Abstract
במחקר זה, ננוצלולוז בקטריאלי (BNC) המיוצר על ידי חיידקים xylinus Gluconacetobacter הוא מסונתז ועיבר באתרו עם חלקיקי תחמוצת ברזל (IONP) (Fe 3 O 4) להניב ננוצלולוז חיידקי מגנטי (MBNC). הסינתזה של MBNC היא תהליך מדויק שתוכנן במיוחד רבי שלבים. בקצרה, ננוצלולוז בקטריאלי (BNC) pellicles נוצרות נשמר G. xylinus זן בהתאם לדרישות של גודל ומורפולוגיה הניסוי שלנו. פתרון של ברזל (III) כלוריד hexahydrate (FeCl 3 · 6H 2 O) וברזל tetrahydrate כלוריד (II) (FeCl 2 · 4H 2 O) עם 2: יחס טוחנת 1 ערוכה מדולל במים טוהר גבוהה deoxygenated. קרומי BNC הוא הציג אז את הספינה עם המגיבים. תערובת זו היא זע מחוממת על 80 מעלות צלזיוס באמבט שמן סיליקון אמוניום הידרוקסיד (14%) הוא הוסיף אז על ידי הטלה כדי לזרז אתברזלי יונים לתוך רשת BNC. השלב אחרון זה מאפשר להרכיב חלקיקי מגנטיט באתרו (Fe 3 O 4) בתוך רשת ננוצלולוז חיידקים להעניק תכונות מגנטיות כדי קרומי BNC. Assay טוקסיקולוגית שמש כדי להעריך את ההתאמה הביולוגית של קרומי BNC-IONP. פוליאתילן גליקול (PEG) שימש לכיסוי IONPs על מנת לשפר biocompatibility שלהם. תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הראה כי IONP אותרו מועדף של סיבית Interlaced ל- Progressive רווחים של מטריקס BNC, אבל חלק מהם נמצאו גם לאורך סרטים BNC. מדידות מיקרוסקופ כוח מגנטיות שבוצעו על MBNC זיהו את התחומים מגנטיים הנוכחות עם שדה מגנטי בעצמה גבוהה וחלש, המאשר את הטבע המגנטי של קרומי MBNC. ערכי מודול יאנג שהושגו בעבודה זו הם גם בהסכם סביר עם אלו שדווחו במשך כמה כלי דם במחקרים קודמים.
Introduction
ננוצלולוז bacterian (BNC) מסונתז על ידי זן xylinum Acetobacter, הידוע גם בשם Gluconacetobacter xylinus, והפקידו בצורת סרטים או pellicles על ממשק-נוזלי אוויר במהלך התרבות נייח. Pellicles BNC אלה לאמץ את צורת המיכל שבו הם גדלו, ועובי שלהם תלוי במספר ימים בתרבות. א xylinus משתמשת גלוקוז בטווח הבינוני לסינתזה של מיקרופיברילות התאית באמצעות תהליך של פילמור וגיבוש שלאחר מכן. פילמור של שאריות גלוקוז מתבצע על הקרום התא החיידקים שבו שרשרות גלוקן נמתחות מנקבוביות יחידה מפוזר על פני מעטפת התא. ההתגבשות של תאית מיקרופיברילות מתרחשת במרחב התאי עם הקמתה של גיליונות שרשרת גלוקן ידי מליטה ואן דר ואלס ואחריו לערום של הסדינים על ידי H-מליטת 1.
מַגנֵטחלקיקים ic משולב למטריצה BNC ניתן להשפיע בקלות על ידי שדה מגנטי חיצוני על מנת להגדיל את הכוח הדרוש כדי לכוון ולרכז תאי שריר חלק (SMCs) המכיל חלקיקים מגנטיים, באתר פגום של דופן העורק. אסטרטגיה זו שומרת על SMCs משם מרקמות אחרות, ומחזיק את התאים במקום נגד הכוח המופעל על ידי זרימת הדם. הוכח כי SMCs ממלאים תפקיד חשוב vasoelasticity של כלי הדם, שם הם יוצרים שכבות בשפע הממוקמים ברובם באזורי Tunica התקשורת 2.
