Abstract
في هذه الدراسة، يتم تصنيعه nanocellulose بكتيريا (BNC) التي تنتجها البكتيريا Gluconacetobacter xylinus والمشرب في الموقع مع جزيئات أكسيد الحديد (IONP) (الحديد 3 O 4) أن تسفر عن nanocellulose بكتيريا المغناطيسي (MBNC). تركيب MBNC هو عملية متعددة الخطوات الدقيقة والتي صممت خصيصا. لفترة وجيزة، nanocellulose بكتيريا تتشكل (BNC) pellicles من G. الحفاظ عليها xylinus سلالة وفقا لمتطلبات التجريبية لدينا من حجم والتشكل. يتم تحضير نسبة المولي 1 وتضعف في غير المؤكسج المياه عالية النقاء: حل من الحديد (III) هيدرات كلوريد (FeCl 3 · 6H 2 O) والحديد (II) tetrahydrate كلوريد (FeCl 2 · 4H 2 O) مع 2. ثم تم تقديم جليدة BNC في السفينة مع المواد المتفاعلة. يحرك هذا الخليط ويسخن على 80 درجة مئوية في حمام زيت السيليكون وهيدروكسيد الأمونيوم (14٪) ثم يضاف من خلال إسقاط لترسيبالحديدية أيونات في شبكة BNC. هذه الخطوة الأخيرة يسمح تشكل في النانوية الموقع المغنتيت (الحديد 3 O 4) داخل شبكة nanocellulose البكتيرية للتشاور الخواص المغناطيسية لجليدة BNC. تم استخدام فحص السمية لتقييم توافق مع الحياة من جليدة BNC-IONP. تم استخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) لتغطية IONPs من أجل تحسين توافق مع الحياة الخاصة بهم. المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) الصور أظهرت أن IONP كانت موجودة بشكل تفضيلي في يفية تضافر فضاءات مصفوفة BNC، ولكن تم العثور على بعض منها أيضا على أشرطة BNC. قياسات مجهر القوة المغناطيسية التي أجريت على MBNC الكشف عن المجالات المغناطيسية وجود مع ميداني على مستوى عال وضعف الكثافة المغناطيسية، مما يؤكد الطبيعة المغناطيسية للجليدة MBNC. قيم معامل يونغ التي تم الحصول عليها في هذا العمل هي أيضا في اتفاق معقول مع تلك التي ذكرت لعدة الأوعية الدموية في الدراسات السابقة.
Introduction
يتم تصنيعه في nanocellulose bacterian (BNC) من خلال الخلالة سلالة xylinum، المعروف أيضا باسم Gluconacetobacter xylinus، وأودعت في شكل أفلام أو pellicles على واجهة الهواء السائل خلال ثقافة ثابتة. هذه pellicles BNC تعتمد على شكل الحاوية حيث تزرع فيها، وسمكها يعتمد على عدد الأيام في الثقافة. أ. يستخدم xylinus الجلوكوز في المتوسط لتركيب وmicrofibrils السليلوز من خلال عملية البلمرة وتبلور لاحقا. ويتم بلمرة بقايا الجلوكوز في غشاء الخلية البكتيرية حيث تنبثق سلاسل جلوكان من المسام واحدة موزعة على المغلف الخلية. يحدث تبلور microfibrils السليلوز في الفضاء خارج الخلية مع تشكيل صفائح سلسلة جلوكان التي كتبها فان دير فال الروابط تليها التراص من الأوراق التي كتبها H-الترابط 1.
مغناطيسالنانوية جيم متكامل لمصفوفة BNC يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق حقل مغناطيسي خارجي من أجل زيادة القوة اللازمة لتوجيه وحصر خلايا العضلات الملساء (SMCS) التي تحتوي على الجسيمات النانوية المغناطيسية، في الموقع المتضرر من جدران الشرايين. وتبقي هذه الاستراتيجية SMCS بعيدا عن الأنسجة الأخرى، وتحمل الخلايا في مكان ضد القوة التي تدفق الدم المبذولة. وقد تبين أن SMCS تلعب دورا هاما في vasoelasticity من الأوعية الدموية، حيث أنها تشكل طبقات وفيرة تقع أساسا في وسائل الإعلام الغلالة 2.
