Summary
Hier een protocol wordt bacteriële capture meten door CD4 + T-cellen die tijdens antigeenpresentatie via transinfection van pre-geïnfecteerde dendritische cellen (DC). We zien hoe de noodzakelijke stappen uit te voeren: het isoleren van primaire cellen, infectie van DC, DC / T-cel conjugaat vorming, en meting van bacteriële T celtransfectie.
Introduction
Wanneer een ziekteverwekker infecteert de gastheer, is er meestal een activering van het aangeboren en adaptieve immuunreacties, noodzakelijk voor bacteriële verwijdering. Aangeboren immuniteit is de eerste verdedigingslinie die de meeste infecties voorkomt. Aangeboren immuniteit te onderscheiden op een nauwkeurige manier elementen die zijn geconserveerd onder brede groepen van micro-organismen (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, PAMPs) 1. De mechanismen van aangeboren immuniteit omvatten fysische barrières zoals huid, chemische barrières (antimicrobiële peptiden, lysozyme) en de aangeboren leukocyten, waarbij de fagocyten (macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen), mestcellen, eosinofielen, basofielen en natuurlijke killer cellen omvatten 2. Deze cellen herkennen en pathogenen te elimineren, hetzij door een aanval op hen door contact of via fagocytose, die pathogeen engulfing en doden omvat. Dit systeem staat niet toe levenslange verdediging, in tegenstelling tot adaptieve immuniteit, die immunologisch geheugen tegen p verlenenathogens. Het adaptieve immuunsysteem is de tweede verdedigingslinie en is in staat te herkennen en te reageren op specifieke antigenen van verschillende microbiële en niet-microbiële stoffen 3. De hoofdcomponenten van het adaptieve immuunsysteem zijn lymfocyten, die B- en T-cellen omvatten. B-cellen zijn betrokken bij de humorale respons, antilichamen uitscheiden tegen pathogenen of exogene eiwitten. Echter, T cellen zijn de celgemedieerde immuniteit, het moduleren van de immuunrespons met cytokinen afscheiding of doden pathogeen geïnfecteerde cellen 4.
Antigeen presenterende cellen (APC's) zoals dendritische cellen of macrofagen, bestanddelen van het aangeboren immuunsysteem, kan fagocytose pathogenen en verwerken bacteriële componenten in antigenen, die op het celoppervlak worden door de Major Histocompatibility Complex (MHC) 5-7 herkennen. Nadat APC ziekteverwekkers hebben phagocytized, zijn ze meestal migreren naar de drainerende lymfeklieren, waar ze interageren met Tcellen. T-lymfocyten kunnen specifieke peptide-MHC-complexen herkennen aan hun T-cel receptoren. De immune synaps (IS) optreedt in het grensvlak tussen een antigeen beladen APC en een lymfocyt tijdens antigeenpresentatie 8,9. Sommige bacteriën kunnen fagocytose overleven en systematisch te verspreiden binnen de APC's. In deze visie, geïnfecteerde APC's dienen als bacteriële reservoirs of "Trojaanse paarden", dat bacteriële spread 10 vergemakkelijken. Het intieme contact tussen APC's en de lymfocyten die plaatsvinden tijdens IS vorming ook functioneren als een platform voor de uitwisseling van een deel van membranen, genetisch materiaal en exosomes en kunnen gekaapt bepaalde virussen om T-cellen te infecteren; Dit proces heet transinfection 11-13.
Sommige pathogene bacteriën (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica en Shigella flexneri) kunnen T-lymfocyten dringen in vivo en hun gedrag 14-16 passen. We hebbenrecent beschreven dat T-lymfocyten kunnen ook bacteriën door transinfection van eerder geïnfecteerde dendritische cellen (DCs) tijdens antigeenpresentatie 16 vangen. T-cel bacteriële capture door transinfection buitengewoon effectiever (1,000-4,000x) dan directe infecties. T-cellen capture pathogeen en niet-pathogene bacteriën aangeeft dan transinfection is een proces gedreven door T-cellen. Opvallend transinfected T (Tit) cellen snel doodde de gevangen bacteriën en deed dat efficiënter dan professionele fagocyten 16. Deze resultaten, die een dogma van de immunologie breken, blijkt dat de cellen van adaptieve immuniteit functies die zogenaamd exclusief de aangeboren immuniteit waren kunnen uitvoeren. Bovendien toonden wij aan dat tit cellen scheiden grote hoeveelheden pro-inflammatoire cytokines en tegen bacteriële infecties in vivo.
