Abstract
I denne studien er bakteriell nanocellulose (BNC) produsert av bakterier Gluconacetobacter xylinus syntetisert og impregnert in situ med jernoksid nanopartikler (IONP) (Fe 3 O 4) for å gi en magnetisk bakteriell nanocellulose (MBNC). Syntesen av MBNC er en presis og spesielt utformet flertrinns-prosess. Kort, bakteriell nanocellulose (BNC) pellicles er dannet fra bevart G. xylinus belastning i henhold til våre forsøks kravene til størrelse og morfologi. En oppløsning av jern (III) kloridheksahydrat (FeCl3 · 6H 2 O) og jern (II) kloridtetrahydrat (FeCl ^ 2 · 4H to O) med et 2: 1 molforhold ble fremstilt og fortynnet i deoksygenert vann av høy renhet. En BNC pellicle blir deretter innført i beholderen med reaktantene. Denne blandingen ble omrørt og oppvarmet ved 80 ° C i en silisium oljebad og ammoniumhydroksyd (14%) tilsettes deretter ved å slippe å utfellejernholdige ioner i BNC mesh. Det siste trinnet kan danne in situ magnetitt nanopartikler (Fe 3 O 4) inne i bakterie nanocellulose mesh for å gi magnetiske egenskaper til BNC hinne. En toksikologisk analyse ble brukt for å evaluere biokompatibilitet av BNC-IONP hinne. Polyetylenglykol (PEG) ble brukt til å dekke IONPs for å forbedre deres biokompatibilitet. Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilder viste at IONP ble plassert fortrinnsvis i fibril interlacing områder av BNC matrise, men noen av dem ble også funnet langs BNC bånd. Magnetiske kraft mikroskop målinger utført på MBNC registrert tilstedeværelsen magnetiske domener med høy og svak intensitet magnetfelt, noe som bekrefter den magnetiske naturen av MBNC hinne. Youngs modul-verdier som oppnås i dette arbeidet er også i en rimelig overensstemmelse med de som er rapportert i flere blodårer i tidligere studier.
Introduction
Den bacterian nanocellulose (BNC) blir syntetisert ved hjelp av Acetobacter xylinum belastning, også kjent som Gluconacetobacter xylinus, og deponeres i form av filmer eller pellicles på luft-væske-grensesnittet under stasjonær kultur. Disse BNC pellicles innta formen av beholderen hvor de er dyrket, og deres tykkelse er avhengig av antall dager i kultur. A. xylinus bruker glukose i mediet for syntesen av cellulose mikrofibrillene gjennom en prosess for polymerisasjon og etterfølgende krystallisasjon. Polymerisasjonen av glukoserester blir utført ved bakteriell ekstracellulære membran hvor glukan kjedene er ekstrudert fra enkle porer fordelt over celleveggen. Krystalliseringen av cellulose mikrofibrillene forekommer i det ekstracellulære rom med dannelse av glukan kjede ark av van der Waals binding, fulgt av stabling av arkene av H-binding 1.
Magnetic nanopartikler integrert til en BNC matrise kan manipuleres lett av et eksternt magnetisk felt for å øke den kraft som er nødvendig for å styre og begrense glatte muskelceller (SMC) inneholdende magnetiske nanopartikler, på det skadede stedet av arterieveggen. Denne strategien holder SMC bort fra andre vev, og holder cellene på plass mot den kraft som utøves av blodstrømmen. Det har vist seg at SMC spiller en viktig rolle i den vasoelasticity av blodkaret, hvor de danner rikelig lag ligger hovedsakelig i tunica media to.
Den som brukes for syntese av MBNC metode involverer BNC hinne nedsenket og omrørt i en oppløsning av jern (III) kloridheksahydrat og jern (II) kloridtetrahydrat ved 80 ° C. Ammoniumhydroksid blir tilsatt for å danne jernoksid nanopartikler inne i BNC mesh. Tilsetningen av ammoniumhydroksyd endrer fargen på løsningen fra orange til sort. Den IONPs kompakt sammen langs BNC fibrils med en ikke-uniform fordeling.