الطريقة المستخدمة لتركيب MBNC ينطوي BNC جليدة مغمورة وأثارت في حل من الحديد (III) tetrahydrate كلوريد (II) هيدرات كلوريد الحديد وفي 80 درجة مئوية. يضاف هيدروكسيد الأمونيوم لتشكيل جزيئات أكسيد الحديد داخل شبكة BNC. إضافة هيدروكسيد الأمونيوم تغير لون المحلول من البرتقالي إلى اللون الأسود. الاتفاق IONPs معا على طول ليفية BNCالصورة مع التوزيع غير موحدة.
ويركز هذا البروتوكول على تصميم البكتيرية-nanocellulose المغناطيسي جليدة جسيمات متناهية الصغر، التي لدينا اسمه nanocellulose بكتيريا المغناطيسي (MBNC)، الذي يهدف إلى استخدام كبديل عن المفقودين، والأوعية الدموية الصغيرة القطر التالفة أو إصابة. HS بارود وزملاء العمل قد نشرت مؤخرا بعمل مماثل لإنتاج ورقة المغناطيسي مرنة تستند BNC-BNC عن طريق خلط pellicles في تشتت مائي مستقر من PEG ومغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic جزيئات أكسيد الحديد 3. هنا، نحن تصف إنتاج السليلوز البكتيريا والتشريب في الموقع مع النانوية المغناطيسية. تم استخدام فحص السمية الخلوية على أساس الكشف عن فواصل حبلا الحمض النووي واحد لاختبار توافق مع الحياة من pellicles BNC وMBNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد البكتيرية Nanocellulose (BNC)
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
- إعداد مستنبت.
- إعداد 500 مل من مستنبت السائل عن طريق الجمع بين 25 غراما من خلاصة الخميرة، و 15 غراما من ببتون، 125.0 غرام من مانيتول، و 500 مل من الماء درجة نقاوة عالية. الأوتوكلاف هذا الخليط في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 100 مل من وسائل الاعلام نصف صلبة من خلال إضافة 15 غراما من أجار إلى 5.0 غرام من خلاصة الخميرة، 3.0 غرام من ببتون، 25.0 غراما من مانيتول، و 100 مل من الماء درجة نقاوة عالية. الأوتوكلاف هذا الخليط في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. مرة واحدة تعقيمها، إيداع 5 مل من الخليط في 90 ملم × 16 ملم البلاستيك طبق بتري. السماح للحل هلام في 4 درجات مئوية وتخزينها في درجة الحرارة هذه حتى استخدامها مرة أخرى.
- ترطيب G. xylinus سلالة محفوظة في قوارير تجميد المجفف عن طريق إضافة 1 مل من مستنبت السائل وpipetting صعودا وإلى أسفل، كما يتضح من تعليمات الشركة الصانعة.
- تطعيم أطباق بتري تحتوي على وسائل الاعلام نصف صلبة مع قطرات صغيرة من تعليق البكتيرية باستخدام حلقة بتلقيح. تأكد من أن اللقاح يغطي طبق بيتري كامل عن طريق تحريك الحلقة في اتجاه متعرج منعرج من الحافة إلى وسط الطبق.
- احتضان أطباق بتري في 26 درجة مئوية لمدة 72 ساعة في حاضنة دون CO 2. وبمجرد أن فترة حضانة كاملة، مستعمرات صغيرة بيضاء واضحة. إذا لم يتم استخدامها المستعمرات فورا، تخزين أطباق بتري في 4 درجات مئوية بحلول ختم غطاء مع parafilm ووضع أطباق رأسا على عقب. المستعمرات يمكن تخزينها بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- نقل 2 مل من مستنبت السائل المعد في الخطوة (1.1.1) في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا. خذ مستعمرتين بإبرة بتلقيح من أطباق بتري تلقيح في الخطوة (1.3) ووضعها في أول بئر من لوحة زراعة الأنسجة. REPEAT نفس الإجراء ل23 بئرا المتبقية.
