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Immunology and Infection

टी कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं से Transinfection द्वारा बैक्टीरिया पर कब्जा

Published: January 13, 2016 doi: 10.3791/52976
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2, 1
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

Summary

यहाँ एक प्रोटोकॉल पूर्व संक्रमित वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) से transinfection के माध्यम से प्रतिजन प्रस्तुति के दौरान होता है, जो सीडी 4+ टी कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल कब्जा को मापने के लिए प्रस्तुत किया है। प्राथमिक कोशिकाओं, डीसी, डीसी / टी सेल संयुग्म गठन के संक्रमण, और बैक्टीरियल टी सेल अभिकर्मक के माप का अलगाव: हम आवश्यक कदम प्रदर्शन करने के लिए कैसे दिखा।

Introduction

एक रोगज़नक़ अपने मेजबान को संक्रमित करते हैं, आमतौर पर बैक्टीरियल मंजूरी के लिए आवश्यक सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक सक्रियण है। सहज उन्मुक्ति सबसे अधिक संक्रमण से बचाता है कि रक्षा की पहली पंक्ति है। सहज उन्मुक्ति सूक्ष्मजीवों के व्यापक समूहों के बीच संरक्षित कर रहे हैं कि एक सटीक तरीका तत्वों (रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न, PAMPs) 1 में भेद। सहज उन्मुक्ति के तंत्र फ़ैगोसाइट (मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और वृक्ष के समान कोशिकाओं), मस्तूल कोशिकाओं, इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं में शामिल हैं जो शारीरिक ऐसी त्वचा के रूप में बाधाओं, रसायन बाधाओं (रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स, लाइसोज़ाइम) और जन्मजात ल्यूकोसाइट्स शामिल 2। इन कोशिकाओं को संपर्क के माध्यम से या रोगज़नक़ छा और हत्या भी शामिल है जो phagocytosis, के माध्यम से उन पर हमला करके या तो पहचान करने और रोगज़नक़ों को समाप्त। इस प्रणाली के पी के खिलाफ प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति प्रदान जो अनुकूली प्रतिरक्षा, के विपरीत, आजीवन रक्षा की अनुमति नहीं हैathogens। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली रक्षा की दूसरी पंक्ति है और समझते हैं और कई सूक्ष्म जीवाणु और गैर-माइक्रोबियल पदार्थों 3 के विशिष्ट एंटीजन करने के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम है। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के मुख्य घटक बी और टी कोशिकाओं में शामिल हैं जो लिम्फोसाइट्स, कर रहे हैं। बी कोशिकाओं रोगजनकों या exogenous प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी स्रावित, त्रिदोषन प्रतिक्रिया में शामिल कर रहे हैं। हालांकि, टी कोशिकाओं साइटोकिन्स स्राव या हत्या रोगज़नक़ संक्रमित कोशिकाओं 4 के साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियमन, सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा में प्रतिनिधित्व करते हैं।

परिसर प्रमुख उतक अनुरूपता (एमएचसी) 5-7 से कोशिका की सतह पर प्रस्तुत कर रहे हैं, जो एंटीजन, में phagocytose रोगज़नक़ों और प्रक्रिया जीवाणु घटकों को पहचान सकते हैं वृक्ष के समान कोशिकाओं या मैक्रोफेज, सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के घटक, सहित प्रतिजन कोशिकाओं (APCs)। APCs रोगजनकों phagocytized करने के बाद, वे आम तौर पर वे टी के साथ बातचीत जहां निकासी लिम्फ नोड्स, की ओर पलायनकोशिकाओं। टी lymphocytes उनकी टी सेल रिसेप्टर्स द्वारा विशिष्ट पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों को पहचान सकते हैं। प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन (है) प्रतिजन प्रस्तुति 8,9 दौरान एक प्रतिजन से भरी हुई एपीसी और एक लिम्फोसाइट के बीच इंटरफेस में होता है। कुछ बैक्टीरिया phagocytosis जीवित है और APCs के भीतर व्यवस्थित का प्रसार कर सकते हैं। इस दृश्य में, संक्रमित APCs बैक्टीरियल जलाशयों या बैक्टीरियल प्रसार 10 की सुविधा है कि "ट्रोजन घोड़ों" के रूप में काम करते हैं। APCs और आईएस गठन के दौरान उस जगह ले लिम्फोसाइटों के बीच घनिष्ठ संपर्क भी झिल्ली, आनुवंशिक सामग्री और exosomes के हिस्से के आदान-प्रदान के लिए एक मंच के रूप में कार्य और टी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए कुछ वायरस के लिए अपहरण किया जा सकता है; इस प्रक्रिया transinfection 11-13 कहा जाता है।