Denne protokollen fokuserer på design av en bakteriell nanocellulose-magnetiske nanopartikler pellicle, som vi har kalt magnetisk bakteriell nanocellulose (MBNC), som er ment å brukes som en erstatning for manglende, ødelagte eller skadde liten diameter blodkar. HS Barud og medarbeidere har nylig publisert en lignende arbeid for å produsere en BNC-basert fleksibel magnetisk papir ved å blande BNC pellicles i en stabil vandig dispersjon av PEG og superparamagnetiske jernoksid nanopartikler 3. Her beskriver vi produksjon av bakteriell cellulose og dens impregnering in situ med magnetiske nanopartikler. En cytotoksisitet analyse basert på påvisning av single DNA trådbrudd ble brukt til å teste biokompatibilitet av BNC og MBNC pellicles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Bakteriell Nanocellulose (BNC)
Merk: Alle trinnene er utført under aseptiske forhold, med mindre annet er angitt.
- Forbered dyrkingsmedium.
- Fremstille 500 ml flytende kulturmedium ved å kombinere 25 g gjærekstrakt, 15 g pepton, 125,0 g mannitol og 500 ml vann av høy renhet. Autoklav denne blandingen ved 120 ° C i 20 min og oppbevares ved 4 ° C.
- Fremstille 100 ml halvfaste medier ved å tilsette 15 g agar til 5,0 g gjærekstrakt, 3,0 g pepton, 25,0 g mannitol og 100 ml vann av høy renhet. Autoklav denne blanding ved 120 ° C i 20 min. Når autoklavert, innskudd 5 ml av blandingen i en 90 mm x 16 mm petriskål av plast. La oppløsningen gel ved 4 ° C og oppbevares ved denne temperatur inntil videre anvendelse.
- Rehydrere G. xylinus belastning bevart i frysetørkede ampuller ved å tilsette 1 ml av flytende kulturmedium og pipettering opp ogned, som indikert av produsentens instruksjoner.
- Inokulere petriskålene inneholdende halvfaste medier med små dråper av bakteriesuspensjonen ved hjelp av en inoculating sløyfe. Kontroller at pode dekker hele petriskål ved å bevege sløyfe i en sikk sakk retning fra kanten til midten av fatet.
- Inkuber petriskåler ved 26 ° C i 72 timer i en inkubator uten CO2. Når inkubasjonstiden er fullført, små hvite kolonier er synlige. Hvis koloniene ikke umiddelbart brukes, lagre petriskåler ved 4 ° C ved å forsegle lokket med Parafilm og plassere retter opp ned. Koloniene kan lagres på denne måte i opptil 6 måneder.
- Overføring 2 ml av den flytende kulturmedium fremstilt i trinn (1.1.1) i hver brønn av en 24-brønns vevskulturplate. Ta to kolonier med en inoculating nål fra inokulert petriskåler i trinn (1,3) og plassere dem i den første brønnen i vevet kultur plate. REPEAT samme prosedyre for de resterende 23 brønner.
- Inkuber vevskulturskål ved 30 ° C i 7 dager. Dette vil gi et totalt 24 BNC pellicles med diameter på 16 mm og en tykkelse på omtrent 2-3 mm diameter som vist i figur 1.
Merk: Ikke forstyrr bakteriekultur på noe tidspunkt i løpet av inkubasjonstiden, for eksempel ved å riste platene. Under inkubasjonsperioden, G. xylinus ekstruderer glukopyranoseenheter sukkermolekyler for å danne et polymert krystallinsk mesh i luft-væske-grensesnittet, som treffer formen og størrelsen av kolben under statiske dyrkingsbetingelser. Dette polymere matriks, kjent som bakteriell nanocellulose (BNC), er iøynefallende ved slutten av inkubasjonsperioden. - Samle BNC pellicles fra vekstmedier og sterilisere dem i 200 ml 1% NaOH-oppløsning i 1 time ved 50 ° C, for å fjerne alle spor av G. xylinus. Eventuelt omrør denne løsningen ved 300 rpm ved anvendelse av en magnetstavog en gripende plate. Kast NaOH løsning og tilsett 200 ml nylaget 1% NaOH-løsning. Gjenta den samme prosessen en gang til eller til BNC pellicles i løsningen får en gjennomsiktig utseende.