השיטה לסינתזה של MBNC כרוך קרומית BNC שקוע ובחש בתמיסה של ברזל (III) כלוריד hexahydrate וברזל (II) כלוריד tetrahydrate על 80 מעלות צלזיוס. אמוניום הידרוקסיד מתווסף ליצור חלקיקי תחמוצת ברזל בתוך רשת BNC. התוספת של אמוניום הידרוקסיד משנה את הצבע של הפתרון מכתום לשחור. קומפקטית IONPs יחד לאורך ליפון BNCים עם חלוקה לא אחידה.
פרוטוקול זה מתמקד בעיצוב של קרומי nanoparticle ננוצלולוז-מגנטי בקטריאלי, אשר יש לנו בשם ננוצלולוז חיידקי מגנטי (MBNC), אשר נועד לשימוש כתחליף כלי דם קטן בקוטר חסר, פגום או פצוע. HS בארוד ועמיתים לעבודה פרסמו לאחרונה עבודה דומה כדי לייצר נייר מגנטי גמיש מבוסס BNC ידי ערבוב pellicles BNC בתוך פיזור מימי יציב של PEG ו -3 חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי. כאן, אנו מתארים את הייצור של תאית חיידקי הספגה שלה באתרו עם חלקיקים מגנטיים. Assay cytotoxicity מבוסס על זיהוי של הפסקות גדיל בודד DNA שימש כדי לבדוק את biocompatibility של pellicles BNC ו MBNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת בקטריאלי ננוצלולוז (BNC)
הערה: כל השלבים מבוצעים בתנאים aseptic, אלא אם צוין אחרת.
- כן בינוני התרבות.
- הכן 500 מ"ל של מדיום תרבות נוזלי על ידי שילוב של 25 גרם תמצית שמרים, 15 גרם של peptone, 125.0 גרם של מניטול, ו -500 מ"ל מים טוהר גבוהה. חיטוי את התערובת על 120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ולאחסן ב 4 ° C..
- כן 100 מיליליטר של תקשורת המוצקה למחצה על ידי הוספת 15 גרם של אגר 5.0 גרם של תמצית שמרים, 3.0 גרם של peptone, 25.0 גרם של מניטול, ו -100 מיליליטר מים טוהרים גבוהים. חיטוי את התערובת ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר autoclaved, הפקדה 5 מ"ל של תערובת בצלחת פטרי פלסטיק 90 מ"מ x 16 מ"מ. אפשר הפתרון הג'ל על 4 מעלות צלזיוס ולאחסן בטמפרטורה זה עד לשימוש נוסף.
- רעננותם G. xylinus זן נשמר בקבוקונים מיובשים בהקפאה ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום תרבות הנוזל pipetting למעלהלמטה, כפי שצוין על ידי בהוראות היצרן.
- לחסן צלחות פטרי המכילות מדיה מוצקה למחצה עם טיפות קטנות של השעית חיידקים באמצעות לולאת inoculating. ודא כי הבידוד מכסה את צלחת פטרי כולו על ידי הזזת הלולאה בכיוון זיג זג מהקצה אל מרכז הצלחת.
- דגירת צלחות פטרי ב 26 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות באינקובטור ללא CO 2. לאחר תקופת הדגירה תושלם, מושבות לבנות קטנות גלויות. אם המושבות אינם משמשים מיד, לאחסן את צלחות פטרי ב 4 ° C על ידי איטום המכסה עם Parafilm והצבת המנות במהופך. המושבות ניתן לאחסן ככה עד 6 חודשים.