कुछ रोगजनक बैक्टीरिया (लिस्टेरिया monocytogenes, साल्मोनेला enterica और शिगेला flexneri) विवो में टी lymphocytes आक्रमण और उनके व्यवहार को 14-16 संशोधित करने के लिए सक्षम हैं। हमारे पास हैहाल ही में टी lymphocytes भी प्रतिजन प्रस्तुति 16 के दौरान पहले से संक्रमित वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) से transinfection द्वारा बैक्टीरिया कब्जा करने में सक्षम हैं कि वर्णन किया। टी सेल प्रत्यक्ष संक्रमण से (1,000-4,000x) निहायत अधिक प्रभावी transinfection द्वारा बैक्टीरियल कब्जा। Transinfection से दर्शाते हुए टी कोशिकाओं पर कब्जा पैथोजन तथा गैर-रोगजनक बैक्टीरिया टी कोशिकाओं द्वारा संचालित एक प्रक्रिया है। आश्चर्यजनक, कोशिकाओं के तेजी से कब्जा कर लिया बैक्टीरिया को मार डाला और पेशेवर फ़ैगोसाइट 16 से इतनी अधिक कुशलता से किया था टी (चूची) transinfected। इम्यूनोलॉजी की हठधर्मिता तोड़ने जो ये परिणाम, अनुकूली प्रतिरक्षा की कोशिकाओं को सहज उन्मुक्ति का माना जाता है कि अनन्य थे कि कार्य कर सकते हैं कि पता चलता है। इसके अलावा, हम तैसा कोशिकाओं समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की बड़ी मात्रा में स्रावित और इन विवो में बैक्टीरिया के संक्रमण से बचाने के दिखाया।

यहाँ हम में बैक्टीरिया transinfection प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल अलग प्रोटोकॉल पेशएक माउस मॉडल। यह मॉडल जीवाणु से संक्रमित हड्डी के साथ विशेष बातचीत कि मैं अटल बिहारी 17 के संदर्भ में ओवीए (OVAp) की पेप्टाइड 323-339 के लिए एक TCR विशिष्ट सहन जो ट्रांसजेनिक OTII चूहों से सीडी 4+ टी कोशिकाओं के उपयोग पर आधारित है marrow- स्थिर प्रतिरक्षा synapses के गठन OVAp के साथ भरी हुई व्युत्पन्न DCs (BMDCs) 18,19,।

टी सेल transinfection कल्पना और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रवाह cytometry हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 16,20 व्यक्त बैक्टीरिया द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का लाभ लेने से संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, टी सेल transinfection एक और अधिक संवेदनशील दृष्टिकोण, घटनाओं की एक बड़ी संख्या की माप की अनुमति देता है कि जेंटामाइसिन अस्तित्व परख द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। जेंटामाइसिन कोशिकाओं घुसना नहीं कर सकते हैं कि एक एंटीबायोटिक है। इसलिए, इस एंटीबायोटिक का उपयोग कर एंटीबायोटिक इसके अलावा मंगलवार बच गया है कि इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के भेदभाव की अनुमति देता है21 मारे गए थे कि ओम बाह्य वाले।

