Abstract
I denne undersøgelse er bakteriel nanocellulose (BNC) frembragt af bakterier Gluconacetobacter xylinus syntetiseret og imprægneret in situ med jernoxid nanopartikler (IONP) (Fe 3 O 4), hvilket gav en magnetisk bakteriel nanocellulose (MBNC). Syntesen af MBNC er en præcis og specielt designet flertrinsproces. Kort fortalt, bakteriel nanocellulose (BNC) pellikeler er udformet af konserverede G. xylinus stamme ifølge vores eksperimentelle krav til størrelse og morfologi. En opløsning af jern (III) chlorid-hexahydrat (FeCl3 · 6H 2 O) og jern (II) chlorid tetrahydrat (FeCl 2 · 4H 2 O) med et 2: 1 molforhold fremstilles og fortyndes i deoxygeneret vand med høj renhed. En BNC hinde indføres derefter i beholderen med reaktanterne. Denne blanding omrøres og opvarmes ved 80 ° C i et siliconeoliebad og ammoniumhydroxid (14%) tilsættes derefter ved at droppe at udfældeferroioner i BNC mesh. Dette sidste trin tillader dannelse in situ magnetit nanopartikler (Fe 3 O 4) inde i bakterielle nanocellulose mesh at bibringe magnetiske egenskaber til BNC hinde. En toksikologisk assay blev anvendt til at evaluere biokompatibilitet BNC-IONP hinde. Polyethylenglycol (PEG) blev anvendt til at dække de IONPs for at forbedre deres bioforligelighed. Scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder viste, at IONP blev placeret fortrinsvis i fibril interlacing rum i BNC matrix, men nogle af dem blev også fundet langs BNC bånd. Magnetisk kraft mikroskop målinger udført på MBNC påvist forekomst magnetiske domæner med høj og svag intensitet magnetfelt, hvilket bekræfter den magnetiske karakter af MBNC hinde. Youngs modul værdier opnået i dette arbejde er også i en fornuftig aftale med dem rapporteret i flere blodkar i tidligere undersøgelser.
Introduction
Den bacterian nanocellulose (BNC) syntetiseres ved Acetobacter xylinum stamme, også kendt som Gluconacetobacter xylinus, og deponeres i form af film eller pellikeler på luft-væske-grænsefladen under stationær kultur. Disse BNC pellikeler tage form af beholderen, hvor de dyrkes, og deres tykkelse afhænger af antallet af dage i kultur. A. xylinus anvender glucosen i mediet til syntese af cellulosemikrofibrillerne gennem en proces med polymerisering og efterfølgende krystallisation. Polymerisationen af de glucoserester udføres ved den bakterielle ekstracellulære membranen, hvor glucankæder ekstruderes fra enkelte porer fordelt over cellen kuvert. Krystallisering af cellulosemikrofibrillerne forekommer i det ekstracellulære rum med dannelsen af glucan kæde ark af van der Waals binding, efterfulgt af stabling af arkene af H-bonding 1.
Magnetic nanopartikler integreret til et BNC matrix kan manipuleres nemt ved et eksternt magnetisk felt for at øge den nødvendige kraft til at lede og begrænse glatmuskelceller (SMC'er) indeholdende magnetiske nanopartikler, på den skadede lokalitet af arterievæggen. Denne strategi holder SMC'er væk fra andre væv, og holder cellerne på plads mod kraften udøvet af blodgennemstrømningen. Det er blevet vist, at SMC'er spiller en vigtig rolle i vasoelasticity af blodkarret, hvor de danner rigelige lag i hovedsagelig tunica media 2.
Den anvendte metode til syntese af MBNC involverer BNC hinde nedsænket og omrørt i en opløsning af jern (III) chlorid-hexahydrat og jern (II) chlorid tetrahydrat ved 80 ° C. tilsættes ammoniumhydroxid til dannelse af jernoxid nanopartikler inde i BNC mesh. Tilsætning af ammoniumhydroxid ændrer farven af opløsningen fra orange til sort. Den IONPs kompakt sammen langs BNC fibrils med en uensartet fordeling.