- העברה 2 מיליליטר של מדיום התרבות הנוזלי מוכנים בשלב (1.1.1) לבאר כל צלחת בתרבית רקמה 24 גם. קח שתי מושבות עם מחט ייחסה מן צלחות פטרי המחוסנות בשלב (1.3) ולהכניס אותם לתוך הבאר הראשונה של הצלחת בתרבית הרקמה. REPEAT אותו נוהל עבור 23 הבארות הנותרות.
- דגירת הצלחת בתרבית רקמה על 30 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. זו תניב סך של 24 BNC pellicles עם קוטר של 16 מ"מ בעובי של כ 2-3 מ"מ קוטר כמתואר באיור 1.
הערה: נא לא להפריע את תרבית חיידקים בכל שלב במהלך תקופת דגירה, למשל על ידי טלטול הצלחות. במהלך תקופת הדגירה, G. xylinus extrudes מולקולות סוכר glucopyranose להקים רשת גבישי פולימריים בממשק נוזל-האוויר, אשר מאמץ את הצורה וגודל של הבקבוק בתנאי טיפוח סטטי. מטריקס פולימריים זה, המכונה ננוצלולוז בקטריאלי (BNC), בולט בסוף תקופת הדגירה. - אסוף את pellicles BNC מהתקשורת צמיחה לעקר אותם 200 מ"ל של תמיסת 1% NaOH עבור שעה 1 ב 50 מעלות צלזיוס, כדי להסיר כל עקבות של ג ' xylinus. לחלופין, מערבבים את הפתרון הזה ב 300 סל"ד באמצעות פס מגנטיוצלחת בחישה. מחק את פתרון NaOH ולהוסיף 200 מיליליטר של תמיסה מוכנה טרי 1% NaOH. חזור על אותו התהליך שוב או עד pellicles BNC בתמיסה רוכש מראה שקוף.
- שוטפים את pellicles BNC עם מים שלוש פעמים ולאחסן אותם במים טוהר גבוה ב RT. ודא pellicles BNC שקוע לגמרי במים ואינם להתייבש בכל עת.
- חיטוי pellicles BNC ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
הערה: מחקר תת עורית in vivo בחולדה בביצוע Märtson ועמיתים לעבודה הראה סימנים שאינם שפל של BNC לאחר השתלת 60 שבועות. ואכן, BNC הוא מתכלה בטבע על ידי אנזימים מיקרוביאליים פטרייתי, אשר נעדרים אצל יונקים. מצד שני, פריקות ביולוגית של BNC יכול להיות תוצאה של מכני, כימי, תהליכים ביולוגיים להחליש את רשת מיקרופיברילות in vivo 4.
2. סינתזה של פולימרים מצופיםתחמוצת ברזל חלקיקי ההפקדה שלה בתוך ממברנה בקטריאלי ננוצלולוז
- בועה 1,000 מיליליטר מים טוהרים גבוהים עם גז חנקן על מנת להסיר כל חמצן מומס במים ולהחליף אותו עם חנקן.
- השתמש בבקבוק עגול התחתונה שלושה הצוואר להכין פתרון של 2: יחס טוחנת 1 של ברזל (III) כלוריד hexahydrate (FeCl 3 · 6H 2 O) וברזל (II) כלוריד tetrahydrate (FeCl 2 · 4H 2 O) מדולל עם מים טוהר גבוהה deoxygenated. לדוגמה, השתמש 5.4 גרם של FeCl 3 · 6H 2 O ו 1.98 גרם של FeCl 2 · 4H 2 O ב 10 מ"ל מים טוהר גבוהה deoxygenated. אם בתכשיר מסתובב במהירות נמוכה מדי צמיגה וקשה לבחוש, השתמש 0.54 גרם של FeCl 3 · 6H 2 O ו 0.198 גרם של FeCl 2 · 4H 2 O ב 20 מ"ל מים טוהר גבוהה deoxygenated.
