Abstract
В этом исследовании, бактериальный nanocellulose (BNC) , продуцируемые бактериями Gluconacetobacter xylinus синтезируется и пропитывают на месте с наночастицами оксида железа (IONP) (Fe 3 O 4) с получением магнитного бактериальной nanocellulose (MBNC). Синтез MBNC является точным и специально разработан многоэтапный процесс. Коротко, бактериальный nanocellulose (BNC) Плёночные образуются из сохранившегося G. Штамм xylinus согласно нашим экспериментальным требованиям размера и морфологии. Раствор железа (III) гексагидрата хлорида (FeCl 3 · 6H 2 O) и железа (II) тетрагидрата хлорида (FeCl 2 · 4H 2 O) с 2: мольном соотношении 1 получают и разводят в обедненной кислородом воды высокой степени чистоты. Пленочную BNC затем вводят в сосуд с реагентами. Эту смесь перемешивают и нагревают при 80 ° С в масляной ванне кремния и гидроксида аммония (14%), затем добавляют отбрасыванием для осажденияионов железа в сетке BNC. Этот последний шаг позволяет формировать наночастицы магнетита (Ситу Fe 3 O 4) внутри бактериальной nanocellulose сетки , чтобы придать магнитные свойства BNC налетом. Токсикологической анализ использовали для оценки биосовместимости пелликулой BNC-IONP. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) был использован для покрытия IONPs для того, чтобы улучшить их биосовместимость. С помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображения показали, что IONP располагались преимущественно в фибриллы переплетение пространства матрицы BNC, но некоторые из них были также найдены вдоль ленты BNC. Магнитные измерения силы микроскопа, выполненные на MBNC обнаружили присутствие магнитных доменов с высокой и слабой интенсивности магнитного поля, что подтверждает магнитную природу пелликулой MBNC. Значения модуля Юнга, полученные в этой работе также находятся в разумном согласии с теми, сообщили несколько кровеносных сосудов в предыдущих исследованиях.
Introduction
Bacterian nanocellulose (BNC) синтезируется Acetobacter xylinum штамма, также известный как Gluconacetobacter xylinus и откладываются в виде пленок или Плёночные на границе раздела воздух-жидкость во время стационарной культуры. Эти Плёночные BNC принимают форму контейнера , где их выращивают, а их толщина зависит от количества дней в культуре. А. xylinus использует глюкозы в среде для синтеза микрофибрилл целлюлозы с помощью процесса полимеризации и последующей кристаллизации. Полимеризация остатков глюкозы проводят при бактериальной внеклеточной мембране, где глюкан цепи выдавливают из одиночных пор, распределенных по клеточной оболочки. Кристаллизация микрофибрилл целлюлозы происходит во внеклеточном пространстве с образованием глюкана цепи листов ван - дер - ваальсовых связей с последующей укладкой листов с помощью Н-связи 1.
МагнитНаночастицы IC, интегрированные в матрицу BNC можно легко манипулировать с помощью внешнего магнитного поля для того, чтобы увеличить силу, необходимую, чтобы направить и ограничить гладкомышечных клеток (SMCS), содержащий магнитные наночастицы, на поврежденном участке артериальной стенки. Эта стратегия удерживает SMCs от других тканей, а также удерживает клетки на месте против силы, прикладываемой с помощью кровотока. Было показано , что SMCs играют важную роль в vasoelasticity кровеносного сосуда, где они образуют обильные слои , расположенные в основном в средней части оболочки 2.
Метод, используемый для синтеза MBNC включает BNC пелликула погружают и перемешивают в растворе железа (III) гексагидрата хлорида железа и хлорид (II), тетрагидрат при 80 ° C. Гидроксид аммония добавляют с образованием наночастиц оксида железа внутри меша BNC. Добавление гидроксида аммония приводит к изменению цвета раствора от оранжевого до черного. IONPs компактный вместе вдоль фибриллы BNCс с неравномерным распределением.
Этот протокол фокусируется на разработке бактериального nanocellulose-магнитные наночастицы налетом, который мы назвали магнитной бактериальная nanocellulose (MBNC), который предназначен для использования в качестве замены отсутствующих, поврежденных малого диаметра кровеносных сосудов. HS Barud и его коллеги недавно опубликовали подобную работу , чтобы произвести BNC на основе гибкого магнитного бумаги путем смешивания BNC Плёночные в стабильной водной дисперсии ПЭГ и наночастиц оксида железа суперпарамагнит- 3. Здесь мы описываем производство бактериальной целлюлозы и ее пропитку на месте с магнитными наночастицами. Пробирного цитотоксичность, основанный на обнаружении одного разрывов ДНК использовали для тестирования биосовместимости Плёночные BNC и MBNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение Бактериальный Nanocellulose (BNC)
Примечание: Все операции выполняются в асептических условиях, если не указано иное.