Denne protokol fokuserer på design af en bakteriel nanocellulose-magnetisk nanopartikel hinde, som vi har navngivet magnetisk bakteriel nanocellulose (MBNC), som er beregnet til brug som en erstatning for manglende, beskadigede eller tilskadekomne lille diameter blodkar. HS Barud og kolleger har for nylig udgivet en lignende arbejde at producere en BNC-baserede fleksible magnetisk papir ved at blande BNC pellikeler i en stabil vandig dispersion af PEG og superparamagnetiske jernoxid nanopartikler 3. Her beskriver vi fremstilling af bakteriel cellulose og dens imprægnering in situ med magnetiske nanopartikler. En cytotoksicitet assay baseret på påvisning af enkelt DNA strengbrud blev anvendt til at teste biokompatibilitet BNC og MBNC pellikeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af bakteriel Nanocellulose (BNC)
Bemærk: Alle de trin udføres under aseptiske betingelser, medmindre andet er angivet.
- Forbered dyrkningsmediet.
- Forbered 500 ml flydende dyrkningsmedium ved at kombinere 25 g gærekstrakt, 15 g pepton, 125,0 g mannitol, og 500 ml vand med høj renhed. Autoklavér denne blanding ved 120 ° C i 20 minutter og opbevares ved 4 ° C.
- Fremstilling af 100 ml af halvfaste medier ved tilsætning af 15 g agar til 5,0 g gærekstrakt, 3,0 g pepton, 25,0 g mannitol og 100 ml vand med høj renhed. Autoklavér denne blanding ved 120 ° C i 20 min. Når autoklaveret, deponering 5 ml af blandingen i et 90 mm x 16 mm plastik petriskål. Lad opløsningen gel ved 4 ° C og opbevares ved denne temperatur indtil videre anvendelse.
- Rehydrér G. xylinus stamme konserveret i frysetørrede hætteglas ved tilsætning af 1 ml flydende dyrkningsmedium og pipettering op ogned, som indikeret ved producentens anvisninger.
- Pode petri-skåle indeholdende halvfaste medier med små dråber af bakteriesuspension anvendelse af en podenål. Kontroller, at inokulum dækker hele petriskålen ved at bevæge løkken i en zig zag retning fra kanten til midten af skålen.
- Inkuber petriskåle ved 26 ° C i 72 timer i en inkubator uden CO 2. Når inkubationstiden er afsluttet, små hvide kolonier er synlige. Hvis der ikke umiddelbart anvendes kolonierne, opbevares petriskåle ved 4 ° C ved at forsegle låget med Parafilm og placere retterne hovedet. Kolonierne kan opbevares på denne måde i op til 6 måneder.
- Transfer 2 ml flydende medium kultur fremstillet i trin (1.1.1) i hver brønd i en 24-brønds vævskulturplade. Tag to kolonier med en podning af kanylen fra de inokulerede petriskåle i trin (1.3) og placere dem i den første brønd af vævskulturpladen. REPEAT den samme procedure for de resterende 23 brønde.
- Inkubér vævsdyrkningsplade ved 30 ° C i 7 dage. Dette vil give i alt 24 BNC pellikeler med diameter på 16 mm og en tykkelse på ca. 2-3 mm i diameter som vist i figur 1.
Bemærk: Du må ikke forstyrre bakteriekulturen på noget tidspunkt i løbet af inkubationstid, for eksempel ved at ryste pladerne. I inkubationstiden, G. xylinus ekstruderer glucopyranoseenheder sukkermolekyler til dannelse af en polymer krystallinsk maske i luft-væske-grænsefladen, som vedtager formen og størrelsen af kolben under statiske dyrkningsbetingelser. Denne polymer matrix, kendt som bakteriel nanocellulose (BNC), er iøjnefaldende ved slutningen af inkubationsperioden. - Indsamle BNC pellikeler fra dyrkningsmediet og sterilisere dem i 200 ml 1% NaOH-opløsning i 1 time ved 50 ° C, for at fjerne alle spor af G. xylinus. Eventuelt omrøres denne opløsning ved 300 opm ved anvendelse af en magnetisk stangog en omrøring plade. Kassér NaOH-opløsning, og der tilsættes 200 ml frisk fremstillet 1% NaOH-opløsning. Gentag den samme proces igen, eller indtil BNC pellikeler i opløsning får en gennemskinnelig fremtoning.