- احتضان لوحة زراعة الأنسجة عند 30 درجة مئوية لمدة 7 أيام. هذا وسوف تسفر عن ما مجموعه 24 BNC pellicles بقطر 16 ملم وبسمك حوالي 2-3 ملم قطر كما هو مبين في الشكل 1.
ملاحظة: لا تخل ثقافة البكتيرية في أي وقت أثناء فترة الحضانة، على سبيل المثال عن طريق هز لوحات. خلال فترة الحضانة، G. xylinus يقذف جزيئات السكر غلوكوبيرانوز لتشكيل شبكة البلورية البوليمرية في واجهة الهواء السائل، التي تعتمد على شكل وحجم القارورة تحت ظروف الزراعة ثابتة. هذه المصفوفة البوليمرية، والمعروفة باسم nanocellulose بكتيريا (BNC)، هو واضح في نهاية فترة الحضانة. - جمع pellicles BNC من وسائل الإعلام نمو وتعقيم منهم في 200 مل من 1٪ محلول هيدروكسيد الصوديوم لمدة 1 ساعة على 50 درجة مئوية، وذلك لإزالة كل آثار G. xylinus. اختياريا، وإثارة هذا الحل في 300 دورة في الدقيقة باستخدام شريط مغناطيسيولوحة التحريك. تجاهل محلول هيدروكسيد الصوديوم وإضافة 200 مل من الطازجة 1٪ من محلول هيدروكسيد الصوديوم. كرر نفس العملية مرة أخرى أو حتى pellicles BNC في حل يكتسب مظهر شفاف.
- شطف pellicles BNC مع الماء ثلاث مرات وتخزينها في المياه عالية النقاء في RT. تأكد من وغرقت في pellicles BNC تماما في الماء، ولا يسمح لتجف في أي وقت.
- الأوتوكلاف pellicles BNC على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: أظهرت دراسة في الجسم الحي تحت الجلد في الفئران التي يقوم بها Märtson وزملاء العمل علامات عدم تدهور للBNC بعد 60 أسبوعا الزرع. في الواقع، BNC غير القابلة للتحلل في الطبيعة من الانزيمات الميكروبية والفطرية، والتي هي غائبة في الثدييات. من ناحية أخرى، والتحلل البيولوجي للBNC يمكن أن يكون نتيجة للعمليات الحيوية التي تضعف شبكة ييف مكروي في الجسم الحي 4 الميكانيكية والكيميائية، و.
2. تجميع من البوليمر المغلفةأكسيد الحديد النانوية وإيداعه في البكتيرية Nanocellulose غشاء
- فقاعة 1000 مل من الماء عالية النقاء مع غاز النيتروجين من أجل إزالة أي الأوكسجين المذاب في الماء واستبدالها مع النيتروجين.
- استخدام ثلاثة الرقبة قارورة أسفل جولة لإعداد محلول في نسبة 2: 1 المولي من الحديد (III) هيدرات كلوريد (FeCl 3 · 6H 2 O) والحديد (II) tetrahydrate كلوريد (FeCl 2 · 4H 2 O) المخفف مع المياه عالية النقاء غير المؤكسج. على سبيل المثال، استخدم 5.4 غرام من FeCl 3 · 6H 2 O و1.98 غرام من FeCl 2 · 4H 2 O في 10 مل من غير المؤكسج المياه عالية النقاء. إذا تحول هذا التحضير لزجة جدا ويصعب إثارة، استخدم 0.54 غرام من FeCl 3 · 6H 2 O و0.198 غرام من FeCl 2 · 4H 2 O في 20 مل من غير المؤكسج المياه عالية النقاء.