- Skyll BNC pellicles med vann tre ganger og lagre dem i høy renhet vann ved RT. Kontroller at BNC pellicles er helt nedsenket i vannet og får ikke lov til å tørke når som helst.
- Autoklav BNC pellicles ved 121 ° C i 20 min.
Merk: En in vivo subkutan studie i rotte utført av Märtson og kolleger viste non-degraderings tegn på BNC etter 60 uker implantasjon. Faktisk er BNC er nedbrytbare i naturen av mikrobielle og fungale enzymer, som er fraværende i pattedyr. På den annen side kan den biologiske nedbrytbarhet av BNC være et resultat av mekaniske, kjemiske og biologiske prosesser som svekker microfibril nettverket in vivo 4.
2. Syntese av Polymer-belagtIron Oxide Nanopartikler og dens Nedfall i en bakteriell Nanocellulose Membran
- Bubble 1000 ml med høy renhet vann med nitrogengass for å fjerne oppløst oksygen i vannet og erstatte den med nitrogen.
- Bruke en tre-halset rundbunnet kolbe for å fremstille en oppløsning i et 2: 1 molart forhold av jern (III) kloridheksahydrat (FeCl3 · 6H 2 O) og jern (II) kloridtetrahydrat (FeCl ^ 2 · 4H to O) fortynnet med deoksygenert vann av høy renhet. For eksempel bruke 5,4 g FeCl3 · 6H 2 O og 1,98 g FeCl ^ 2 · 4H 2 O i 10 ml deoksygenert høy renhet vann. Hvis dette preparat fikk for viskøs og vanskelig å omrøre, bruke 0,54 g FeCl3 · 6H 2 O og 0,198 g FeCl ^ 2 · 4H to O i 20 ml deoksygenert vann av høy renhet.
Merk: Reduser eksponeringstid FeCl ^ 2 · 4H 2 O til luft ved å veie dette chemical sammensatte så fort som mulig. Når innført i den tre-halset, rundbunnet kolbe, lukker den tre-halset rundkolbe med septum stoppere inntil den er koblet til den nitrogengasstilførselen og kondensatoren røret. - Bruk to halser av fartøyet for å tilveiebringe en konstant inngang og utgang av nitrogengass ved å forbinde den nitrogengasstilførselen til en nålestukket i en septum propp og festet til fartøyets halsen.
- Plassere en BNC hinne som ble fremstilt tidligere i trinn 1,5 (15,6 mm i diameter og 2-3 mm tykkelse) i beholderen med reaktantene. Sørg for at prøven er helt nedsenket i væsken.
- Koble den gjenværende halsen av beholderen til en kondensator rør. I tillegg bruker et tørkerør fylt med vannfritt kalsiumsulfat på toppen av kondensatoren røret. Kjør vann gjennom kondensatoren tube.
- Tett alle glass leddene med vakuum fett.
- Varm løsningen i en silikon oljebad til 80 ° C ved hjelp av et rørekokeplate og holde denne temperaturen inntil trinnet 2.10. Bruke en liten magnetisk rørestav for å blande reaktantene ved 350 rpm i 5 min. Sørge for at BNC er hensiktsmessig impregnert med den jernholdige oppløsningen og reaktantene er fullstendig oppløst. Rør blandingen inntil slutten av forsøket.