- Skyl BNC pellikeler med vand tre gange, og gemme dem i høj renhed vand ved stuetemperatur. Sørg BNC pellikeler er helt nedsænket i vandet og er ikke tilladt at tørre til enhver tid.
- Autoklaver BNC pellikeler ved 121 ° C i 20 min.
Bemærk: En in vivo subkutan med rotter udført af Martson og medarbejdere udviste ikke-nedbrydningsprodukter tegn på BNC efter 60 ugers implantation. Faktisk BNC er nedbrydelige i naturen ved mikrobielle og fungale enzymer, som er fraværende i pattedyr. På den anden side, kan bionedbrydeligheden af BNC være resultatet af mekaniske, kemiske og biologiske processer, der svækker microfibril netværk in vivo 4.
2. Syntese af Polymer-coatetIron Oxide Nanopartikler og dens Aflejring i en bakteriel Nanocellulose membran
- Bubble 1.000 ml vand med høj renhed med nitrogengas for at fjerne eventuelt opløst oxygen i vand og erstatte det med nitrogen.
- Brug en trehalset rundbundet kolbe at fremstille en opløsning i et 2: 1 molært forhold af jern (III) chlorid-hexahydrat (FeCl3 · 6H 2 O) og jern (II) chlorid tetrahydrat (FeCl 2 · 4H 2 O) fortyndet med den deoxygenerede høj renhed vand. Brug for eksempel 5,4 g FeCl3 · 6H 2 O og 1,98 g FeCl 2 · 4H 2 O i 10 ml deoxygeneret høj renhed vand. Hvis dette præparat fik for viskos og vanskelig at omrøre, bruge 0,54 g FeCl3 · 6H 2 O og 0,198 g FeCl 2 · 4H 2 O i 20 ml deoxygeneret vand med høj renhed.
Bemærk: Reducer eksponeringstiden for FeCl 2 · 4H 2 O til luft ved vejning denne lmemical forbindelse så hurtigt som muligt. Når disse er indført i tre-halset rundbundet kolbe, lukke trehalset rundbundet kolbe med septum propper, indtil den er forbundet til nitrogen forsyning af gas og svaleren. - Brug to halse af fartøjet til at levere en konstant indgang og udgang af kvælstof gas ved at tilslutte kvælstof gasforsyningen til en nål slået i et septum prop og fastgøres til fartøjets hals.
- Placer 1 BNC hinde, som blev fremstillet tidligere i trin 1.5 (15,6 mm diameter og 2-3 mm i tykkelse) i beholderen med reaktanterne. Sørg for, at prøven er helt nedsænket i væsken.
- Slut resterende hals af fartøjet til en kondensator rør. Derudover bruge et tørrerør fyldt med vandfrit calciumsulfat oven på svaleren. Kør vand gennem svaleren.
- Forsegl alle glas leddene med vakuum fedt.
- Opvarm opløsningen i en silikone oliebad til 80 ° C ved anvendelse af en omrørerkogeplade og hold denne temperatur, indtil trin 2.10. Brug en lille magnetisk omrører for at blande reaktanterne ved 350 rpm i 5 min. Sørg BNC er passende imprægneret med ferro-opløsning og reaktanterne er fuldstændig opløst. Hold omrøring af blandingen indtil afslutningen af eksperimentet.