Hier presenteren we de verschillende protocollen die worden gebruikt om de bacteriële transinfection proces bestudereneen muismodel. Dit model is gebaseerd op het gebruik van CD4 + T-cellen uit transgene muizen OTII, die een TCR specifiek voor peptide 323-339 van OVA (OVAp) in het kader van I-Ab 17 die specifieke interactie met bacteriën geïnfecteerde bot aangebracht marrow- afgeleide DCs (BMDCs) 18,19 geladen met OVAp, de vorming van een stabiele immuunsysteem synapsen.
T-cel transinfection kunnen worden gevisualiseerd en gevolgd met behulp van fluorescentie microscopie. Bovendien kan flowcytometrie worden gebruikt voor het detecteren van geïnfecteerde cellen door gebruik te maken van de fluorescentie geëmitteerd door bacteriën tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) 16,20. Bovendien kunnen T-cel transinfection worden gekwantificeerd door een gevoeliger benadering de gentamicine survival test die meting van een groot aantal events mogelijk maakt. Gentamicin is een antibioticum dat eukaryote cellen niet kunnen binnendringen. Daarom is het gebruik van dit antibioticum maakt differentiatie van intracellulaire bacteriën die het antibioticum toevoeging fr overleefdOM extracellulaire degenen die werden gedood 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Experimentele procedures werden goedgekeurd door het Comité voor onderzoek Ethiek van de Universidad Autònoma de Madrid en uitgevoerd onder toezicht van de Universidad Autònoma de Madrid Hoofd van dierenwelzijn en gezondheid in overeenstemming met de Spaanse en Europese richtlijnen. Muizen werden gekweekt in specifieke pathogeenvrije (SPF) huisvesting en ze werden gedood door opgeleid en gekwalificeerd personeel met behulp van kooldioxide (CO 2) inademing methode.
1. Mouse Bone Marrow-afgeleide DCs Differentiatie en de Infection
Opmerking: Figuur 1 vat deze eerste stap. Alle procedures moeten in de kap van dit punt worden uitgevoerd, met alleen steriele media, instrumenten, pipetpunten en cultuur gerechten.
- Muis Bone Marrow-afgeleide DCs Differentiatie
- Ontleden dij- en dijbenen van een C57 / BL6 muizen en 22 over in een kunststof schaal met 10 ml RPMI medium. Snijd elke epifyse af, met een steriele schaar en beenmerg, die een karakteristieke fel rode kleur heeft bloot.
- Infundeer de binnenkant van het bot met 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (PBS / BSA / EDTA buffer) met een steriele spuit op een steriele Petri schotel.
- Verzamel de celsuspensie en centrifugeer in een buis bij 600 xg in een gekoelde centrifuge (4 ° C).
- Resuspendeer de cellen in 1 ml ammonium-chloride-Kalium (ACK) lyserende buffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM EDTA) en incubeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te elimineren.
- Voeg 10 ml van RPMI 1640-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en filtreer door een cel zeef (70 um) om botfragmenten en celklonten verwijderen voordat centrifugeren bij dezelfde snelheid (600 xg) omdat klonten werden verwijderd door filtreren.
- Tel de cellen van eend passen tot 5 x 10 5 cellen / ml met RPMI 10% FBS (bevattende 50 uM B-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat) en voeg 20 ng / ml recombinant murine granulocyt macrofaag-kolonievormende stimulerende factor (rm-GM-CSF) als eindconcentratie.
- Voeg deze suspensie aan een steriele, microbiologische kwaliteit, 15 cm Petrischaal en cultuur in een CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Om de drie dagen, het afsluiten zowel niet-hechtende cellen en losgemaakte cellen met 5 mM EDTA in PBS en resuspendeer in 5 x 10 5 cellen / ml celdichtheid, vers medium bevattende 20 ng / ml rm-GM-CSF.
