1 घंटे के लिए दिल की reperfusion की अनुमति दें। प्रयोग के लक्ष्यों पर निर्भर करता है, चर reperfusion के समय का उपयोग करें।
  3. प्रयोग की समाप्ति और ऊतकों की कटाई
    1. पानी निकलने की टोंटी की ओर बंदरगाह का उपयोग करना, 10 एमएल की दर से दिल में 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा के 10 एमएल के लिए प्रशासन / मिनट दिल की गिरफ्तारी के लिए।
    2. , छिड़काव स्तंभ से दिल को दूर आलिंद ऊतक शेष दूर ट्रिम।
    3. फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ कवर किया, एक स्टेनलेस स्टील के ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया मैट्रिक्स में दिल रखें8 मिनट के लिए, या दिल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर rafilm, और जगह एक marshmallow-निरंतरता की तरह है।
    4. फ्रीजर से ब्लॉक निकालें और 2 मिमी स्लाइस में दिल टुकड़ा करने के लिए मैट्रिक्स टुकड़ा करने की क्रिया में razorblades डालें। ऊतक ब्लॉक भी 2 मिमी के अलावा अन्य टुकड़ा आकार के साथ खरीदा जा सकता है।
    5. एक समय में स्लाइस एक निकालें और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए फ्रीज फ्लैश करने के लिए तरल नाइट्रोजन में ड्रॉप। रोधगलितांश धुंधला के लिए सर्वोच्च से तीसरे निलय टुकड़ा रखें।
    6. जैव रासायनिक प्रयोगों में उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान से ऊतक निकालें।
  4. रोधगलितांश धुंधला
    1. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर / वी triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) डब्ल्यू 1% की 10 एमएल में तीसरे निलय टुकड़ा सेते हैं।
      नोट: टीटीसी में ऊष्मायन प्रभावशीलता 15 में कोई बदलाव के साथ 15 या 30 मिनट के लिए किया जा सकता है।
    2. 10% बफर formalin को टीटीसी से ऊतक टुकड़ा हस्तांतरण और रात में कमरे के तापमान पर सेते दें। इष्टतम परिणामों के लिए, सुनटीएस formalin के बाहर ले लिया और 24 घंटे के भीतर 4 imaged किया जाना चाहिए।
    3. ऐसे ImageJ के रूप में तस्वीर दाग टुकड़ा और उपयोग सॉफ्टवेयर निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार रोधगलितांश आकार का अनुमान लगाने के लिए। डाई समय के साथ खत्म हो जाएगा, के रूप में निर्धारण के बाद जितनी जल्दी हो सके तस्वीरें ले लो।

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Representative Results

बाएं निलय गुब्बारा तंत्र करार बाएं वेंट्रिकल (चित्रा 1) द्वारा विकसित दबाव के वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुमति देता है। पहले से 7 वर्णित है, इस दबाव का पता लगाने निलय समारोह के मापदंडों के कई गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन गणनाओं, आधारभूत चरण के रूप में अच्छी तरह से reperfusion के चरण में किए गए प्रत्येक समूह के भीतर कई निशान पर औसतन, और हम पहले से 9 किया है के रूप में औषधीय हस्तक्षेप, जो दिल की शर्त के परिणामस्वरूप यह निर्धारित करने के क्रम में तुलना की जा सकती। ऐसा ही एक पैरामीटर सिस्टोलिक प्रेशर और अंत डायस्टोलिक दबाव के बीच अंतर के रूप में गणना की विकसित दबाव है। सामान्य perfused चूहे दिलों में विकसित दबाव में 70 से 130 एमएमएचजी (चित्रा 1 ए) से लेकर कर सकते हैं। एक इस्कीमिक अपमान के बाद विकसित की है, दबाव कम हो जाता है और अंत डायस्टोलिक दबाव उठ (चित्रा 1 बी)। जब चूहों हैंऐसे वर्ग मैं और 18 दिल excising से पहले, विकसित दबाव में कमी और ischemia reperfusion की चोट के साथ जुड़े अंत डायस्टोलिक दबाव की ऊंचाई तनु रहे हैं IIb HDAC अवरोध करनेवाला साहा (vorinostat) (चित्रा 1C) के रूप में एक ज्ञात शर्त एजेंट दिलाई। इस तरह के दबाव पीढ़ी (डी पी / डीटी अधिकतम) की दर के रूप में बाएं निलय समारोह के अन्य उपायों, दबाव विश्राम (-dP / डीटी अधिकतम) की दर, और दर दबाव उत्पाद (आरपीपी) सीधे प्राप्त या से गणना की जा सकती सॉफ्टवेयर निर्गम (चित्रा 2)। इस्कीमिक चरण भी ischemia के शुरू होने के मिनट के भीतर दबाव पीढ़ी के स्पष्ट समाप्ति के साथ वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकती है। इस्केमिक संकुचन भी संकुचन और संकुचन पीक करने के लिए समय की शुरुआत करने के लिए समय को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है।

Triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) आमतौर पर पाचन एक के बीच अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता हैctive और निष्क्रिय ऊतक, और रोधगलितांश धुंधला के लिए यहां इस्तेमाल किया जाता है। एक बार सक्रिय ऊतक लाल मोड़, टीटीसी चयापचय एंजाइमों से कम है ऊतक में लीन। निष्क्रिय ऊतक टीटीसी को कम नहीं करता है, और इस तरह के रूप में 8 सफेद दाग होगा। दिल infarcted ऊतक का संकेत सफेद दाग ischemia के reperfusion की चोट शो पर्याप्त क्षेत्रों (चित्रा 3) के अधीन है, जबकि Langendorff, किसी भी सफेद क्षेत्रों (नहीं दिखाया गया है) नहीं दिखाते इस्कीमिक चोट के अधीन नहीं किया गया है कि चूहे दिल perfused।

चित्र 1
चित्रा 1:। निलय संकुचन पर एल.वी. गुब्बारा द्वारा दर्ज बाएं निलय गुब्बारा दबाव से प्रतिनिधि दबाव निशान। Ischemia के (ए) के अधीन नहीं दिल समय के साथ सिकुड़ा क्षमता का एक मामूली नुकसान का अनुभव। Ischemia के अधीन करने के लिए दिल (बी) immed दिखानेटॉनिक संकुचन द्वारा पीछा दबाव पीढ़ी की देर हो गई हानि,। Reperfusion पर, इन दिलों को ऊंचा ईडीपी अनुभव और दबाव विकसित की कमी हुई। दिल साहा के साथ preconditioned और ischemia (सी) के अधीन ischemia के reperfusion की चोट के क्षीणन दिखा। एन = समूह प्रति 1।

चित्र 2
चित्रा 2: निलय समारोह की गणना मापदंडों दर दबाव पीढ़ी (ए), दबाव विश्राम (बी), विकसित दबाव (सी), और दर दबाव उत्पाद (डी) की दर से गणना की जा सकती है कि निलय समारोह के कुछ मानकों हैं। दबाव की निगरानी सॉफ्टवेयर।

चित्र तीन
चित्रा 3: रोधगलितांश क्षेत्र के लिए टीटीसी धुंधला हो जाना।

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Discussion

पृथक perfused चूहे दिल सफलतापूर्वक ischemia के reperfusion की चोट 9 में हृदय की शर्त पर औषधीय हस्तक्षेप के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के क्रम में मानकीकृत किया जाना चाहिए कि प्रक्रिया के लिए कुछ आवश्यक कदम उठाए हैं। प्रणाली के भीतर 37.4 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने के भी हल्के हाइपोथर्मिया और हाइपरथर्मिया हृदय की शर्त 10,11 पैदा कर सकता है, के रूप में महत्वपूर्ण है। ketamine करने के लिए लंबे समय तक निवेश हृदय की शर्त 12 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में दिल का छांटना को संवेदनाहारी के इंजेक्शन से बीतता है कि समग्र समय, एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए। बगल में महाधमनी का समय पर केन्युलेशन दिल छांटना करने से पहले दिल या जानवर के exsanguination भीतर हाइपोक्सिया के विकास को रोकने के लिए आवश्यक है। कुल मिलाकर, दिल को हटाने के लिए सबसे पहले चीरा से समय नहीं रह 6-8 मिनट से अधिक होना चाहिए। बाएं निलय बाlloon प्रत्येक प्रयोग से पहले लीक के लिए जाँच की, और यदि आवश्यक हो तो बदला जाना चाहिए। सिस्टम कुशलता से प्रत्येक चलाने के बाद आसुत जल के साथ पूरे तंत्र निस्तब्धता और ट्यूबिंग के इंटीरियर के रिसाव या प्रदूषण को रोकने के लिए आवश्यक के रूप में पहना हुआ ट्यूबिंग की जगह सहित बनाए रखा जाना चाहिए।