הערה: להפחית את זמן החשיפה של 4H FeCl 2 · 2 O לאוויר בשקילה ch זהמתחם emical מהר ככל האפשר. לאחר הצגתי את הבקבוק התחתי עגול שלושת צוואר, לסגור את הבקבוק תלת צוואר עגול תחתון עם פקקים מחצו עד שהיא מחוברת לאספקת גז חנקן צינור הקבל. - השתמש בשני צווארם של הכלי לספק כניסה ופלט מתמדת של גז חנקן על ידי חיבור אספקת גז החנקן כדי מחט אגרוף פקק המחץ והקבוע אל הצוואר של כלי השיט.
- מקום 1 קרומי BNC שהוכן קודם לכן בשלב 1.5 (15.6 מ"מ של בקוטר 2-3 מ"מ עובי) בתוך הכלי עם המגיבים. ודא המדגם הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל.
- חברו את הצוואר הנותר של כלי לצינור הקבל. בנוסף, להשתמש בצינור ייבוש מלא סידן גופרתי נטול מים על החלק העליון של צינור הקבל. למים לזרום דרך צינור הקבל.
- חותם את כל מפרקי הזכוכית עם גריז ואקום.
- מחממים את הפתרון באמבט שמן סיליקון עד 80 מעלות צלזיוס באמצעות ערבובפלטה חשמלית וחזק טמפרטורה זו עד שלב 2.10. השתמש בר ומערבבים מגנטי קטן לערבב המגיבים ב 350 סל"ד במשך 5 דקות. ודא BNC היא ספוגה כראוי עם פתרון ברזלי שהמגיבים נמס לגמרי. לבחוש את התערובת עד סוף הניסוי.
הערה: לנצל מדחום כדי לאמת את טמפרטורת שמן סיליקון. זה צריך להיות יציב עד 80 מעלות צלזיוס. - להגדיל את מהירות בחישה עד 700 סל"ד ולהוסיף (על ידי הטלת), במרווח זמן של 5 דקות, 5 מ"ל של אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH, 14%) על 10 מ"ל של תמיסת ברזל באמצעות מחט pipetting, אשר כבר גם אגרוף פקק מחץ. לאחר תוספת של אמוניום הידרוקסיד, הצבע של הפתרון משתנה מצהוב / כתום לשחור.
- המשך ערבוב הפתרון על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות אחרות. הימנע התעוררות במהירות גבוהה כדי לשמור על שלמות המדגם. במהירויות גבוהות, כלומר, גבוה יותר מ -1,000 סל"ד, יכול להרוסהדוגמה.
- מנמיכים את הטמפרטורה של הפתרון 30 ° C באמצעות בתחתית בקרת טמפרטורה של פלטה חשמלית ערבוב ולשמור ערבוב במשך 5 דקות אחר. לאחר מכן, כבה את הכיריים. בשלב זה, IONP שולב רשת BNC.
- מצננים את התערובת עד RT ולהפריד חלקיקים מגנטיים (MNP) ו BNC באמצעות מגנט קבוע חזק (למשל, 1 טסלה). לשם כך, ולהעביר את התערובת בבקבוק כלי ולאחר מכן, תוך שמירה על מגנט קרוב כלי, להחזיק את MNPs ואת BNC במקום בעת decanting supernatant.
הערה: היזהר במהלך הטיפול בו מגנטים חזקים שכן הם יכולים להזיק בשימוש לא נכון. לקבלת שלבים (2.12) - (2.14) ו (2.16) להשתמש במים טוהר גבוהה deoxygenated הכין בעבר ב (2.1) כדי למנוע חלקיקים מפני התחמצנות. - Resuspend את MNPs ו BNC ב מ"ל מים 100. נער בעדינות את הפתרון כדי להסיר את כל MNPs שאינם משולבים חזק לתוך BNC. למזוג היםupernatant שוב על ידי לחיצה על MNPs ואת BNC במקום באמצעות מגנט.