- Rijping van DCs en Antigen laden
- Op dag 9, resuspendeer de cellen bij 5 x 10 5 cellen / ml dichtheid in medium bevattende 20 ng / ml rm-GM-CSF. Voeg dan 20 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) naar hoog MHC-II expressie mogelijk maken op cellen en incubeer in een niet-weefselkweek behandelde steriele 15 cm Petrischaal van 24 uur.
- Na ééndag van de LPS-stimulatie, vlekken sommige DC cellen met antilichamen tegen muis CD11c, MHCII en Gr-1 DC differentiatie te controleren door flowcytometrie. Een voorbeeld van flowcytometrie analyse van DCs wordt getoond in figuur 3A en 3B.
- Incubeer DCs (5 x 10 5 cellen / monster) met een anti-muizen-CD16 / CD32 monoklonaal antilichaam bij 2,5 ug / ml eindconcentratie in 50 ul PBS / BSA / EDTA-buffer per monster. Daarna voeg 50 ul van de antilichamen tegen MHCII (IA / IE), CD11c en Gr-1 geconjugeerd met verschillende fluorochromen bij 1: 100, 1: 200 en 1: 500 in PBS / BSA / EDTA buffer respectievelijk.
- Tenslotte wassen DCs met PBS / BSA / EDTA-buffer en geanalyseerd door flowcytometrie volgens het protocol van de fabrikant.
Opmerking: Als de cellen zijn goed gedifferentieerde cellen zijn klaar voor antigeen laden.
- Wassen DCs RPMI met 10% FBS (zonder antibiotica) en incubeer ze met 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) op een kunststof buis 1 ml RMPI 10% FBS medium per 5 x 10 6 DCs gedurende minimaal 1 uur bij 37 * C. Als een negatieve controle, laat DC zonder incubatie met OVAp.
- Infectie van DCs
- Infect DCs bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën (10 bacteriën per DC) gedurende 1 uur in een CO2-incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Wash DC cellen 3x in PBS en 1 x in RMPI 10% FBS en centrifugeer bij 450 xg om zo extracellulair bacterieën. Tenslotte hersuspenderen cellen in RMPI 10% FBS medium (zonder antibiotica) en 20 x 10 6 cellen / ml.
2. Isolatie van CD4 + T lymfocyten van OTII transgene muizen
Opmerking: Figuur 1 geeft een overzicht van deze tweede stap. Lymfeklieren worden gebruikt in plaats van milt CD4 + T-cellen te isoleren, omdat het aandeel van CD4 + lymfocyten in lymfeklierens (~ 50%) groter is dan in de milt (~ 25%) en dat de zuivering zou effectiever zijn.
- Maak Single-cell Opschorting van de lymfeklieren
- Verwijder lies, oksel, brachiale, cervicale en mesenterische lymfklieren 23 van OTII transgene muizen en overbrengen in een plastic schaal met 10 ml RPMI 10% FBS medium.
- Grind lymfeklieren onder een steriele kap met twee frosted microscoopglaasjes. Plaats lymfeklieren op een matte kant van een microscoopglaasje, en wrijf met een matte kant van de tweede schuif totdat organen grond zijn geweest.
- Was enkele celsuspensie in PBS / BSA / EDTA buffer.
- Filter de cellen hoewel een cel zeef (70 um) om bindweefsel te verwijderen en wassen met PBS / BSA / EDTA buffer.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml ACK lysisbuffer en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te elimineren.
- Isolatie van CD4 + T cellen
- Was opnieuw als in stap 2.1.3 en tellencellen te resuspenderen in 100 x 10 6 cellen / ml in PBS / BSA / EDTA buffer. Voeg gebiotinyleerde antilichamen tegen CD8, IgM, B220, CD19, MHC klasse II (I-Ab), CD 11 b, CD 11 c en DX5 op 1: 250 gedurende 30 min op ijs latere negatieve selectie van CD4 + T-cellen.