Merk: Benytte et termometer for å kontrollere temperaturen i silikonolje. Den bør være stabil til 80 ° C. - Øke rørehastigheten til 700 opm og tilsett (ved å slippe), i et tidsintervall på 5 minutter ble 5 ml ammoniumhydroksyd (NH4OH, 14%) til 10 ml av jernholdig oppløsning ved hjelp av en pipettenål, som har vært også slått i en septum stopperen. Etter tilsetning av ammoniumhydroksyd, fargen på oppløsningen endres fra gul / orange til sort.
- Fortsett omrøring av oppløsningen ved 80 ° C i ytterligere 5 min. Unngå høyhastighets tilløp for å opprettholde integriteten av prøven. Høye hastigheter, dvs. høyere enn 1000 rpm, kan ødeleggeprøven.
- Senk temperaturen av løsningen til 30 ° C ved bruk av temperaturkontroll bunnen av røreplaten og holde omrøring i ytterligere 5 min. Deretter slår du av kokeplaten. På dette punktet, er det IONP blitt innlemmet i BNC mesh.
- Avkjøl blandingen ned til RT og skille de magnetiske nanopartikler (MNP) og BNC ved hjelp av en sterk permanent magnet (f.eks en Tesla). For å gjøre dette, overføre blandingen til et fartøy kolbe og da, mens du holder magneten nær fartøyet, hold MNPS og BNC på plass mens dekantering supernatanten.
Merk: Vær forsiktig når du håndterer sterke magneter, siden de kan være skadelig når det brukes feil. For trinn (2.12) - (2.14) og (2.16) bruke deoksygenerte vann av høy renhet fremstilt som angitt ovenfor i (2.1) for å hindre partikler fra oksidasjon. - Resuspender MNPS og BNC i 100 ml vann. Rist løsningen for å fjerne alle MNPS som ikke er sterkt innarbeidet i BNC. Dekanter de supernatant igjen ved å holde MNPS og BNC på plass med magnet.
- Vask MNPS og BNC flere ganger med vann inntil supernatanten når nøytral pH (pH ~ 7), som målt ved anvendelse av en kolorimetrisk strimmel.
- Separer magnetisk-funksjon BNC eller magnetisk bakteriell nanocellulose (MBNC) fra MNPS bruker pinsett og skyll MBNC flere ganger med vann inntil vannet er klart.
- Steriliser MBNC ved å eksponere MBNC O / N til UV (110-280 nm).
- Autoklaver 500 ml deoksygenert vann av høy renhet ved 120 ° C i 20 minutter og oppbevar MBNC i 20 ml av vann.
- Aseptisk, fordype prøven i 1% av PEG og røre i 2 timer ved RT (37 ° C). Denne fremgangsmåten forbedrer biokompatibilitet og stabiliteten av jernoxydpartikler nanopartikler avsettes i BNC, spesielt de som er blottlagt ved overflaten 5-7. PEG belegg vil bli fordelt over MBNC 3D-nettverket.
Merk: Naked IONP er lett oksidert i luftpå grunn av deres høye kjemiske aktivitet til 8. Selv om PEG er ansett som et ikke-biologisk nedbrytbart materiale, avhenger av dens kjemiske stabilitet på de anvendte biologiske tilstander så som vanninnhold, pH, temperatur, tilstedeværelse av enzymer, reaktive oksygenforbindelser, reaktive nitrogenforbindelser, og andre 9.
3. Karakterisering av BNC og MBNC Pellicles
- Mekaniske egenskaper
- Utfør normal lasting og lossing nanoindentation test med en Berkovich indenter. Radius av Berkovich diamant indenter er 20 nm.
- Bruk smeltet silisiumdioksid og wolfram for å kalibrere kontaktområde som en funksjon av dybden fordypningen ved RT. Under testen, montere prøvene på innrykk bruk av lim. Indenter nærmet prøvene i tykkelsen retning.
- Tilfeldig velge innrykks steder på prøver overflater. Hold avstand mellom 2 innrykk mellom 200-300 mm.
- Påfør lasten tilprøver i trinn og spille inn den tilsvarende forskyvning av indenter. Analyser handlingen i lasten vs dybde for å finne den Youngs modulus.