Bemærk: Anvend et termometer til at kontrollere temperaturen af siliconeolien. Det bør være stabil over 80 ° C. - Øge omrøringen hastighed til 700 rpm og tilføje (ved at slippe), i et tidsinterval på 5 min, 5 ml ammoniumhydroxid (NH4OH, 14%) til 10 ml jernholdigt løsning med en pipettering nål, som har været også udstanset i et septum prop. Efter tilsætning af ammoniumhydroxid, farven af opløsningen skifter fra gul / orange til sort.
- Fortsæt omrøring af opløsningen ved 80 ° C i yderligere 5 min. Undgå høj hastighed rørelser for at bevare integriteten af prøven. Høje hastigheder, dvs. højere end 1000 rpm, kan ødelæggeprøven.
- Sænk temperaturen af opløsningen til 30 ° C ved hjælp af temperaturkontrol bunden af omrøring kogeplade og holde omrøring i yderligere 5 min. Sluk derefter den varme plade. På dette tidspunkt er den IONP blevet indarbejdet i BNC mesh.
- Afkøl blandingen ned til stuetemperatur og adskille de magnetiske nanopartikler (MNP) og BNC anvendelse af en stærk permanent magnet (f.eks 1 Tesla). For at gøre dette, overføre blandingen til et fartøj kolbe og derefter, og samtidig holde magneten tæt på skibet, holde MNP'er og BNC på plads, mens dekantering supernatanten.
Bemærk: Vær forsigtig, når du håndterer stærke magneter, da de kan være skadelige, når de anvendes forkert. For trin (2,12) - (2,14) og (2,16) bruge deoxygenerede høj renhed vand tidligere fremstillet i (2.1) for at forhindre partikler fra oxidation. - Resuspender MNP'er og BNC i 100 ml vand. Ryst forsigtigt løsning til at fjerne alle de MNP'er, der ikke er stærkt indarbejdet i BNC. Dekanteres de supernatant igen ved at holde MNP'er og BNC på plads ved hjælp af magnet.
- Vask MNP'er og BNC flere gange med vand, indtil supernatanten når neutral pH (pH ~ 7), som målt ved anvendelse af et kolorimetrisk strimmel.
- Adskil magnetisk-funktionaliserede BNC eller magnetisk bakteriel nanocellulose (MBNC) fra MNP'er med en pincet og skyl MBNC flere gange med vand, indtil vandet er klart.
- Steriliser MBNC ved at udsætte MBNC O / N til UV (110-280 nm).
- Autoclave 500 ml deoxygeneret vand med høj renhed ved 120 ° C i 20 minutter og opbevares MBNC i 20 ml af dette vand.
- Aseptisk nedsænkes prøven i 1% af PEG og omrør i 2 timer ved stuetemperatur (37 ° C). Denne procedure forbedrer biokompatibilitet og stabilitet af jernoxid nanopartikler aflejret i BNC, specielt dem, der udsættes ved overfladen 5-7. PEG belægning vil blive fordelt over MBNC 3D-netværket.
Bemærk: Naked IONP let oxideres i luftgrund af deres høje kemiske aktivitet 8. Selvom PEG betragtes som en ikke-biologisk nedbrydeligt materiale, dets kemiske stabilitet afhænger af de anvendte biologiske tilstande såsom vandindhold, pH, temperatur, tilstedeværelse af enzymer, reaktive oxygenarter, reaktive nitrogenforbindelser, og andre 9.
3. Karakterisering af BNC og MBNC pellikeler
- Mekaniske egenskaber
- Udfør normal lastning og losning nanoindentation testen med en Berkovich indrykning. Radius af Berkovich diamant indrykning er 20 nm.
- Brug kvartsglas og wolfram til kalibrering kontaktområde som en funktion af indrykning dybde ved stuetemperatur. Under testen montere prøverne på indrykning med lim. Den indrykning nærmede prøverne i sin tykkelse retning.
- Tilfældigt vælge indrykning steder på prøver overflader. Hold afstanden mellem 2 led mellem 200-300 mm.