- Was de cellen in PBS / BSA / EDTA-buffer en incubeer de cellen (100 x 10 6 cellen / ml) met streptavidine microkorrels met een concentratie aanbevolen protocol van de fabrikant gedurende 15 min op ijs.
- Was de cellen in PBS / BSA / EDTA-buffer en filteren hoewel een cel zeef (30 um) voor CD4 + T cel isolatie.
- Isoleer CD4 + T-cellen door negatieve selectie met een magnetische celscheiding machine volgens protocol van de fabrikant.
- Tel de cellen en breng de 4 x 10 6 cellen / ml met RPMI 10% FBS medium (zonder antibiotica).
- Vast te stellen en te houden op het ijs geïsoleerd CD4 + T-cellen (3 x 10 5 cellen) om de zuiverheid van stroom te controlerencytometer beschreven 24. Een voorbeeld van CD4 + T-cellen zuivering wordt getoond in figuur 3C.
3. T-cel Transinfection Metingen door Gentamicin Protection Assay
Opmerking: Figuur 2 geeft een overzicht van deze derde stap van het protocol.
- T-cel Transinfection
- Incubeer geïsoleerde CD4 + T-cellen met geïnfecteerde DC cellen (1: 1) (de DCs werden gedurende 1 uur en gewassen te elimineren vrije bacteriën) gedurende 30 min immuun synapsvorming toe in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Voeg 0,5 ml van geïsoleerde CD4 + T-cellen (2 x 10 6 cellen) en 0,1 ml van geïnfecteerde DC (2 x 10 6 cellen) op een 24-well kweekplaat. Als negatieve controle infecteren direct 0,5 ml van CD4 + T-cellen bij een MOI van 10 bacteriën gedurende 30 min.
- Omvat extra controles scheiden geïnfecteerde DC van T cellen met behulpeen polycarbonaat transwell barrière (met 3 micrometer poriegrootte), belemmeren DC-T fysiek contact. Voeg 0,1 ml van DCs in de transwell en 0,5 ml van CD4 + T-cellen in het onderste compartiment van het putje (24-putjes plaat).
- Tenslotte voorzien RMPI medium totdat er 0,6 ml in elk putje gelijke volumes maken in alle monsters.
- Na 30 min immune synapsvorming, voeg 100 ug / ml gentamicine en incubeer gedurende 1 uur voor het verzamelen van cellen in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Opnieuw isolatie van CD4 + T cellen
- Verzamelen van niet-hechtende cellen en resuspendeer ze in PBS / BSA / EDTA buffer. De meeste van DCs blijven aan de plastic cultuur plaat bevestigd. Vortexbuizen zachtjes naar cel desaggregatie garanderen. Blijf 500 ul cel supernatant als controle blijkt dat gentamicine goed heeft gewerkt.
- Opnieuw isoleren CD4 + T-cellen uit monsters die DC en T-cellen bevatten samen als in stap 2,2, Hoewel de meeste van de DCs op de plaat moeten bevestigd. Houd de monsters op ijs. Rekening houden met enige experimenten met minder dan 2% verontreiniging. Een voorbeeld van CD4 + T-cellen na zuivering transinfection is getoond in figuur 3D.
- Lyse T-cellen en Seed ze op Bacteriën Medium-agar platen.
- Was CD4 + T-cellen tweemaal met PBS.
- Tel de cellen en resuspendeer ze op 2 x 10 6 cellen / ml in PBS.
- Voeg 500 ul van 0,1% Triton X-100 in 500 pl T-cellen te lyseren op 1 x 10 6 cellen / ml, loslaten van de intracellulaire bacteriën uit de T-cellen.
- Maak 3 seriële verdunningen van gelyseerde cellen en zaad 50 ul van elke verdunning op bacteriën medium agarplaten. Verdeel platen in 4 porties en het zaad van de verschillende verdunningen van gelyseerde cellen in elk deel. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 4.
- Als controle, ook de plaatopgeslagen celsupernatant van de conjugaten op agar, dat gentamicine zorgen heeft goed gewerkt. Plaat ook geïnfecteerde DC's als een extra controle. Indien treedt vanaf DCs verontreinigingen (<2%), aftrekken van de kolonievormende eenheden (CFU) gevonden lage DC verontreiniging.