ملاحظة: تقليل زمن التعرض لل4H FeCl 2 · 2 O في الهواء وزنها عن طريق هذا الفصلمجمع ال- سريع قدر الإمكان. عرض مرة واحدة في ثلاثة الرقبة جولة أسفل القارورة، أغلق ثلاثة الرقبة قارورة أسفل جولة مع سدادات الحاجز حتى يتم توصيله إلى العرض غاز النيتروجين وأنبوب مكثف. - استخدام اثنين من رقاب السفينة لتوفير مدخل وإخراج غاز النيتروجين مستمر من قبل توصيل التيار غاز النيتروجين إلى إبرة كمات في سدادة الحاجز والثابتة لرقاب السفينة.
- ضع 1 جليدة BNC التي أعدت سابقا في الخطوة 1.5 (15.6 ملم وقطرها 2-3 مم سمك) في وعاء مع المواد المتفاعلة. تأكد من غارقة تماما العينة في السائل.
- ربط العنق المتبقية من السفينة إلى أنبوب مكثف. بالإضافة إلى ذلك، استخدام أنبوب تجفيف مليئة كبريتات الكالسيوم اللامائية على رأس أنبوب مكثف. تشغيل المياه من خلال أنبوب مكثف.
- اغلاق جميع المفاصل الزجاج مع الشحوم فراغ.
- الحرارة الحل في حمام زيت السيليكون إلى 80 درجة مئوية باستخدام التحريكموقد وعقد هذه الدرجة حتى خطوة 2.10. استخدام صغيرة شريط مغناطيسي لخلط المواد المتفاعلة في 350 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تأكد من أن BNC والمشرب بشكل مناسب مع حل الحديدية وتذوب المواد المتفاعلة تماما. الحفاظ على اثارة الخليط حتى نهاية التجربة.
ملاحظة: الاستفادة من ميزان حرارة للتحقق من درجة حرارة زيت السيليكون. يجب أن تكون مستقرة إلى 80 درجة مئوية. - زيادة سرعة التحريك إلى 700 دورة في الدقيقة وإضافة (من خلال إسقاط)، في فترة زمنية من 5 دقائق، 5 مل من هيدروكسيد الأمونيوم (NH 4 OH، 14٪) إلى 10 مل من محلول الحديدية باستخدام إبرة pipetting ل، التي كانت لكمات أيضا في سدادة الحاجز. بعد إضافة هيدروكسيد الأمونيوم، ولون من الحل يتغير من الأصفر / البرتقالي إلى اللون الأسود.
- يستمر التحريك الحل في 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أخرى. تجنب التحركات عالية السرعة من أجل الحفاظ على سلامة العينة. بسرعة عالية، أي أعلى من 1000 دورة في الدقيقة، يمكن أن تدمرالعينة.
- خفض درجة الحرارة من الحل إلى 30 درجة مئوية باستخدام أسفل التحكم في درجة الحرارة من موقد اثارة والحفاظ على التحريك لمدة 5 دقائق أخرى. ثم، إيقاف طبق ساخن. في هذه المرحلة، وقد أدرجت في IONP في شبكة BNC.
- تبريد الخليط وصولا الى RT وفصل الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNP) و BNC باستخدام مغناطيس دائم قوي (على سبيل المثال، 1 تسلا). للقيام بذلك، ونقل الخليط إلى قارورة السفينة وبعد ذلك، مع الحفاظ على مغناطيس بالقرب من السفينة، عقد MNPs وBNC في المكان في حين الصب طاف.
ملاحظة: كن حذرا عند التعامل مع مغناطيس قوي لأنها يمكن أن تكون ضارة عند استخدامها بشكل غير صحيح. للحصول على خطوات (2.12) - (2.14) و (2.16) استخدام غير المؤكسج المياه عالية النقاء معدة مسبقا في (2.1) لمنع الجزيئات من الأكسدة. - Resuspend وMNPs و BNC في 100 مل من الماء. يهز بلطف الحل لإزالة كافة MNPs التي لم تنتظم بقوة في BNC. صب الصورةupernatant مرة أخرى من خلال عقد MNPs وBNC في مكانها باستخدام المغناطيس.
- غسل MNPs وBNC عدة مرات بالماء حتى يصل طاف محايد الرقم الهيدروجيني (درجة الحموضة ~ 7)، كما تم قياسها باستخدام شريط اللونية.