- שטפו את MNPs ואת פעמים BNC כמה עם מים עד supernatant מגיע pH נייטרלי (pH ~ 7), כפי שהיא נמדדת על ידי רצועת colorimetric.
- הפרד את ננוצלולוז חיידקי המגנטי פונקציונלי BNC או מגנטי (MBNC) מן MNPs באמצעות פינצטה ולשטוף את MBNC מספר פעמים עם מים עד שהמים פועלים ברורים.
- לעקר את MBNC ידי חשיפת MBNC O / N כדי UV (110-280 ננומטר).
- 500 מ"ל החיטוי של מים טוהר גבוהה deoxygenated ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולאחסן את MBNC ב 20 מ"ל של מים זה.
- בסביבה נקייה מחיידקים, לטבול את המדגם ב 1% של PEG ומערבבים עבור שעה 2 ב RT (37 מעלות צלזיוס). הליך זה משפר את biocompatibility ויציבות של חלקיקי תחמוצת ברזל שהופקדו BNC, אלו שנחשפו במיוחד על פני השטח 5-7. ציפוי PEG יופץ דרך רשת 3D MBNC.
הערה: עירום IONP הם מתחמצנים בקלות באווירבגלל הפעילות הכימית הגבוהה שלהם 8. למרות PEG נחשב חומר שאינו מתכלה, היציבות הכימית שלה תלוי תנאים ביולוגיים מיושמים כגון תכולת מים, pH, טמפרטורה, נוכחות של אנזימים, מיני חמצן תגובתי, מיני חנקן תגובתי, ואחרים 9.
אפיון 3. Pellicles BNC ו MBNC
- תכונות מכאניות
- בצע העמסה רגילה ולבדוק פריקה nanoindentation באמצעות indenter ברקוביץ. רדיוס indenter היהלומים ברקוביץ הוא 20 ננומטר.
- השתמש סיליקה טונגסטן התמזגה לכייל שטח מגע כפונקציה של עומק הזחה ב RT. במהלך הבדיקה, הר הדגימות על הכניסה באמצעות דבק. Indenter ניגש הדגימות בכיוון העובי שלו.
- אקראי במקומות כניסה בחרו על משטחי דגימות. שמור את המרווח בין 2 כניסות בין 200-300 מ"מ.
- החל את העומס אלדגימות בצעדים ולהקליט את העקירה המקבילה indenter. לנתח את העלילה של עומס לעומת עומק כדי למצוא את מודול יאנג.
- לבצע את הבדיקה nanoindentation של דגימות בנוכחות מים ללא יונים (מים DI), ולבדוק ידי החלת שיעורי העומס בין 0.0001 MN / sec ו 0.005 MN / sec, עם עומס שיא בין 0.01 Mn ו 0.60 Mn.
- השתמש נוזל תא ולשמור דגימות תחת הסביבה הנוזלת. התקנה ייחודית זו לאפיון nanomechanical השקוע בסביבת נוזל אידיאלית כדי לדמות את הפונקציונליות ידם ביומכנית ביעילות של ממברנות BNC ו MBNC.
- אפיון מבני ידי SEM
- לאפיין את מבנה סיבי ננוצלולוז ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).
- Lyophilize הדגימות למשך 24 שעות ב -80 מעלות צלזיוס. ואז לעלות על חתיכי SEM, גמגום עם סרט Au-PD במשך 10 שניות ולנתח באמצעות SEM.
- לוקח תמונות בהגדלה של 22,000Xו 60,000X, עם מתח אץ של 5 קילו וולט.
- תחומים מגנטיים
- אפשר pellicles MBNC להתייבש לחלוטין ב RT, ולאחר מכן לחשוף למשך 5 דקות כדי מגנט קבוע (1 טסלה).
- מייד, לבצע את מדידות כוח המגנטיות באמצעות ביו-AFM על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לכל מדידה, ללכוד הראשון תכונות הטופוגרפיה לרכוש את התחומים המגנטיים במהלך קריאה שנייה. השג שתי המדידות עם ביו-AFM במצב ללא מגע.