4. Kwantificering van T-cel Transinfection door flowcytometrie
Opmerking: Figuur 2 geeft een overzicht van deze stap.
- T Cell Transinfection
- Infect BMDCs zoals in stap 1,3, maar gebruik GFP tot expressie brengende bacteriën in dit geval.
- Vlek CD4 + T-cellen (geïsoleerd uit lymfeknopen in stap 2,2) met een cel tracker chloormethyl aminocoumarin (CMAC) gedurende 30 min bij 37 ° C volgens het protocol van de fabrikant.
- Was gelabelde CD4 + T-cellen tweemaal met RMPI 10% FBS (zonder antibiotica).
- Incubeer geïnfecteerde DC (na 1 uur incuberen met bacteriën) met gelabelde CD4 +T-cellen gedurende 30 min immuun synapsvorming toestaan bij 37 * C onder alle controles waarin in stap 3.1.1.
- Kleuring van geïnfecteerde CD4 + T cellen
- Na 30 min DC-T immune synapsvorming, verzamel cellen en wassen in PBS / BSA / EDTA.
- Na twee wassingen met PBS / BSA / EDTA-buffer, afzonderlijke geaggregeerde cellen door voorzichtig vortexen de buizen.
- Bevestig de monsters in 0,2 ml / buis met PBS dat 3% PFA gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Was ze vervolgens in PBS.
- Incubeer met anti-muizen-CD16 / CD32 monoklonaal antilichaam (2,5 ug / ml) in 50 ul / monster PBS / BSA / EDTA gedurende 15 min op ijs met Fc receptoren van dendritische cellen te blokkeren.
- Voeg een konijn anti-bacterie-antilichaam (10 ug / ml eindconcentratie) in 50 ul / monster PBS / BSA / EDTA gedurende 30 min op ijs extracellulaire bacteriën kleuren.
- Was de cellen met PBS / BSA / EDTA en incuberen met een antilichaam tegen CD 11 c muis geconjugeerd met fycoerytrine (PE) en SEcondary antilichaam tegen konijn, geconjugeerd met andere fluorochroom zoals Alexa-Fluor 647 in 1: 200 in 100 ul / monster PBS / BSA / EDTA gedurende 30 min op ijs.
- Was de cellen en monsters geanalyseerd door flow cytometrie. Niet vergeten een monster transinfected T-cellen met niet-fluorescerende bacteriën als negatieve controle en monsters gelabeld met één van elk fluorochroom gebruikt in het experiment om de monsters te compenseren en pas de flowcytometrie instellingen 25 omvatten. Representatieve analyse wordt getoond in figuur 5.
Opmerking: Als de bacteriën geen GFP tot expressie, intracellulaire en extracellulaire bacteriën, label extracellulaire bacteriën te onderscheiden, repareren en doorlaatbaar monsters met Triton X-100 bij 0,5% in PBS gedurende 5 min. Daarna vlek totale bacteriën (intracellulaire + extracellulair) met een verschillend fluorochroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hierin beschreven we hoe muizen T-cel bacteriële transinfection uitvoeren van geïnfecteerde beenmerg afgeleide-DC's en hoe bacteriële transinfection meten via twee verschillende benaderingen: flowcytometrie en gentamicine survival test Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure om de cellen te verkrijgen.. DCs gegenereerd door incubatie van beenmergcellen met GM-CSF gedurende 9 dagen. Vervolgens worden DCs gerijpt met LPS te verhogen MHCII op zijn membraan te laden later met een specifiek peptide met OVA (OVAp). Als controle sommige DCs niet geladen met OVAp. Beide DCs (OVAp geladen en niet-geladen) worden geïnfecteerd bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën. Anderzijds, worden CD4 + T-cellen geïsoleerd uit lymfeknopen van OTII transgene muizen, waarin de specifieke OVAp herkent. Figuur 2 geeft de procedure uit te voeren en te kwantificeren T cel transinfection inclusief passende negatieve controles. Zoals described voor zijn sommige DCs niet geladen met OVAp. In dit geval is er een