- فصل nanocellulose بكتيريا المغناطيسي-functionalized BNC أو المغناطيسي (MBNC) من MNPs باستخدام الملقط وشطف MBNC عدة مرات بالماء حتى الماء يتدفق واضحة.
- تعقيم MBNC من خلال تعريض MBNC O / N للأشعة فوق البنفسجية (110-280 نانومتر).
- الأوتوكلاف 500 مل من غير المؤكسج المياه عالية النقاء في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتخزن MBNC في 20 مل من هذه المياه.
- جو معقم و مطهر، تزج العينة في 1٪ من PEG وتحرك المكونات لمدة 2 ساعة على RT (37 درجة مئوية). هذا الإجراء يحسن توافق مع الحياة والاستقرار من جزيئات أكسيد الحديد المودعة في BNC، وتحديدا أولئك الذين يتعرضون على السطح 5-7. وسيتم توزيع الطلاء PEG عبر الشبكة MBNC 3D.
ملاحظة: تتأكسد عارية IONP بسهولة في الهواءبسبب النشاط الكيميائي عالية من 8. على الرغم من PEG يعتبر مادة غير قابلة للتحلل والاستقرار الكيميائي يعتمد على الظروف البيولوجية التطبيقية مثل محتوى الماء، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة، ووجود الانزيمات، وأنواع الاكسجين التفاعلية، والأنواع النتروجين التفاعلي، وغيرهم 9.
3. توصيف Pellicles BNC وMBNC
- خصائص ميكانيكية
- أداء التحميل العادي واختبار التفريغ nanoindentation باستخدام إندينتر بركوفيتش. في دائرة نصف قطرها من بركوفيتش إندينتر الماس هو 20 نانومتر.
- استخدام السيليكا تنصهر والتنغستن لمعايرة منطقة الاتصال بوصفها وظيفة من عمق المسافة البادئة في RT. أثناء الاختبار، جبل العينات على المسافة البادئة باستخدام الغراء. اقترب إندينتر العينات في اتجاهه سمك.
- عشوائيا مواقع تسنن مختارة على عينات الأسطح. الحفاظ على التباعد بين 2 تزكي بين 200-300 ملم.
- تطبيق تحميل لعينات في الخطوات وسجل نزوح المماثل من إندينتر. تحليل مؤامرة من الحمل مقابل العمق في ايجاد معامل يونغ.
- تنفيذ اختبار nanoindentation من العينات في وجود الماء منزوع الأيونات (DI الماء)، واختبار من خلال تطبيق معدلات الحمل بين 0.0001 م ن / ثانية و 0.005 مليون / ثانية، مع ذروة الحمل بين 0.01 مليون و 0.60 مليون.
- استخدام الخلايا السائلة والحفاظ على العينات تحت بيئة السوائل. هذا الإعداد فريدة من نوعها لتوصيف النانوميكانيكية منغمسين في بيئة السوائل مثالية لمحاكاة فعالية وظيفة النشاط الحيوي متناول الأغشية BNC وMBNC.
- توصيف الهيكلية التي كتبها SEM
- تميز بنية الألياف nanocellulose بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
- يجفد العينات لمدة 24 ساعة في -80 درجة مئوية. ثم جبل على الأزرار ووزارة شؤون المرأة، تفل مع فيلم الاتحاد الافريقي بالشلل الرعاش لمدة 10 ثانية، وتحليلها باستخدام SEM.
- يأخذ الصور في التكبير من 22،000Xو60،000X، مع الجهد تسارع من 5 كيلو فولت.
- المجالات المغناطيسية
- السماح للpellicles MBNC حتى يجف تماما على RT، وبعد ذلك يعرض لمدة 5 دقائق إلى المغناطيس الدائم (1 تسلا).
- على الفور، وتنفيذ قياسات القوة المغناطيسية باستخدام-AFM الحيوية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- لكل قياس، والتقاط أول ملامح التضاريس والحصول على المجالات المغناطيسية خلال تمريرة الثاني. الحصول على كل القياسات مع الحيوي AFM في وضع عدم الاتصال.