- Påfør belastning tilprøver i trin og optage den tilsvarende forskydning af indrykning. Analyser handlingen i lasten vs dybden for at finde den Youngs modul.
- Udfør den nanoindentation test af prøverne i nærværelse af deioniseret vand (DI vand), og ved at påføre belastning på mellem 0,0001 mN / sek og 0,005 mN / sek, med spidsbelastning mellem 0,01 Mn og 0,60 mN.
- Brug en flydende celle og opbevare prøver under væsker miljø. Denne unikke setup for nanomekaniske karakterisering nedsænket i et flydende miljø er ideel til effektivt at simulere rækkevidde biomekaniske funktionalitet BNC og MBNC membraner.
- Strukturel karakterisering af SEM
- Karakterisere struktur nanocellulose fiber ved scanningselektronmikroskopi (SEM).
- Lyofilisere prøverne i 24 timer ved -80 ° C. Derefter monteres på SEM stutterier, sputter med Au-Pd film til 10 sek og analysere ved hjælp af SEM.
- Tager billeder ved en forstørrelse på 22,000Xog 60,000X, med en acceleration spænding på 5 kV.
- magnetiske domæner
- Lad MBNC pellikeler til helt tør ved RT, og efterfølgende udsættes for 5 min til en permanent magnet (1 Tesla).
- Straks, udføre den magnetiske kraft målinger ved anvendelse af en bio-AFM ifølge producentens protokol.
- For hver måling fange først topografi funktioner og erhverve de magnetiske domæner under en anden pass. Opnå begge målinger med bio-AFM i berøringsfri tilstand.
- Magnetisk karakterisering af nanopartiklerne udføres under anvendelse vibrerende prøve magnetometer (VSM) i den fysiske egenskab målinger systemet (PPM) af Quantum Design, ved stuetemperatur (300 K), med et magnetfelt i området fra -10.000 til 10.000 ørsted.
- Cytocompatibility
- Seed human aorta glatte muskelceller (HASMC) i en 6-brønds vævsdyrkningsplade med en tæthed på 1,0x10
- Brug populationer af ubehandlede og hydrogenperoxid behandlede celler som negative og positive kontroller, hhv.
- Udfør Comet assay ifølge producentens protokoller og retningslinjerne foreslået af A. Azqueta & AR Collins 10.
- Brug nukleinsyren farvestof SYBR Gold i dette assay at indskyde og fluorescens mærke DNA indeholdt i de elektroforesebehandlede prøver efter fabrikantens protokol.
Bemærk: Celler, der ikke undergår nogen DNA-skader i overværelse af BNC og MBNC prøver, vil vise en fluorescerende rund grøn nucleoid, mens DNA beskadigede celler vil have lange kometer - positive prøver vil have nucleoids (lederen af kometen) efterfulgt af haler, som indeholder fragmenterede DNA-materiale (procentdel af DNA i halen).
- Seed human aorta glatte muskelceller (HASMC) i en 6-brønds vævsdyrkningsplade med en tæthed på 1,0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inkubationstiden for G. xylinus var i alt 9 dage, men de pellikeler begyndte at danne tidligere og var tydelige efter ca. 2 dage. Det makroskopiske udseende af BNC vises i figur 1, hvis form efterligner den af skålen-dyrket kultur. Figur 2 beskriver fremgangsmåden til fremstilling af BNC-IONP pellikeler, der sammenfatter vigtigste trin i protokollen ovenfor, samt konfigurationen af de vigtigste komponenter.