पृथक दिल में कई अन्य लोगों के अलावा प्रतिदीप्ति इमेजिंग 13, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी 7, और ऑप्टिकल मानचित्रण 14 सहित उपन्यास का उपयोग करता है, के किसी भी संख्या के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रणाली को भी चूहों सहित विभिन्न जानवरों से दिल छिड़कना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्रयोगों के लिए अनुमति देता है के रूप में इस संशोधन विशेष रूप से उपयोगी है। अन्य संशोधनों के अलावा, इस्तेमाल किया जाना चाहिए माउस दिल, छोटे cannulae और एक छोटे छिड़काव स्तंभ के लिए प्रणाली को संशोधित करने के लिए। माउस दिलों के लिए Langendorff विधि का उपयोग करने के लिए कैसे का विस्तृत विवरण कहीं और 16,17 प्रकाशित किया गया है। के अन्य संशोधनोंइस प्रोटोकॉल अलग समय बिंदुओं पर विभिन्न दवाओं के प्रशासन में शामिल हैं। औषधीय शर्त या पोस्ट-कंडीशनिंग पैदा करने के लिए एक दवा की क्षमता की जांच कर रही है, यह ischemia के reperfusion की चोट के संबंध में अलग-अलग समय बिंदुओं पर दवा प्रशासन के लिए आवश्यक है। दवा दिल excised है पहले जानवर को दिलाई, या दवा reperfusion पर मौजूद है, इसलिए है कि दिल स्तंभ पर या इस्कीमिक चरण के दौरान रखा जाता है या तो पहले बफर में मिलाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक पक्ष बंदरगाह प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी समय बिंदु पर दवा की एक सांस में प्रशासन के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल ischemia, reperfusion की, या दोनों की अवधि को बदलने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह कई बिंदुओं पर समय कार्यात्मक और जैव रासायनिक डेटा के विश्लेषण की अनुमति देता है और एक दवा की तीव्र प्रभाव के समय के पाठ्यक्रम पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Reperfusion की अवधि को बदल दिया गया है, तो यह reperfusion की कम से कम 60 मिनट nece हैं कि नोट के लिए महत्वपूर्ण हैटीटीसी धुंधला के लिए ssary प्रभावी ढंग से रोधगलितांश क्षेत्र में 15 चित्रित करने के लिए।

ischemia के reperfusion की चोट के मामले में अलग-थलग दिल मॉडल की मुख्य सीमा यह vivo में ischemia के reperfusion की सेटिंग में मौजूद हैं कि प्रणालीगत कारकों में से कई के लिए खाते में नहीं है। प्रणालीगत प्रभाव के इस उन्मूलन Langendorff मॉडल का उपयोग कर उत्पन्न डेटा के विश्लेषण में लिए जिम्मेदार होना चाहिए, लेकिन ischemia और बाद के reperfusion के लिए myocytes, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के बारे में उपन्यास सवालों के जवाब देने के लिए मॉडल की क्षमता नहीं रोकता है। पृथक दिल मॉडल कम समय के अंतराल पर दिल पर कार्यात्मक प्रभाव के वास्तविक समय विश्लेषण के अलावा ischemia के reperfusion की चोट को प्रभावित करने चर के कई की पूरी हेरफेर के लिए अनुमति देता है। पृथक दिल प्रणाली का उपयोग करके डेटा उत्पन्न औषधीय शर्त या के पद कंडीशनिंग समझने में अमूल्य हैविभिन्न दवा हस्तक्षेपों के जवाब में दिल।

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Acknowledgments

इस प्रकाशन दक्षिण कैरोलिना के चिकित्सा विश्वविद्यालय में एक अकादमिक घर, एनआईएच / NCATS अनुदान संख्या UL1 TR000062 के साथ, दक्षिण कैरोलिना नैदानिक ​​और translational अनुसंधान (SCTR) संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। आगे समर्थन DRM करने के लिए वीए योग्यता पुरस्कार BX002327-01 द्वारा प्रदान किया गया। DJH एनआईएच / NCATS अनुदान संख्या TL1 TR000061 द्वारा और एनआईएच अनुदान संख्या T32 GM008716 द्वारा समर्थित किया गया। समुद्र एनआईएच अनुदान संख्या T32 HL07260 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich 203726
Potassium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate Sigma Aldrich C8106
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
D-Glucose Sigma Aldrich G8270
Octanoic Acid Sigma Aldrich C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Sigma Aldrich T8877
Medical Pressure Transducer MEMSCAP SP844
Masterflex Peristaltic Pump Cole Parmer EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head Cole Parmer EW-07518-10
Heated circulating water bath Lauda M3
Tubing Flow Module Transonic TS410
Modular Research Console Transonic T402
Inline flow sensor Transonic ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device AD Instruments PL3508
LabChart data acquisition software AD Instruments MLU60/8

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References

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चिकित्सा अंक 101 ischemia reperfusion की पृथक दिल हृदय की शर्त रोधगलितांश धुंधला हिस्टोन deacetylase हृदय समारोह
Langendorff-perfused चूहा दिल में प्रेरण और ischemia-reperfusion की चोट का आकलन
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Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908, doi:10.3791/52908 (2015).

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