- ويجري توصيف المغناطيسي للالنانوية باستخدام تهتز عينة المغنطيسية (VSM) في نظام القياسات الممتلكات المادية (بالمنتجات) من تصميم الكم، في RT (300 K)، مع المجال المغناطيسي في مجموعة من -10000 إلى 10000 أوي.
- Cytocompatibility
- البذور البشري الأورطي خلايا العضلات الملساء (HASMC) في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة في كثافة 1.0x10
- استخدام السكان للخلايا بيروكسيد معاملة غير المعالجة والهيدروجين والضوابط السلبية والإيجابية، على التوالي.
- إجراء فحص المذنب وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة والمبادئ التوجيهية المقترحة من قبل أ. Azqueta وAR كولينز (10).
- استخدام النووي حمض صبغ SYBR الذهب في هذا الاختبار ليقحم وتسمية fluorescently الحمض النووي الموجودة في عينات electrophoresed وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: الخلايا التي لا تخضع لأية أضرار الحمض النووي في وجود عينات BNC وMBNC، وسوف تظهر جولة الفلورسنت الجسم النووي الأخضر، في حين DNA الخلايا التالفة وسوف يكون المذنبات طويلة - سوف عينات إيجابية لديها nucleoids (رئيس المذنب)، يليه الذيول التي تحتوي على مواد الحمض النووي مجزأة (نسبة الحمض النووي في الذيل).
- البذور البشري الأورطي خلايا العضلات الملساء (HASMC) في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة في كثافة 1.0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فترة الحضانة من G. كان xylinus ما مجموعه 9 أيام، ولكن بدأت pellicles لتشكيل وقت سابق، وكانت واضحة بعد حوالي 2 أيام. يتم عرض مظهر العيانية للBNC في الشكل 1، والشكل الذي يحاكي أن ثقافة نابعة من طبق الشكل 2 يوضح عملية لإنتاج pellicles BNC-IONP، الذي يلخص الخطوات الرئيسية التي تشارك في البروتوكول أعلاه، وكذلك تكوين المكونات الرئيسية.
استخدمت الصور SEM لحل المجهرية، مورفولوجيا، والتوزيع المكاني للألياف BNC (الشكل 3) وتوزيع IONP في functionalized BNC (الشكل 4). يتم تشكيل BNC بواسطة أشرطة غرامة (حوالي 50 نانومتر في القطر) التي تشكل المسام المفتوحة في الشبكة بالكامل دون وجود نمط محدد. وIONP هي تفضيلي الموضعATED بين المسام التي شكلتها تضافر ليفية، وتشكيل مجموعات من 100 نانومتر أو أكثر في الحجم. لا بد فرد IONP أيضا على أشرطة. وMBNC يسلك بنية ليفية أقل المضغوط بالمقارنة مع BNC، ربما لأن IONP جمع أشرطة وBNC و. تم استخدام مجهر القوة المغناطيسية لإعادة بناء الشخصية المغناطيسية في تضاريس MBNC (الشكل 5A، B). تتشكل المسام الكبيرة من 500 نانومتر القطر أو أكبر في MBNC، التي لم تراع في BNC غير المعالجة (الشكل 5A). ويتفق ذلك مع الملاحظات الواردة في microphotographs SEM، حيث يعرض MBNC هيكل أكثر مسامية من BNC معدلة. تم الكشف عن التدرج القوة المغناطيسية مع اثنين من المجالات المغناطيسية المختلفة عبر السطح MBNC (الشكل 5B)، التي لا ترتبط مع التلال والوديان التي شكلتها المناطق IONP الغنية في MBNC الصور الطبوغرافية (الشكل 5A) التباين. الأسواق العالمية ضغطها مرتفع وضعفيتم الرمز المجالات المغناطيسية nsity كما الأصفر والأخضر في الشكل 5B على التوالي. حلقة التباطؤ من الجسيمات النانوية، التي يتم قياس جزءا لا يتجزأ من nanocellulose بكتيريا، هو مبين في الشكل (5) تقديم أدلة على أن جميع IONPs كانت مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic في RT، مع عدم التباطؤ.