wisselwerking tussen DC en T-cellen, maar niet immuun synapsvorming door het ontbreken van OVAp. Een extra controle opgenomen, scheiden DC en T-cellen met een polycarbonaat transwell barrière (met 3 urn poriegrootte), welke gelijkstroom-T fysiek contact belemmert. DC's zijn opgenomen in de transwell; als gevolg daarvan niet in staat door deze poriën te passen. Een andere negatieve controle is ook opgenomen, de directe T-cel infectie door incubatie van T-cellen direct bij een MOI van 10 bacteriën. T-cel transinfection kan worden gekwantificeerd door twee benaderingen: flowcytometrie of gentamicine survival test. Meten van flowcytometrie, DC moeten zijn eerder geïnfecteerd met bacteriën-GFP en CD4 + T-cellen te kleuren met een cel tracker (T-cellen-blauw). Na conjugaat vormen, dient de cellen gekleurd met antilichamen tegen DCs (CD11c-PE). Het extracellulaire bacteriën moeten worden gebeitst teneinde quantify het percentage geïnfecteerde CD4 + T-cellen door flowcytometrie later. Om transinfection door gentamicine overleven test te meten, worden de cellen geïncubeerd met gentamicine gedurende 1 uur tot extracellulaire bacteriën te doden, dan is T-cellen worden opnieuw geïsoleerd om zaad op agar plaat. Decimale seriële verdunningen gemaakt tot 50 pi van elke verdunning op agar plaat zaad en het tellen van CFU vergemakkelijken.
Zoals getoond in figuur 3, heeft DC differentiatie worden gecontroleerd door flow cytometrie (figuur 3A en 3B). DCs moeten CD11c en MHCII (figuur 3A) en niet Gr-1, dat een merker van neutrofielen tot expressie. Zoals weergegeven in figuur 3B, een aantal neutrofielen (3,27% van Gr-1 +, MHC -) werden in cultuur, maar DCs cultuur met meer dan 5% van neutrofielen verontreinigingen niet worden gebruikt. CD4 + T-cellen zuiverheid worden gecontroleerd na isolatie van lymph nodes (figuur 3C) en na afscheiding van DCs conjugaten formatie (Figuur 3D). Rekening houden met de experimenten met minder dan 2% van de verontreinigingen na conjugaten formatie.
Figuur 4 toont een voorbeeld van T transinfection experiment met Salmonella. Zoals weergegeven in figuur 4A, worden de platen verdeeld in vier porties met seriële verdunningen in elk deel. Salmonella gegroeid op LB agar platen en kolonievormende eenheden te tellen zaad. Zoals getoond in figuur 4A, Salmonella werd gevangen door T-cellen van geïnfecteerde DC en dit proces werd duidelijk verbeterd met OVAp herkenning (platen links in Figuur 4A en Figuur 4B). Echter, wanneer er een fysieke barrière het contact tussen DC en T-cellen belemmeren, was er nagenoeg geen transinfection, zoals bij het doen van een directe T cel infectie (platen rechts in figuur 4A en figuur 4B).
Zoals getoond in figuur 5, kan T cel transinfection worden gekwantificeerd door flow cytometrie middel van bacteriën tot expressie heldere GFP. DC en T-cellen kunnen worden gedifferentieerd op grootte en complexiteit in een voorwaartse en zijwaartse verstrooiing plot, maar verschillende merkers kan worden gebruikt om goed te onderscheiden. CD4 + T-cellen werden gelabeld met een cel tracker (CMAC) en DCs met een antilichaam tegen CD 11 c. Extracellulaire bacteriën werden gekleurd met een konijn-antilichaam tegen Salmonella en secundaire antilichaam anti-konijn geconjugeerd met Alexa Fluor 647. Derhalve is het percentage geïnfecteerde CD4 + T-cellen kan worden gekwantificeerd ze gelabeld met CMAC (niet met CD11c-PE) uitgedrukt GFP (bacterie-GFP), maar ze waren niet gekleurd met het antilichaam tegen extracellulaire bacteriën (Alexa Fluor 647).