SEM billeder blev anvendt til at løse mikrostruktur, morfologi og rumlige fordeling af fibrene i BNC (figur 3) og IONP fordeling i funktionaliseret BNC (figur 4). BNC er dannet af fine bånd (ca. 50 nm i diameter), der danner åbne porer tværs af hele netværket uden et defineret mønster. Den IONP er fortrinsvis located mellem porerne dannet ved fibril interlacing, danner klynger af 100 nm eller derover i størrelse. Individuel IONP også bundet langs bånd. Den MBNC udviser en mindre komprimeret fibril struktur i forhold til BNC, sandsynligvis fordi IONP samle BNC s bånd. Magnetisk kraft mikroskop blev anvendt til at rekonstruere den magnetiske profil på topografi MBNC (figur 5A, B). Store porer på 500 nm diameter eller større er dannet i MBNC, som ikke blev observeret i ubehandlede BNC (figur 5A). Dette er i overensstemmelse med bemærkningerne i SEM mikrofotografier, hvor MBNC viser en mere porøs struktur end den umodificerede BNC. En magnetisk kraft gradient med to domæner med forskellig magnetisering blev detekteret over MBNC overflade (figur 5B), hvis kontrasten ikke korrelerer med bakker og dale er dannet ved IONP-rige regioner i MBNC topografiske billeder (figur 5A). Høj og svag intensity magnetfelter er betegnet som gul og grøn i figur 5B hhv. Hysteresesløjfen af nanopartiklerne, som måles indlejret i den bakterielle nanocellulose, er vist i figur 5 som godtgør, at alle IONPs var superparamagnetiske ved stuetemperatur, uden hysterese.
HASMC blev dyrket i nærvær af BNC og MBNC at teste for enhver negativ indvirkning på levedygtigheden af individuelle celler som et resultat af udsættelse for disse fremmedlegemer. Omfanget af skader i individuelle celler blev kvantificeret ved påvisning af DNA-strengbrud (figur 6). Resultaterne blev sammenlignet med HASMC dyrkning under normale dyrkningsbetingelser af 37 ° C, 95% luft og 5% CO2 (negativ kontrol) og til HASMC med hydrogenperoxid-induceret genotoksicitet (100 uM H 2 O 2) i 30 minutter ( positiv kontrol). Parvise sammenligninger ved hjælp af t-test viste thpå virkningerne af den MBNC på cellelevedygtigheden var signifikant forskellige fra dem, der induceres med hydrogenperoxid behandling på HASMC (p-værdi <0,001, ***).
Figur 1. Makroskopiske aspekter af bakteriel nanocellulose. Er opnået BNC pellikeler efter en 11-dages inkubationstid, som er ca.. 3 mm i tykkelse. Inkubationstiden afhænger af kravene til den tilsigtede anvendelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fremstilling af magnetisk funktionaliserede bakteriel nanocellulose. Jern oxid nanopartikler er samlet og jeg ncorporated in situ i BNC, hvilket giver en MBNC. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. SEM billede af BNC. BNC viser en fin netværk og ikke-aggregerede bånd med størrelser på 50 nm eller mindre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. SEM billede af BNC-IONP pellikel. Jern oxid nanopartikler (IONP) er fortrinsvis placeret mellem sammenflettede bånd.d / 52.951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. AFM topografi MBNC og magnetiske domæne strukturer. (A) Overflade topografi MBNC viser pletter af højt pakkede nanopartikler, som står over nanofibril struktur. (B) Gule og grønne domæner betegne to regioner med forskellig magnetisering af høj og svag intensitet magnetfelt henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Omfanget af DNA-skader i HASMC efter at være udsattil BNC, og MBNC hhv. PosCtl betegner HASMC der undergik hydrogenperoxid behandling til sammenligning. NegCtl betegner HASMC dyrkning under normale dyrkningsbetingelser. De skadelige virkninger af MBNC på HASMC levedygtighed var signifikant forskellige fra dem, der observeres i PosCtl (p-værdi <0,001, ***). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tykkelsen og størrelse af BNC hinde kan nemt manipuleres ved at ændre inkubationstiden og størrelsen af kolben, hvori det er dyrket under statisk dyrkning. De microproperties af BNC, såsom porøsitet, kan ændres ved at ændre oxygen-forhold i den statiske kultur. Højere koncentrationer ilt giver hårdere BNC 11. A. Bodin og medarbejdere producerede rør med BNC med et sprængtryk på op til 880 mm Hg ved at ændre oxygen-forhold fra atmosfærisk oxygen til 100% oxygen under fermenteringsprocessen af G. xylinus 12. Tilsvarende kan porøsiteten af BNC også indføres ved at inkorporere porogener såsom paraffin mikrosfærer i gæringsprocessen. Den resulterende porøsitet og pore sammenkobling i dette tilfælde vil afhænge af porogenet størrelse 13.