تم مثقف HASMC في وجود BNC وMBNC لاختبار أي تأثير ضار على سلامة الخلايا الفردية نتيجة التعرض لهذه المواد الغريبة. وكان كميا مدى الضرر في الخلايا الفردية عن طريق الكشف عن فواصل حبلا الحمض النووي (الشكل 6). وتمت مقارنة النتائج إلى HASMC المتزايد في ظل ظروف زراعة العادية من 37 درجة مئوية، و 95٪ الهواء، و 5٪ CO 2 (المراقبة السلبية) وHASMC مع الهيدروجين السمية الوراثية التي يسببها بيروكسيد (100 ميكرومتر H 2 O 2) لمدة 30 دقيقة ( مراقبة إيجابية). وأظهرت المقارنات المقترنة باستخدام اختبار t عشرفي الآثار المترتبة على MBNC على بقاء الخلية كانت مختلفة كثيرا عن تلك التي يسببها العلاج بيروكسيد الهيدروجين على HASMC (ص -value <0.001 ***).
الشكل 1. الجوانب العيانية nanocellulose بكتيريا. قد تم الحصول عليها pellicles BNC بعد فترة الحضانة 11 يوما، والتي هي تقريبا. 3 مم في السمك. فترة الحضانة يعتمد على متطلبات للاستخدام المقصود. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تصنيع nanocellulose بكتيريا functionalized مغناطيسيا. يتم تجميع جزيئات أكسيد الحديد، وأنا ncorporated في الموقع الطبيعي داخل BNC، مما أسفر عن MBNC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ووزارة شؤون المرأة صورة BNC. يعرض BNC شبكة غرامة وأشرطة غير مجمعة مع أحجام 50 نانومتر أو أقل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. SEM صورة BNC-IONP جليدة. النانوية أكسيد الحديد (IONP) يتم وضع تفضيلي بين أشرطة التداخل.د / 52951 / 52951fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. فؤاد تضاريس MBNC والهياكل مجال المغناطيسي. الطبوغرافيا (A) سطح MBNC تظهر بقع من الجسيمات النانوية تعبئتها للغاية، التي تقف فوق هيكل nanofibril. (ب) مجالات صفراء وخضراء دلالة على منطقتين من مغنطة مختلفة من الحقل العالي وضعف كثافة المغناطيسي على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. مدى التلف في الحمض النووي في HASMC بعد أن تعرضلBNC، وMBNC على التوالي. PosCtl يدل HASMC التي خضعت الهيدروجين بيروكسيد العلاج لأغراض المقارنة. NegCtl يدل HASMC المتزايد في ظل ظروف زراعة العادية. وكانت الآثار الضارة للMBNC على HASMC الجدوى وتختلف كثيرا عن تلك التي لوحظت في PosCtl (القيمة الاحتمالية <0.001 ***). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سمك وحجم جليدة BNC يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير فترة حضانة وحجم القارورة التي يزرع خلال زراعة ثابتة. وmicroproperties من BNC، مثل المسامية، يمكن تعديلها عن طريق تغيير نسبة الأوكسجين في ثقافة ثابتة. تركيزات الأكسجين ارتفاع العائد أكثر صرامة BNC 11. أنتجت A. بودين وزملاء العمل أنابيب BNC مع ضغط الانفجار تصل إلى 880 ملم زئبق عن طريق تغيير نسبة الأكسجين في الغلاف الجوي من الأكسجين إلى 100٪ الأكسجين أثناء عملية تخمير G. xylinus 12. وبالمثل، فإن المسامية للBNC ويمكن أيضا إدخال من خلال دمج porogens مثل المجهرية شمع البارافين في عملية التخمير. سوف ينتج عن ذلك من المسامية والمسام الترابط في هذه الحالة يعتمد على حجم porogen 13.