- Utføre nanoindentation test av prøvene i nærvær av deionisert vann (DI-vann), og test ved å anvende lastfrekvenser mellom 0,0001 mN / sek og 0,005 mN / sek, med toppbelastningen mellom 0,01 og 0,60 mN Mn.
- Bruk en flytende celle og holde prøvene under væsker miljø. Denne unike oppsett for nanomechanical karakterisering nedsenket i en væske miljø er ideell for effektivt å simulere rekkevidden biomekaniske funksjonaliteten til BNC og MBNC membraner.
- Strukturell Karakterisering av SEM
- Karakteriserer nanocellulose fiberstrukturen ved scanning-elektronmikroskopi (SEM).
- Lyofilisere prøvene i 24 timer ved -80 ° C. Deretter montere på SEM-studs, frese med Au-Pd film i 10 sek og analysere ved hjelp av SEM.
- Tar bilder med en forstørrelse på 22,000Xog 60,000X, med en akselerasjonsspenning på 5 kV.
- magnetiske domener
- La de MBNC pellicles til helt tørr ved RT, og deretter utsette for 5 min til en permanent magnet (en Tesla).
- Umiddelbart utføre magnetiske kraft målinger ved hjelp av en bio-AFM i henhold til produsentens protokoll.
- For hver måling, ta første topografi funksjoner og tilegne seg de magnetiske domenene under en andre pass. Skaff begge målinger med bio-AFM i ikke-kontakt modus.
- Magnetisk karakterisering av nanopartikler blir utført ved bruk av vibrerende prøvemagnetometer (VSM) i den fysiske egenskapsmålinger system (ppms) fra Quantum Design, ved romtemperatur (300 K), med et magnetisk felt i området fra -10 000 til 10 000 Oe.
- Cytocompatibility
- Seed humane aorta-glattmuskelceller (HASMC) i en 6-brønns vevskulturplate ved en tetthet på 1.0x10
- Bruk populasjoner av ubehandlede og hydrogenperoksyd behandlede celler som negative og positive kontroller, henholdsvis.
- Utfør Comet assay i henhold til produsentens protokoller og retningslinjer foreslått av A. Azqueta & AR Collins 10.
- Bruk nukleinsyren fargestoff SYBR gull i denne analysen til intercalate og fluorescens-merking av DNA inneholdt i elektroforese prøvene i henhold til produsentens protokoll.
Merk: Celler som ikke gjennomgår noen DNA-skader i nærvær av BNC og MBNC prøvene, vil vise et fluorescerende runde grønn nucleoid, mens DNA-skadede celler vil ha lange kometer - positive prøver vil ha nucleoids (leder av kometen) etterfulgt av haler som inneholder fragmentert DNA-materiale (prosentandel av DNA i halen).
- Seed humane aorta-glattmuskelceller (HASMC) i en 6-brønns vevskulturplate ved en tetthet på 1.0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inkubasjonstiden for G. xylinus var totalt 9 dager, men pellicles begynte å danne tidligere og var tydelig etter ca 2 dager. Den makroskopiske utseende av BNC blir vist i figur 1, hvis form etterligner det av fatet-dyrket kultur. Figur 2 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av BNC-IONP pellicles, som oversikter hovedtrinnene som er involvert i protokollen ovenfor, samt konfigurasjonen av hovedkomponentene.