- Подготовка культуральной среды.
- Приготовьте 500 мл жидкой культуральной среды путем объединения 25 г дрожжевого экстракта, 15 г пептона, 125,0 г маннита, и 500 мл воды высокой степени чистоты. Автоклав эту смесь при 120 ° С в течение 20 мин и хранят при температуре 4 ° С.
- Приготовьте 100 мл полутвердых сред путем добавления 15 г агара до 5,0 г дрожжевого экстракта, 3,0 г пептона, 25,0 г маннита и 100 мл воды высокой степени чистоты. Автоклав эту смесь при 120 ° С в течение 20 мин. После того, как автоклавируют, депозит 5 мл смеси в 90 мм х 16 мм пластиковые чашки Петри. Дайте раствору геля при 4 ° С и хранят при этой температуре до дальнейшего использования.
- Увлажняет G. xylinus штамм сохранился в высушенных вымораживанием ампул путем добавления 1 мл жидкой культуральной среды и пипетированием вверх ивниз, как указано в инструкции изготовителя.
- Инокуляции чашки Петри, содержащие полутвердую среду с мелкими капельками бактериальной суспензии с использованием затравочной петли. Убедитесь, что прививочный материал покрывает всю чашку Петри, перемещая петлю в направлении зиг заг от края к центру блюда.
- Инкубируйте чашки Петри при температуре 26 ° С в течение 72 ч в инкубаторе без СО 2. После того, как инкубационный период завершения, небольшие белые колонии видны. Если колонии не используют немедленно, хранить чашки Петри при 4 ° С с помощью уплотнительной крышки парапленкой и поместив посуду с ног на голову. Колонии можно хранить таким образом в течение до 6 месяцев.
- Передача 2 мл жидкой питательной среды культивирования, полученного на стадии (1.1.1) в каждую лунку планшета для культуры ткани 24-луночного. Возьмите две колонии с бактериальная игла из привитых чашки Петри на стадии (1.3) и поместите их в первую лунку планшета для культуры ткани. рEPEAT ту же процедуру для остальных 23 скважин.
- Выдержите тканевой культуры планшет при 30 ° С в течение 7 дней. Это даст в общей сложности 24 BNC Плёночные с диаметром 16 мм и толщиной диаметром приблизительно 2-3 мм , как показано на рисунке 1.
Примечание: Не беспокоить бактериальной культуры в любой момент в течение инкубационного периода, например, путем встряхивания пластин. В течение инкубационного периода, G. xylinus выдавливает глюкопиранозных молекулы сахара с образованием полимерной кристаллическую сетку в воздушно-жидкостной интерфейс, который принимает форму и размер колбы в статических условиях культивирования. Эта полимерная матрица, известная как бактериальной nanocellulose (BNC), является заметным в конце инкубационного периода. - Собирают Плёночные BNC из питательной среды и стерилизовать их в 200 мл 1% -ного раствора NaOH в течение 1 ч при 50 ° С, для того , чтобы удалить все следы G. xylinus. По желанию, размешать этот раствор при 300 оборотах в минуту с помощью магнитной мешалкии перемешивание пластины. Выбросьте раствор NaOH и добавляют 200 мл свежеприготовленного 1% -ного раствора NaOH. более Повторите тот же самый процесс один раз или до Плёночные BNC в растворе не приобретает полупрозрачный внешний вид.
- Промыть Плёночные BNC с водой три раза и хранить их в воде высокой чистоты при комнатной температуре. Убедитесь, что Плёночные BNC полностью погружены в воду и не дают высохнуть в любое время.
- Автоклав Плёночные BNC при 121 ° С в течение 20 мин.
Примечание: в естественных условиях подкожное исследование на крысах в исполнении Märtson и соавторами показали признаки без деградации BNC после 60 недель имплантации. Действительно, BNC разлагаемые в природе микробными и грибковые ферменты, которые отсутствуют у млекопитающих. С другой стороны, биоразлагаемость BNC может быть результатом механического, химического и биологических процессов, ослабляющих сети микрофибрилл в естественных условиях 4.