شبكة مسامية من BNC يسمح لها أن تكون functionalized مع النانوية، على سبيل المثال، لتسليم المخدراتوكلاء. في دراستنا، ونحن قد functionalized BNC مع IONP عن طريق تجميع والمتنامية في الموقع النانوية في غشاء BNC، من أجل تنفيذ بروتوكول المغناطيسي لتجنيد خلية السريع والتعلق في السقالات أساس BNC. اختبارات ميكانيكية نانوية تكشف عن أن استجابة النانوية من BNC تتصرف بالمثل مع الأوعية الدموية 14 مع معامل منخفض جدا يونغ، E BNC = 0.0025 جيغا داخل العينات إلى 0.04 جيغا على السطح. القيم التي تم الحصول عليها هي في حدود مع تلك التي لوحظت من قبل فو وآخرون. 15.
يمكن بسهولة إزالة الفائض من IONP من BNC بسبب المسامية العالية للمادة. وأظهرت الصور ووزارة شؤون المرأة التي يتم توزيعها النانوية بشكل رئيسي في المساحات التي شكلتها تضافر يفية وتفرقوا على طول أشرطة. تركيز أنواع الحديد المستخدم في هذا البروتوكول أسفرت تعبئتها عالية الكثافة IONP، الذي جمع أشرطة وBNC و. وأدى ذلك إلىMBNC مع المسام أكبر من تلك التي BNC معدلة. اولسون وآخرون، الذين استخدموا تركيزات مختلفة من FeSO 4 / كوكلي 2 الأملاح مع نفس الحجم جزء من BNC في تركيب aerogels السليلوز nanofibril، أفاد زيادة مماثلة في المسامية BNC عندما غيروا جزء حجم الفريت الكوبالت المغناطيسية النانوية من 0.7٪ إلى 5.7٪ (16). هذا المسامية العالية في MBNC يمكن أن يكون مفيدا لترسب الأدوية التي تزيد من وقت الشفاء وتجنب عودة التضيق في جدران الشرايين التالفة.
كما تم وصف عدم وجود علاقة بين الميزات الطبوغرافية والصور المرحلة المغناطيسية بواسطة B. توري وآخرون. 17، الذي أشار إلى أن الاستقلال بين التضاريس والإشارات المغناطيسية للجسيمات متناهية الصغر الأفلام متفرق. هناك حاجة لإجراء دراسات التوصيف إضافية لتحديد التباطؤ مغنطة (MH) حلقات من MBNC عبر الحبار VSM سيينبع.
أظهرت MBNC قدرة منخفضة على الآثار السامة، وفقا لنتائج لوحظت في المذنب الفحص، مشيرا إلى أن هذه المواد هي حيويا للاستخدام في اتصال مع الخلايا.
ترتبط الخطوات الأكثر أهمية في الإجراء لكمية من هيدروكسيد الأمونيوم والسرعة التي تتم إضافتها، وكذلك ضمان الانغماس الكامل والتحريك من BNC في حل أثناء التفاعل. الجانب الأول يحدد حجم الناتج النانوية أكسيد الحديد، في حين أن الثانية تؤثر كيفية توزيع الجسيمات النانوية عبر مصفوفة BNC. من أجل تحسين مراقبة حجم MNPs، السحاحة مع محبس يمكن استخدامها لتنظيم علاوة على ذلك من خلال إسقاط هيدروكسيد الأمونيوم في رد الفعل. ينصح قطع صغيرة من BNC التي يمكن أن تكون مغمورة تماما في الحل، على سبيل المثال، والأحجام من حوالي 1.9 سم 2 لإجمالي حجم 10 مل من محلول. واحد حدها الاقصىالكساء من هذه التقنية هو التوزيع غير المتجانس للIONP داخل شبكة BNC.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لدمج جزيئات أكسيد الحديد في BNC لتشكيل مركب. ونظرا لتوافق مع الحياة والخصائص الفيزيائية والميكانيكية على حد سواء BNC وجزيئات أكسيد الحديد، وMBNC يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات الطبية الحيوية مثل نظم لتقديم الأدوية والسقالات لنمو الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al.
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