SEM bilder ble anvendt for å løse mikrostruktur, morfologi og romlig fordeling av fibrene i BNC (figur 3) og IONP fordeling i funksjonalisert BNC (figur 4). BNC er dannet av fine bånd (ca 50 nm i diameter) som danner åpne porene i hele nettverket uten et definert mønster. Den IONP er fortrinnsvis locrerte mellom porene er dannet ved sammenfletting fibril, danner klynger av 100 nm eller mer i størrelse. Individuell IONP er også bundet langs bånd. Den MBNC viser en mindre komprimert fibril struktur i forhold til BNC, sannsynligvis fordi IONP bringe sammen BNC er bånd. Magnetisk kraft mikroskop ble anvendt for å rekonstruere den magnetiske profilen ved topografien i MBNC (figur 5A, B). Store porer på 500 nm diameter eller større er dannet i MBNC, som ikke ble observert i det ubehandlede BNC (figur 5A). Dette er i overensstemmelse med observasjoner i SEM microphotographs, der MBNC viser en mer porøs struktur enn den umodifiserte BNC. Det ble oppdaget en magnetisk kraft gradient med to domener av forskjellig magnetisering over MBNC overflaten (figur 5B), hvis kontrasten ikke korrelerer med åser og daler dannet av IONP rike regioner i MBNC topografiske bilder (figur 5A). Høy og svak intensity magnetiske felt er betegnet som gult og grønt i figur 5B respektivt. Hysteresesløyfen av nanopartikler, som er målt innleiret i den bakterielle nanocellulose, er vist i figur 5 gir bevis på at alle IONPs var superparamagnetiske ved romtemperatur, uten hysterese.
HASMC ble dyrket i nærvær av BNC og av MBNC for å teste for en hvilken som helst skadelig virkning på levedyktigheten til individuelle celler som et resultat av eksponering for disse fremmede materialer. Omfanget av skaden i individuelle celler ble kvantifisert ved påvisning av DNA-strengbrudd (figur 6). Resultatene ble sammenlignet med HASMC vokse under vanlige dyrkingsbetingelser 37 ° C, 95% luft og 5% CO 2 (negativ kontroll) og til HASMC med hydrogenperoksyd-indusert genotoksisitetstesten (100 uM H 2 O 2) i 30 min ( positiv kontroll). Parvise sammenligninger ved hjelp av t-test viste thved virkningene av MBNC på cellenes levedyktighet var vesentlig forskjellig fra de som fremkalles ved hjelp av hydrogenperoksyd-behandling på HASMC (p-verdi <0,001, ***).
Figur 1. Makroskopiske aspekter av bakteriell nanocellulose. BNC pellicles er oppnådd etter en 11-dagers inkubasjonstid, noe som er ca. 3 mm i tykkelse. Inkubasjonstiden er avhengig av kravene til den tiltenkte bruk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fabrikasjon av magnetisk funksjon bakteriell nanocellulose. Iron oxide nanopartikler er montert og jeg ncorporated in situ i BNC, noe som gir en MBNC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. SEM bilde av BNC. BNC viser et fint nettverk og ikke-aggregert bånd med størrelser på 50 nm eller mindre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. SEM bilde av BNC-IONP hinne. Jernoksid nanopartikler (IONP) er fortrinnsvis plassert mellom sammenbindings bånd.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. AFM topografi MBNC og magnetiske domenestrukturer. (A) Overflate topografi MBNC viser flekker av høyt pakket nanopartikler, som står over nanofibril struktur. (B) Gule og grønne domener betegne to regioner av forskjellig magnetisering av høy og svak intensitet magnetfelt hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Omfanget av DNA-skader i HASMC etter å ha eksponeringtil henholdsvis BNC, og MBNC. PosCtl betegner HASMC som gjennomgikk hydrogen peroxide behandling for sammenligningsformål. NegCtl betegner HASMC vokser under normale dyrkingsforhold. De skadelige effektene av MBNC på HASMC levedyktighet var vesentlig forskjellig fra det som ble observert i PosCtl (p-verdi <0,001, ***). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tykkelsen og størrelsen av BNC pellicle lett kan manipuleres ved å endre inkubasjonstid og størrelsen av kolben i hvilken det er vokst i løpet av statisk dyrking. De microproperties av BNC, slik som porøsitet, kan modifiseres ved å endre forholdet mellom oksygen i den statiske kulturen. Høyere oksygenkonsentrasjoner gi tøffere BNC 11. A. Bodin og medarbeidere produserte rør av BNC med et bruddtrykk opp til 880 mm Hg ved å forandre forholdet mellom oksygen fra atmosfærisk oksygen til 100% oksygen under gjæringsprosessen av G. xylinus 12. På samme måte kan porøsiteten av BNC også innføres ved innlemmelse av porogener for eksempel parafinvoks mikrokuler inn i gjæringsprosessen. Den resulterende porøsitet og pore interconnectivity i dette tilfellet vil avhenge av størrelsen porogen 13.