2. Синтез с полимерным покрытиемНаночастицы оксида железа и его отложению в бактериальном Nanocellulose мембраны
- Пузырь 1000 мл воды высокой степени чистоты с газообразным азотом, чтобы удалить какой-либо растворенного кислорода в воде, и заменить его азотом.
- Используйте трехгорлую круглодонную колбу , чтобы приготовить раствор , в соотношении 2: 1 молярном соотношении железа (III) гексагидрата хлорида (FeCl 3 · 6H 2 O) и железа (II) тетрагидрата хлорида (FeCl 2 · 4H 2 O) , разбавленный с обедненной кислородом воды высокой степени чистоты. Например, можно использовать 5,4 г FeCl 3 · 6H 2 O и 1,98 г FeCl 2 · 4H 2 O в 10 мл обедненной кислородом воды высокой степени чистоты. Если этот препарат оказывается слишком вязким и трудно перемешивать, используют 0,54 г FeCl 3 · 6H 2 O и 0,198 г FeCl 2 · 4H 2 O в 20 мл обедненной кислородом воды высокой степени чистоты.
Примечание: Сокращение времени экспозиции в FeCl 2 · 4H 2 O в воздухе путем взвешивания этой чemical соединение как можно быстрее. После того, как введен в трехгорлую круглодонную колбу, закройте трехгорлую круглодонную колбу с пробками перегородки, пока он не подключен к источнику газообразного азота и конденсаторной трубки. - Используйте два шеек судна, чтобы обеспечить постоянный вход и выход газообразного азота путем подключения подачи газообразного азота к иглопробивное в перегородке пробкой и прикрепленной к шее сосуда.
- Поместите 1 BNC пленку, которая была подготовлена ранее на стадии 1.5 (15,6 мм в диаметре и 2-3 мм толщины) в сосуде с реагентами. Убедитесь, что образец полностью погружен в жидкость.
- Подключите оставшийся горлышко сосуда в трубу конденсатора. Кроме того, использовать сушильную трубку, наполненную безводным сульфатом кальция в верхней части конденсатора трубки. Запуск воды через трубу конденсатора.
- Печать всех стеклянных суставов с вакуумной смазкой.
- Раствор нагревают в силиконовой масляной бане до 80 ° С, используя перемешиваниеконфорка и удерживать эту температуру до шага 2.10. С помощью небольшой магнитной мешалке смешивать реагенты при 350 оборотах в минуту в течение 5 мин. Убедитесь, что BNC надлежащим образом пропитывают раствором железа и реагенты полностью растворились. Продолжают перемешивание смеси до конца эксперимента.
Примечание: Используйте термометр, чтобы проверить температуру силиконового масла. Она должна быть стабильной до 80 ° С. - Увеличение скорости перемешивания , до 700 оборотов в минуту и добавить (отбрасыванием), во временном интервале от 5 мин, 5 мл раствора гидроксида аммония (NH 4 OH, 14%) в 10 мл черного раствора с помощью пипетки иглы, которая была также пробил в перегородке пробке. После добавления гидроксида аммония, то цвет раствора изменяется от желтого / оранжевого до черного.
- Продолжить перемешивание раствора при 80 ° С в течение еще 5 мин. Избегайте высокоскоростных побуждения для того, чтобы сохранить целостность образца. Высокие скорости, то есть выше , чем 1000 оборотов в минуту, может уничтожитьобразец.
- Чем ниже температура раствора до 30 ° С с помощью регулирования температуры нижней части перемешивающего плитке и держать перемешивание в течение еще 5 мин. Затем выключите горячую плиту. В этот момент IONP были включены в сетку BNC.
- Охлаждают смесь до комнатной температуры и отделяют магнитные наночастицы (MNP) и BNC с помощью сильного постоянного магнита (например, 1 Тесла). Для этого, вводить смесь в колбу сосуда, а затем, при сохранении магнит к емкости, удерживая MNPS и БНК на месте в то время как декантированием супернатанта.
Примечание: Будьте осторожны при обращении с сильными магнитами, так как они могут быть вредными при неправильном использовании. Для шагов (2.12) - (2.14) и (2.16) использовать венозная воду высокой чистоты, приготовленные ранее в (2.1), чтобы предотвратить частицы от окисления. - Ресуспендируют MNPS и BNC в 100 мл воды. Слегка встряхните решение, чтобы удалить все MNPS, которые не сильно внедренные в BNC. Переливать Supernatant снова, удерживая MNPS и BNC на месте с помощью магнита.