Den porøse netværk af BNC tillader dem at blive funktionaliseret med nanopartikler, f.eks, til lægemiddelafgivelseagenter. I vores undersøgelse har vi funktionaliserede BNC med IONP ved at syntetisere og voksende in situ nanopartiklerne ind i BNC-membran, for at gennemføre en magnetisk protokol for hurtig celle rekruttering og vedhæftet fil i BNC-baserede stilladser. Nanomekaniske afprøvningerne viser, at nanoskala reaktion BNC opfører sig på lignende måde med blodkar 14 med en meget lav Youngs modulus, E BNC = 0,0025 GPa inde prøverne til 0,04 GPa ved overfladen. De opnåede værdier er i området med de observeret af Fu et al. 15.
Overskuddet af IONP kunne let fjernes fra BNC grund af den høje porøsitet af materialet. SEM fotografier viste, at nanopartiklerne er fordelt primært i de rum dannet af fibril sammenfletning og spredte langs bånd. Koncentrationen af jern arter, der anvendes i denne protokol gav et højt tæt pakket IONP, som samlede BNC s bånd. Dette resulterede i enMBNC med større porer end den umodificerede BNC. Olsson et al., Der anvendes forskellige koncentrationer af FeSO4 / CoCl2 salte med den samme volumenfraktion af BNC ved syntesen af cellulose nanofibril aerogeler, rapporterede en tilsvarende stigning i BNC porøsitet, når de ændret volumen del af den ferromagnetiske kobolt ferrit nanopartikler fra 0,7% til 5,7% 16. Denne høje porøsitet i MBNC kan være fordelagtigt for aflejring af lægemidler, som øger inddrivelse tid og undgå restenose på beskadigede arterievæggene.
Den manglende sammenhæng mellem de topografiske træk og magnetiske billeder fase er også blevet beskrevet af B. Torre et al. 17, som påpegede uafhængighed mellem topografi og de magnetiske signaler af sparsomme nanopartikel film. Yderligere karakterisering undersøgelser skal udføres for at bestemme magnetiseringen hysterese (MH) loops i MBNC via SQUID-VSM systængler.
Den MBNC viste lavt potentiale for toksiske virkninger, efter de observerede i Comet assay resultater, hvilket indikerer, at dette materiale er bioforligeligt til brug i kontakt med celler.
De mest kritiske trin i proceduren er relateret til mængden af ammoniumhydroxid og den hastighed, hvormed det tilsættes, samt sikre den fuldstændige nedsænkning og omrøring af BNC i opløsningen under reaktionen. Det første aspekt bestemmer størrelsen af de resulterende jernoxid nanopartikler, mens det andet indflydelse på, hvordan nanopartiklerne er fordelt over af BNC matrix. For bedre at kunne styre størrelsen af MNP'er, kan en burette med en stophane anvendes til at regulere tilsætningen ved at droppe ammoniumhydroxid i reaktionen. Små stykker BNC, der kan være helt nedsænket i opløsningen rådes fx størrelser på ca 1,9 cm2 til et samlet volumen på 10 ml opløsning. én Limiførelsen af denne teknik er det inhomogen fordeling af IONP inde BNC mesh.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til inkorporering af jernoxid nanopartikler i BNC til dannelse af en komposit. På grund af biokompatibilitet og de fysiske og mekaniske egenskaber af både BNC og jernoxid nanopartikler kan MBNC anvendes i mange forskellige biomedicinske applikationer såsom lægemiddelafgivelsessystemer og stillads til cellulær vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al. Biocellulose-based flexible magnetic paper. J. Appl. Phys. 117, (2015).
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