- אפיון מגנטי של החלקיקים מתנהל באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM) במערכת מדידות קניין הפיזי (PPMS) של Quantum Design, ב RT (300 K), עם שדה מגנטי בטווח של -10,000 ל -10,000 OE.
- Cytocompatibility
- זרע אנושי אבי העורקים לתאי שריר חלק (HASMC) בצלחת בתרבית רקמה 6 גם בצפיפות של 1.0x10
- השתמש אוכלוסיות של תאים שטופלו מי שלא טופלו ומימן כפקדים שליליים וחיוביים, בהתאמה.
- בצע את assay השביט על פי הפרוטוקולים של היצרן ואת ההנחיות שהוצעו על ידי א Azqueta & AR קולינס 10.
- השתמש זהב SYBR צבען חומצות גרעין ב assay זה כדי intercalate ו fluorescently תווית ה- DNA הכלול דגימות electrophoresed על פי פרוטוקול של היצרן.
הערה: תאים שאינם עוברים כל ניזק לדנ"א בנוכחות דגימות BNC ו MBNC, יציג נוקלאואיד ירוק עגול ניאון, ואילו תאים פגומים DNA יהיו שביטים ארוכים - דגימות חיוביות תהיינה nucleoids (ראש השביט) ואחריו זנבות אשר מכילים חומר ה- DNA מקוטעת (אחוז DNA בזנב).
- זרע אנושי אבי העורקים לתאי שריר חלק (HASMC) בצלחת בתרבית רקמה 6 גם בצפיפות של 1.0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תקופת הדגירה של G. xylinus היה סך של 9 ימים, אבל pellicles החלה להיווצר מוקדם ניכרו לאחר כ 2 ימים. המראה מקרוסקופית של BNC מוצג באיור 1, בצורה אשר מחק כי התרבות צלחת מבוגר. איור 2 מתארת את התהליך להפקת pellicles BNC-IONP, אשר סיכומי השלבים העיקריים המעורבים בפרוטוקול לעיל וכן התצורה של המרכיבים העיקריים.
תמונות SEM שימשו כדי לפתור את מיקרו, מורפולוגיה, הפריסה המרחבית של הסיבים של BNC (איור 3) והפצה IONP ב פונקציונליות BNC (איור 4). BNC נוצר על ידי סרטים בסדר (כ 50 ננומטר בקוטר) היוצרות נקבוביות פתוחות בכל הרשת ללא דפוס מוגדר. IONP הם מעדיפים located בין הנקבוביות שהוקמו על ידי שילוב תוכן סיבי, ויצרו אשכולות של 100 ננומטר או יותר בגודלם. גם הפרט IONP נכרכים לאורך והסרטים. MBNC מפגין מבנה סיבי דחוס פחות בהשוואת BNC, כנראה בגלל IONP להפגיש את הסרטים של BNC. מיקרוסקופ כוח מגנטי שמש לשחזר את הפרופיל המגנטי על ידי הטופוגרפיה של MBNC (איור 5 א ', ב'). נקבוביות גדולות בקוטר 500 ננומטר או גדול נוצרות MBNC, אשר לא נצפו מטופל BNC (איור 5 א). זה עולה בקנה אחד עם התצפיות microphotographs SEM, שבו MBNC מציג מבנה נקבובי יותר BNC ללא שינוי. שיפוע כוח מגנטי עם שני תחומים של המגנטיזציה שונה זוהה על פני שטח MBNC (איור 5), בניגוד אשר אינו תואמים עם הגבעות ועמקים יצרו לפי אזורי IONP העשירים בתמונות טופוגרפיות MBNC (איור 5 א). inte גבוה וחלששדות מגנטיים nsity מצוינים כ- צהוב וירוק איור 5 ב בהתאמה. לולאת היסטרזיס של חלקיקים, אשר נמדד מוטבע ננוצלולוז בקטריאלי, מוצג באיור 5 מתן עדות שכל IONPs היו פאראמגנטי ב RT, ללא היסטרזיס.