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1. Stroomdiagram van DC genereren en CD4 + T-cellen geïsoleerd. Aan de linkerkant van de figuur, het proces dendritische cellen (DC's) van beenmergcellen differentiëren gedetailleerd. Na ontleden dijbenen en scheenbenen, worden beenmergcellen uit het inwendige van de botten. Daarna rode bloedcellen (RBC) worden gelyseerd en beenmerg cellen worden gekweekt met recombinant Muis granulocyt macrofaag-kolonievormende stimulerende factor (GM-CSF) gedurende 9 dagen. Zodra ze zijn goed gedifferentieerd, zijn DCs geïncubeerd met lipopolysaccharide (LPS) aan major histocompatibility complex II (MHCII) expressie te verhogen. Vervolgens worden geladen DCs met een specifiek peptide ovoalbumin (OVAp) en geïnfecteerd met een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën. Sommigen van hen zijn niet geladen met OVAp als controle. Aan de rechterkant van het cijfer, hoeisoleren CD4 + T-cellen uit OTII transgene muizen wordt weergegeven. Lymfeklieren (LN) zijn verwijderd en de grond, het verkrijgen van een single-cell suspensie. Tenslotte worden CD4 + T-cellen geïsoleerd door negatieve selectie met behulp van een magnetische cel scheiding machine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Stroomdiagram van T-cel transinfection procedure. Geïnfecteerde (bacteriën zijn weergegeven in groen) en OVAp beladen DC (rode cellen) geïncubeerd met CD4 + T-cellen (blauwe cellen) om immune synapsvorming toestaan. Geïnfecteerde DC (niet geladen met OVAp) ook geïncubeerd met T cellen, waardoor interactie tussen beide cellen zonder immune synapsvorming. Een extra controle opgenomen, scheiden CD4 + Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Flow cytometer analyse van beenmerg afgeleide-DC en geïsoleerde CD4 + T-cellen. Vertegenwoordiger dot plots van beenmerg afgeleide-DCs door geanalyseerdflowcytometrie. (A) DC's uitgedrukt MHCII en CD11c (85,8%; kwadrant rechtsboven) (B) DC uitgedrukt MHCII maar niet Gr-1 (85%; kwadrant rechtsonder). Er was echter een 3,27% cellen die Gr-1 maar niet MHCII cellen (kwadrant linksboven) uitgedrukt. Deze cellen waren licht verontreinigde neutrofielen. (C en D) Histogrammen die de zuiverheid van CD4 + T-cellen geïsoleerd van de lymfeklieren (C), en na conjugaat formatie met dendritische cellen (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. T cel transinfection gekwantificeerd door gentamicine survival test. LB-agarplaten werden verdeeld in 4 porties overeenkomend met decimal seriële verdunningen van gelyseerde CD4 + T-cellen. (A) kolonievormende eenheden Salmonella enterica gegroeid op LB agarplaten overeenkomen met T-cel transinfection in aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van OVAp op het oppervlak van geïnfecteerde DC en in omstandigheden waarbij DC / T-cel contact (- TW) of in aanwezigheid van een fysieke barrière te belemmeren dergelijke contacten (+ TW). Een leeg bord overeenkomt met directe T-cel infectie (negatieve controle), wordt ook getoond. Er was bijna geen transinfection bij DC / T-cel contact werd belemmerd (+ TW). (B) Kwantificering van kolonievormende eenheden (CFU's) van verscheidene experimenten die de snelheid van bacteriële vastgelegd door T-cellen van geïnfecteerde DC. Direct T-cel infectie, en voorwaarden belemmeren DC / T-cel contact produceren weinig tot geen niveaus van de T-cel infectie. Wanneer DC / T-cel contacten toegestaan, was T-cel transinfection, en het was door antigen herkenning (+ OVAp). Kolom balken geven het gemiddelde van 3 independent experimenten. Fout balken geven de SD. Significante verschillen worden voorgesteld door ***, overeenkomend met p <0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. T cel transinfection gekwantificeerd door flowcytometrie. Vertegenwoordiger dot plot tonen DC en T-cel conjugaten na transinfection proces. CD4 + T-cellen zijn klein en voorwaarts rond en zijwaartse