- Промыть MNPS и несколько раз BNC с водой до тех пор, пока не достигнет супернатант нейтрального рН (рН ~ 7), как измерено с помощью колориметрического полосу.
- Отдельные магнитные функционализированных BNC или магнитной бактериальной nanocellulose (MBNC) из MNPS с помощью пинцета и промойте MBNC несколько раз водой, пока вода не станет прозрачной.
- Стерилизовать MBNC, подвергнув MBNC O / N к УФ (110-280 нм).
- Автоклавы 500 мл обедненной кислородом воды высокой чистоты при 120 ° С в течение 20 мин и хранят MBNC в 20 мл этой воды.
- Консерванта, погрузить образец в 1% ПЭГ и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре (37 ° C). Эта процедура улучшает биосовместимость и стабильность наночастиц оксида железа , осажденных в БНК, в частности , тех , кто подвергается на поверхности 5-7. Покрытие ПЭГ будет распределен по MBNC 3D сети.
Примечание: Голый IONP легко окисляются на воздухеиз - за их высокой химической активности 8. Несмотря на то, ПЭГ считается небиоразлагаемое материал, его химическая стабильность зависит от применяемых биологических условий , таких как содержание воды, рН, температура, наличие ферментов, активных форм кислорода, активных форм азота, а также другие 9.
3. Характеристика BNC и MBNC Плёночные
- Механические свойства
- Выполните обычную загрузку и разгрузку тест наноиндентирование с использованием индентора Беркович. Радиус Берковича алмазного индентора составляет 20 нм.
- Используйте плавленый диоксид кремния и вольфрама для калибровки площади контакта в зависимости от глубины вдавливания при комнатной температуре. Во время теста, установите образцы на отступа с помощью клея. Индентор подошел образцы в направлении его толщины.
- Произвольно выберите места отступа на образцах поверхностей. Держите расстояние между 2 отступов между 200-300 мм.
- Применить нагрузку наобразцы с шагом и записывать соответствующее перемещение индентора. Анализ график нагрузки в зависимости от глубины, чтобы найти модуль Юнга.
- Испытание проводят наноиндентирование образцов в присутствии деионизированной воды (ДИ воды), и проверить путем применения ставок нагрузки между 0.0001 мН / с и 0,005 мН / сек, с пиковой нагрузке в диапазоне от 0,01 до 0,60 мН мН.
- Используйте жидкую клетку и держать образцы в среде жидкости. Эта уникальная установка для наномеханического характеристики погруженного в среде жидкости идеально подходит для эффективного моделирования досягаемости биомеханической функциональности BNC и MBNC мембран.
- Структурная характеристика с помощью СЭМ
- Охарактеризуйте структуру nanocellulose волокна с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
- Лиофилизации образцов в течение 24 ч при температуре -80 ° С. Затем установите на SEM шпильки, разбрызгивание с Au-Pd пленку в течение 10 сек и анализируют с помощью сканирующего электронного микроскопа.
- Принимает изображения при увеличении 22,000Xи 60,000X, с ускоряющим напряжением 5 кВ.
- Магнитные домены
- Разрешить Плёночные MBNC полностью высохнуть при комнатной температуре, а затем подвергать воздействию в течение 5 мин до постоянного магнита (1 Тесла).
- Сразу же, проводить измерения магнитной силы с использованием био-AFM в соответствии с протоколом производителя.
- Для каждого измерения, захватить первую особенности топографии и приобретают магнитные домены во время второго прохода. Получить оба измерения с био-AFM в бесконтактном режиме.
- Магнитные характеристики наночастиц проводят с использованием вибрационного магнитометра (VSM) в системе измерений физических свойств (ПМП) от Quantum Design, при комнатной температуре (300 К), с магнитным полем в диапазоне от -10000 до 10000 эрстед.
- Cytocompatibility
- Семенной аорты человека клетки гладких мышц (HASMC) в 6-луночных тканевого культурального планшета при плотности 1.0x10
- Используйте популяции необработанных и перекисью водорода клеток, обработанных в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно.
- Выполнение анализа Comet в соответствии с протоколами изготовителя и руководящих принципов , предложенных А. Azqueta & Collins AR 10.