Den porøse nettverk av BNC tillater dem å bli funksjonalisert med nanopartikler, f.eks, for medikamentleveringmidler. I vår studie har vi funksjon BNC med IONP ved å syntetisere og voksende in situ nanopartikler inn i BNC membranen, for å gjennomføre en magnetisk protokoll for rask celle rekruttering og vedlegg i BNC-baserte stillaser. Nanomechanical tester avslører at nanoskala reaksjon av BNC oppfører seg på samme måte med blodårer 14 med en meget lav elastisitetsmodul, E BNC = 0,0025 GPa inne prøvene til 0,04 GPa ved overflaten. De oppnådde verdier er i området med de som ble observert ved Fu et al. 15.
Overskuddet av IONP kan lett bli fjernet fra BNC på grunn av den høye porøsitet av materialet. SEM bildene viste at nanopartikler er fordelt hovedsakelig i områder dannet av fibrillforskningen interlacing og spredt langs bånd. Konsentrasjonen av jern artene som brukes i denne protokollen, ga høy tett pakket IONP, som brakte sammen BNC er bånd. Dette resulterte i enMBNC med større porer enn de av den umodifiserte BNC. Olsson et al., Som anvendt forskjellige konsentrasjoner av FeSO 4 / CoCl 2 salter med den samme volumfraksjon av BNC i syntesen av cellulose nanofibril aerogeler, rapporterte en tilsvarende økning i BNC porøsitet når de endres volumfraksjonen av den ferromagnetiske kobolt ferritt nanopartikler fra 0,7% til 5,7% 16. Denne høye porøsitet i MBNC kan være en fordel for deponering av legemidler som øker utvinningen tid og unngå restenose på skadede arterieveggene.
Mangel på korrelasjon mellom de topografiske trekk og magnetiske fase bilder er også blitt beskrevet av B. Torre et al. 17, som påpekt uavhengighet mellom topografi og de magnetiske signaler på sparsom nanopartikkel filmer. Ytterligere karakterisering studier må gjennomføres for å fastslå magnetisering hysterese (MH) løkkene på MBNC via SQUID-VSM systengler.
Den MBNC viste lavt potensial for toksiske effekter, i henhold til resultatene observert i Comet-analysen, noe som indikerer at materialet er biologisk forlikelig for bruk i kontakt med celler.
De mest kritiske trinn i fremgangsmåten er relatert til mengden av ammoniumhydroksyd, og den hastighet med hvilken den tilsettes, så vel som å sikre fullstendig nedsenking og omrøring av BNC i oppløsning under reaksjonen. Det første aspektet bestemmer størrelsen av de resulterende jernoksid nanopartikler, mens den andre påvirker hvordan nanopartikler er fordelt på tvers av BNC matrisen. For bedre å styre størrelsen av den MNPS, kan en byrette med en stoppekran brukes til å regulere tilsetningen ved å slippe ammoniumhydroksyd i reaksjons. Små biter av BNC som kan være fullstendig neddykket i løsningen blir rådet, f.eks størrelser av ca. 1,9 cm 2 til et totalt volum på 10 ml oppløsning. en Limitering av denne teknikken er det inhomogen fordeling av IONP inne i BNC mesh.
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å innlemme jernoksid nanopartikler i BNC for å danne en kompositt. På grunn av biokompatibilitet og de fysiske og mekaniske egenskaper av både BNC og jernoksid nanopartikler kan MBNC brukes i en rekke forskjellige biomedisinske anvendelser slik som medikamentavleveringssystemer og stillas for cellevekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al.
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