verstrooiing (FCS - SSC) dot blot toont, en om goed gedifferentieerd te zijn, werden ze gekleurd met een cel tracker (CMAC). DCs expressie CD11c niet gelabeld met CMAC en groter dan T CD4 + T-cellen met een onregelmatige vorm. Geïnfecteerde CD4 + T-cellen met intracellulaire bacterie-GFP, maar negatief voor extracellaire bacteriën (6,19%) worden getoond in de rechter kwadrant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T-cellen of T-lymfocyten een soort leukocyten die een centrale rol in celgemedieerde immuniteit speelt en behoren tot de adaptieve immuunrespons 26. T-cellen zijn ongevoelig voor besmetting in vitro maar sommige rapporten geven aan dat ze kunnen worden geïnfecteerd in vivo 14,15. Het intieme contact van APC en T-cellen tijdens immunologische synaps dienen als platforms voor de uitwisseling van biologisch materiaal 13, zoals sommige virussen zoals HIV 11. Recent werd aangetoond dat in tegenstelling tot het dogma, T-cellen, het paradigma van cellen van adaptieve immuniteit, zijn ook in staat om efficiënt vangen van bacteriën transinfection van geïnfecteerde DC 11,16. Hierin zien we dat hij gedetailleerd protocollen bij T-cel bacteriële transinfection in vitro kwantificering van geïnfecteerde BMDCs.
T cel bacteriële transinfection was door antigeenherkenning 16. We toonden aan dat door CD4 + T-cellen geïsoleerd uitOTII transgene muizen het herkennen van een specifieke OVAp, BMDCs geladen met OVAp en muizen geïnfecteerd met verschillende bacteriën (hier gegevens worden gepresenteerd van Salmonella enterica). CD4 + T-cel geïsoleerd uit OTII muizen geïncubeerd met besmette DCs gedurende 30 min immuun synapsvorming toestaan. De hier gepresenteerde gegevens komen overeen met de bacteriën die T-cellen kan vastleggen van DCs in dit korte tijdsbestek. We weten dat langere blootstelling van T-cellen geïnfecteerd DC resulteerde in grotere bacteriële vangst (niet getoond), maar T-cellen ook uptaken bacteriën snel vernietigen kwantificatie van bacteriële transinfection optreedt gedurende langere DC / T cell tijd contacten moeilijk gebleken . Gentamicin survival assay is een zeer gevoelige methode voor T cel transinfection kwantificeren omdat het in staat is om een enkele bacterie infecteren 21 detecteren. Na incubatie met gentamicine die net extracellulaire bacteriën te doden, T-cellen worden geïsoleerd en gelyseerd om zaad op bacteriën medium agar plAtes. Het isoleren van T-cellen na vorming van conjugaten met DCs is een kritische stap in het protocol. Slechts experimenten met minder dan 2% verontreinigingen moet rekening worden gehouden. DC verontreiniging kan worden gemeten door stroming cytometrie en CFU overeenkomend met lage DC verontreinigingen worden afgetrokken. Als alternatief kunnen CD4 + T-cellen zuiverheid verbeterd worden door celsortering.
Een andere benadering voor kwantificering van T-cellen transinfection is door flowcytometrie met behulp GFP expressie bacteriën en labelen van de extracellulaire bacteriën met een compatibele fluorofoor. Een beperking van deze benadering is dat bacteriën een GFP dat voldoende licht voor het detecteren van geïnfecteerde cellen tegen de achtergrond autofluorescentie drukken. Als alternatief zou bacteriën worden gekleurd voordat infecteren DCs met een mobiele tracker. Een andere benadering is het kleuren van de extracellulaire bacteriën, permeabilisatie de T-cellen, dan labelen alle bacteriën (intracellulaire + extracellulair)met een ander fluorochroom.
Over toekomstige richtingen van dit protocol, proberen we het opzetten van een protocol om het aantal T-cellen die bacteriën na langere blootstelling gevangen besmet DC, met behulp van bacteriën versierd met magnetische deeltjes te kwantificeren. T-cellen vastleggen bacteriën zouden de magnetische deeltjes vast te houden en daarom moet het gemakkelijk te isoleren door magneten zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