- Используйте краситель SYBR кислоты Золото нуклеиновой в этом анализе интеркалировать и флуоресцентно этикетке ДНК, содержащейся в электрофорезу образцах в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: Ячейки, которые не претерпевают каких-либо повреждений ДНК в присутствии BNC и MBNC образцов, покажет флуоресцентный круглый зеленый нуклеоида, тогда как ДНК поврежденные клетки будут иметь длинные кометы - положительные образцы будут иметь нуклеоиды (голова кометы), а затем хвосты, которые содержат фрагментированную ДНК материала (процент ДНК в хвосте).
- Семенной аорты человека клетки гладких мышц (HASMC) в 6-луночных тканевого культурального планшета при плотности 1.0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инкубационный период G. xylinus было в общей сложности 9 дней, но Плёночные начали формироваться раньше и были очевидны после того, как около 2 дней. Макроскопические появление BNC отображается на рисунке 1, форма которых имитирует блюда выращенных культуры. Рисунок 2 описывает способ получения BNC-IONP Плёночные, которая в кратком изложении основные этапы протокола выше, а также конфигурация основных компонентов.
СЭМ изображения были использованы для решения микроструктуры, морфология, и пространственное распределение волокон BNC (рисунок 3) и распределение IONP в функционализированного BNC (рисунок 4). BNC образован тонкими лентами (около 50 нм в диаметре), которые образуют открытые поры по всей сети без определенного шаблона. IONP являются преимущественно LOCованные между порами, образованных фибрилл переплетения, образующих кластеры 100 нм или более в размере. Индивидуальные IONP также связаны вдоль ленты. MBNC проявляет менее уплотненной структуру фибрилл по сравнению с BNC, вероятно, потому, что IONP собрать вместе ленты БНК в. Магнитный силовой микроскоп был использован для восстановления магнитного профиля на топографии MBNC (рис 5А, В). Большие поры диаметром 500 нм или больше образуются в MBNC, которые не были обнаружены в необработанном BNC (фиг.5А). Это согласуется с наблюдениями в микрофотографии SEM, где MBNC отображает более пористую структуру, чем немодифицированного BNC. Магнитная сила градиента с двумя областями разной намагниченности было обнаружено по всей поверхности MBNC (рис 5B), чей контраст не коррелирует с холмов и долин , образованных IONP богатых регионов в MBNC топографические изображения (рисунок 5А). Высокая и слабая интеnsity магнитные поля обозначены как желтый и зеленый цвет на рисунке 5В соответственно. Петля гистерезиса наночастиц, которая измеряется внедренных в бактериальном nanocellulose, показана на рисунке 5 при условии доказательства того, что все IONPs были суперпарамагнитны при комнатной температуре, без гистерезиса.
HASMC культивировали в присутствии БНК и MBNC для тестирования любого вредного влияния на жизнеспособность отдельных клеток в результате воздействия этих инородных материалов. Степень повреждения в отдельных клетках количественно определяли с помощью обнаружения ДНК разрывов ДНК (рисунок 6). Результаты сравнивали с HASMC растут в нормальных условиях культивирования 37 ° С, 95% воздуха и 5% CO 2 (отрицательный контроль) и HASMC с использованием перекиси водорода индуцированных Генотоксичность (100 мкМ H 2 O 2) в течение 30 мин ( положительный контроль). Парных сравнений с использованием Т-тест показал, тыспри воздействии на MBNC на жизнеспособность клеток значительно отличались от тех , которые индуцируют с помощью обработки пероксидом водорода на HASMC (р -величина <0,001, ***).