HASMC היו בתרבית בנוכחות BNC ושל MBNC לבדוק עבור כל השפעה מזיקה על יכולת הקיום של תאים בודדים כתוצאה מחשיפה לחומרים זרים אלה. היקף הפגיעה בתאים בודדים היה לכמת על ידי זיהוי של הפסקות גדיל DNA (איור 6). התוצאות הושוו HASMC גדלו בתנאי culturing הנורמלים של 37 ° C, 95% אוויר, ו -5% CO 2 (שליטה שלילית) וכדי HASMC עם עקה גנטוקסית מי-induced מימן (100 מיקרומטר H 2 O 2) למשך 30 דקות ( בקרה חיובית). השוואות לזווג באמצעות מבחן t הראו האת ההשפעות של MBNC על כדאיות התא היו שונות מהותית מאלו המושרה עם טיפול חמצן על HASMC (עמ -Value <0.001, ***).
איור 1. היבטים מקרוסקופית של ננוצלולוז חיידקים. Pellicles BNC התקבל לאחר תקופת הדגירה של 11 יום, שהם כ. 3 מ"מ עובי. תקופת הדגירה תלויה בדרישות עבור השימוש המיועד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. המצאה של ננוצלולוז חיידקים הפונקציונלי מגנטי. חלקיקי תחמוצת ברזל מורכבים ואני ncorporated באתרם בתוך BNC, מניב MBNC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונת איור 3. SEM של BNC. BNC מציגה רשת דקה וסרטים שאינם מצטבר עם בגדלים של 50 ננומטר ומטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תמונת SEM של קרומי BNC-IONP. חלקיקי תחמוצת ברזל (IONP) ממוקמים מועדף בין סרטי השזירה.ד / 52,951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טופוגרפית AFM איור 5. MBNC ומבני תחום מגנטיים. (א) טופוגרפית משטח של MBNC מראה כתמים של חלקיקים ארוזים מן המעלה הראשונה, לעמוד מעל מבנה nanofibril. (ב) תחומים צהובים וירוקים לציין שני אזורים של המגנטיזציה שונה של שדה מגנטי בעצמה גבוהה וחלש בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. היקף הנזק לדנ"א HASMC לאחר חשיפהכדי BNC, ו MBNC בהתאמה. PosCtl מציין HASMC שעברו טיפול חמצן להשוואה. NegCtl מציין HASMC גדל בתנאי culturing נורמלים. ההשלכות השליליות של כדאיות MBNC על HASMC היו שונות באופן משמעותי מאלה שנצפו PosCtl (p-value <0.001, ***). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העובי והגודל של קרומי BNC ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי זמן דגירה ואת הגודל של הבקבוק שבו הוא גדל במהלך טיפוח סטטי. Microproperties של BNC, כגון נקבוביות, ניתן לשנות על ידי שינוי יחס חמצן בתרבות סטטי. ריכוזי חמצן גבוהים יותר מניבות קשים BNC 11. א בודן ועמיתים לעבודה מיוצרים צינורות של BNC עם לחץ פרץ עד 880 מ"מ כספית על ידי שינוי יחס חמצן חמצן אטמוספרי כדי 100% חמצן במהלך תהליך התסיסה של G. xylinus 12. באופן דומה, הנקבובי של BNC יכול גם להיות מוצג על ידי שילוב porogens כגון microspheres שעוות פרפין לתוך תהליך התסיסה. הגומלין הנקבובי הנקבובי וכתוצאה מכך במקרה זה יהיה תלוי בגודל porogen 13.
הרשת הנקבובית של BNC מאפשרת להם להיות פונקציונלית עם חלקיקים, למשל, עבור משלוח סמיםסוכנים. במחקר שלנו, יש לנו פונקציונליות BNC עם IONP ידי סינתזה וצומחים באתרו החלקיקים לתוך הממברנה BNC, על מנת ליישם פרוטוקול מגנטי לגיוס תא מהיר והתקשרות בפיגומים מבוססים BNC. בדיקות nanomechanical עולות כי תגובה ננומטריים של BNC מתנהגת באופן דומה עם כלי דם 14 עם מודול נמוך מאוד צעיר, E BNC = 0.0025-GPA בתוך הדגימות 0.04-GPA על פני השטח. הערכים המתקבלים הם בטווח עם אלו שנצפו על ידי פו et al. 15.
עודף IONP ניתן להסירו בקלות מן BNC עקב נקבוביות גבוהה של החומר. תמונות SEM הראו כי החלקיקים מופצים בעיקר בחללים נוצרו על ידי שילוב תוכן ליפון והתפזרו לאורך הסרטים. הריכוז של מיני הברזל בשימוש בפרוטוקול זה גבוה הניב ארוז בצפיפות IONP שאחד את הסרטים של BNC. זה הביאMBNC עם נקבוביות גדולות יותר מאלה של BNC ללא שינוי. אולסון et al., שהשתמשו ריכוזים שונים של FeSO 4 / CoCl 2 מלחים עם אותו שבר נפח של BNC בסינתזה של aerogels תאית nanofibril, דיווחה על עלייה דומה נקבוביות BNC כששינו את החלק היחסי בנפח של פרית קובלט פרומגנטי חלקיקים מ -0.7% ל -5.7% 16. נקבובית גבוהה זו של MBNC יכול להיות יתרון להפקדה של תרופות אשר מזרזות את זמן ההחלמה ולמנוע restenosis ב דפנות עורקים פגועים.
חוסר קורלציה בין הטופוגרפיים ותמונות שלב מגנטיים גם תאריו של ב Torre et al. 17, שהצביע על התלות בין הטופוגרפיה ואת האותות המגנטיים של סרטי nanoparticle דלילים. מחקרי אפיון נוספים צריכים להתנהל על מנת לקבוע את היסטרזיס המגנטיזציה (MH) לולאות של MBNC באמצעות סאי SQUID-VSMהגבעולים.
MBNC הראה פוטנציאל נמוך השפעות רעילות, בהתאם לתוצאות שנצפו Assay שביט, המציין כי חומר זה הוא ביולוגי לשימוש במגע עם תאים.
השלבים הקריטיים ביותר בהליך קשורים בסך של אמוניום הידרוקסיד ואת המהירות שבה הוא הוסיף, כמו גם הבטיח טבילה המלאה ערבוב של BNC בתמיסה במהלך התגובה. ההיבט הראשון קובע את הגודל של חלקיקי תחמוצת ברזל וכתוצאה מכך, ואילו השני להשפיע כיצד חלקיקים מופצים ברחבי המטריצה BNC. כדי לשלוט על גודל טוב יותר של MNPs, ביורטה עם ברזלים יכול לשמש כדי לווסת תוספת על ידי הטלת אמוניום הידרוקסיד לתוך התגובה. חתיכות קטנות של BNC שניתן שקוע לחלוטין בתוך הפתרון מומלצות, למשל, בגדלים של כ 1.9 סנטימטר 2 עבור בנפח כולל של 10 מיליליטר של תמיסה. limi אחתשינוע של טכניקה זו היא חלוקת הומוגניות של IONP בתוך רשת BNC.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב חלקיקי תחמוצת ברזל BNC לגבש מרוכבים. בגלל biocompatibility ואת התכונות הפיסיקליות ומכאניות של שני BNC ואת חלקיקי תחמוצת הברזל, MBNC ניתן להשתמש במגוון של יישומים ביו כגון מערכות אספקת סמים ופיגומים לצמיחה הסלולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al. Biocellulose-based flexible magnetic paper. J. Appl. Phys. 117, (2015).
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