Рисунок 1. макроскопических аспекты бактериального nanocellulose. BNC Плёночные получены после инкубационного периода 11 дней, которые ок. 3 мм в толщину. Инкубационный период зависит от требований к использованию по назначению. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изготовление магнитно - функционализированного бактериальной nanocellulose. Наночастицы оксида железа собираются и я ncorporated на месте внутри BNC, получая MBNC. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. СЭМ изображение BNC. БНК показывает тонкую сетку и необобщенную ленты с размерами 50 нм или менее. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. РЭМ изображение BNC-IONP пелликула. Наночастицы оксида железа (IONP) преимущественно расположены между переплетения лент.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. AFM топография MBNC и магнитных доменных структур. (A) топографии поверхности MBNC показывая пятна высокообогащенного упакованных наночастиц, которые стоят над структурой nanofibril. (B) Желтые и зеленые домены обозначают две области различной намагниченности высокой и слабой интенсивности магнитного поля соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Степень повреждения ДНК в HASMC после того , как воздействиек BNC и MBNC соответственно. PosCtl обозначает HASMC , который подвергается обработке пероксидом водорода для целей сравнения. NegCtl обозначает HASMC растет при нормальных условиях культивирования. Пагубные последствия MBNC на HASMC жизнеспособность значительно отличались от тех , которые наблюдались в PosCtl (величина р <0,001, ***). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Толщина и размер пелликулой BNC можно легко манипулировать путем изменения времени инкубации и размер колбы, в которой она выращена при статическом культивировании. В microproperties из БНК, такие как пористость, может быть изменена путем изменения соотношения кислорода в статической культуре. Более высокие концентрации кислорода дают более жестким BNC 11. А. Бодин и соавторы производства труб BNC с разрывного давления до 880 мм ртутного столба путем изменения соотношения кислорода из атмосферного кислорода до 100% кислорода в течение процесса ферментации G. xylinus 12. Аналогичным образом, пористость БНК также могут быть введены путем введения порообразователей, такие как парафин микросферы в процессе ферментации. Полученная пористость и пор взаимосвязанности в этом случае будет зависеть от размера порообразователя 13.
Пористая сеть BNC позволяет им быть функционализированных наночастиц, например, для доставки лекарствагенты. В нашем исследовании мы функционализированный BNC с IONP путем синтеза и выращивания на месте наночастиц в мембране BNC, для реализации магнитного протокола для быстрого набора клеток и вложения в каркасах BNC основе. Наномеханические тесты показывают , что наноразмерные реакция BNC ведет себя аналогично с кровеносными сосудами 14 с модулем очень низкой Юнга E BNC = 0,0025 ГПа внутри образцов до 0,04 ГПа на поверхности. Полученные значения находятся в диапазоне с наблюдаемыми при Fu и др. 15.
Избыток IONP может быть легко удален из БНК из-за высокой пористости материала. фотографии SEM показали, что наночастицы распределены в основном в пространствах, образованных фибрилл переплетением и рассредоточенных вдоль ленты. Концентрация частиц железа, используемых в этом протоколе Поддавшись высокой плотно упакована IONP, которая собрала ленты БНК в. Это привело кMBNC с большими порами, чем у немодифицированного BNC. Олссон и др., Которые используются в различных концентрациях FeSO 4 / CoCl 2 соли с той же объемной доли БНК в синтезе nanofibril целлюлозы аэрогелей, сообщает аналогичное увеличение пористости BNC , когда они изменили объемную долю ферромагнитной феррита кобальта наночастицы с 0,7% до 5,7% 16. Эта высокая пористость в MBNC может быть предпочтительным для осаждения препаратов, которые увеличивают время восстановления и избежать повторного стеноза при поврежденных стенок артерий.
Отсутствие корреляции между топографическими особенностями и фазовых изображений магнитных также были описаны Б. Torre и др. 17, который указал на независимость между топографией и магнитных сигналов редких пленок наночастиц. Дальнейшие исследования по характеристике должны быть проведены для определения намагниченности гистерезиса (MH) петель MBNC через SQUID-VSM SYстебли.
MBNC показали низкий потенциал токсических эффектов, в соответствии с результатами, наблюдаемыми в анализе Comet, что указывает, что этот материал является биологически совместимым для использования в контакте с клетками.
Наиболее важные шаги в процедуре связаны с количеством гидроксида аммония и от скорости, с которой он будет добавлен, а также обеспечение полного погружения и перемешивание БНК в растворе в ходе реакции. Первый аспект определяет размер полученных наночастиц оксида железа, в то время как второй влияют как наночастицы распределены по матрицы BNC. Для того, чтобы лучше контролировать размер MNPS, бюретку с запорным краном может быть использован для регулирования добавления путем сбрасывания гидроксида аммония в реакционную смесь. Небольшие кусочки BNC , которые могут быть полностью погружен в раствор, рекомендуется, например, размеры примерно 1,9 см 2 для общего объема 10 мл раствора. Один Limiставление этого метода является неоднородное распределение IONP внутри сетки BNC.
Этот протокол описан способ включения наночастиц оксида железа в БНК с образованием композиционного материала. Из-за биосовместимости и физико-механических свойств как БНК и наночастиц оксида железа, то MBNC может быть использован в различных биомедицинских применений, таких как системы доставки лекарственных средств и Каркасы для клеточного роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al.
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