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Protocol

नोट: प्रायोगिक प्रक्रिया Universidad ऑटोनोमा डे मैड्रिड के अनुसंधान आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और स्पेनिश और यूरोपीय दिशा निर्देशों के अनुसार पशु कल्याण और स्वास्थ्य के Universidad ऑटोनोमा डे मैड्रिड हेड की देखरेख में आयोजित की गई। चूहे विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) के आवास में नस्ल थे और वे कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर प्रशिक्षित और योग्य कर्मियों (सीओ 2) साँस लेना विधि द्वारा euthanized थे।

1. माउस अस्थि डीसी भेदभाव और संक्रमण मज्जा व्युत्पन्न

नोट: चित्रा 1 इस दिशा में पहला कदम सार। सभी प्रक्रियाओं केवल बाँझ मीडिया, उपकरणों, पिपेट सुझाव और संस्कृति व्यंजन का उपयोग करते हुए, इस बात से हुड में बाहर किया जाना चाहिए।

  1. माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCs भेदभाव
    1. एक C57 / BL6 माउस 22 से tibias और femurs काटना और RPMI माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ एक प्लास्टिक पकवान में हस्तांतरण। बाँझ कैंची से, प्रत्येक एपिफ़ीसिस काट दिया और एक विशेषता चमकदार लाल रंग की है जो अस्थि मज्जा, बेनकाब।
    2. एक बाँझ पेट्री पर एक बाँझ सिरिंज का उपयोग कर 0.5% गोजातीय सीरम albumin युक्त फॉस्फेट बफर खारा के 10 मिलीलीटर (पीबीएस) (बीएसए) और 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (पीबीएस / बीएसए / EDTA बफर) के साथ हड्डी के अंदर दिखे पकवान।
    3. एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में 600 XG पर एक ट्यूब में सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज लीजिए।
    4. अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) lysing बफर (0.15 एम एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3 और 0.1 मिमी EDTA) के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और लाल रक्त कोशिकाओं को खत्म करने के लिए आरटी पर 30 सेकंड के लिए सेते हैं।
    5. गुच्छों को छानने से सफाया कर रहे थे, क्योंकि एक ही गति (600 XG) पर centrifuging से पहले हड्डी के टुकड़े और सेल clumps को हटाने के लिए एक सेल झरनी (70 माइक्रोन) के माध्यम से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ 1640 RPMI माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और फिल्टर।
    6. कोशिकाओं की गणना एकडी RPMI 10% FBS (युक्त 50 माइक्रोन बी-mercaptoethanol, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट) के साथ 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल को समायोजित करने और 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक murine granulocyte बृहतभक्षककोशिका colony- उत्तेजक कारक (आरएम जीएम- सीएसएफ) जोड़ने एक अंतिम एकाग्रता के रूप में।
    7. सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक बाँझ, सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता, 15 सेमी पेट्री डिश, और संस्कृति के लिए इस निलंबन जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
    8. हर तीन दिन, 20 एनजी / एमएल RM-जीएम- CSF युक्त ताजा माध्यम के साथ, सेल घनत्व के 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर गैर पक्षपाती कोशिकाओं और पीबीएस में 5 मिमी EDTA के साथ अलग कोशिकाओं और resuspend दोनों नीचे स्पिन।
  2. डीसी और एंटीजन लोड हो रहा है की परिपक्वता
    1. 9 दिन में, 20 एनजी / एमएल RM-जीएम- CSF युक्त मध्यम में घनत्व के 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspend। तब कोशिकाओं पर उच्च एमएचसी-द्वितीय अभिव्यक्ति की अनुमति है और 24 घंटे के लिए एक गैर टिशू कल्चर इलाज बाँझ 15 सेमी पेट्री डिश में सेते 20 एनजी / lipopolysaccharide (एलपीएस) की मिलीलीटर जोड़ें।
    2. एक के बादएलपीएस उत्तेजना के दिन, प्रवाह cytometry द्वारा डीसी भेदभाव की जांच करने के लिए माउस CD11c, MHCII और जीआर 1 खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कुछ डीसी कोशिकाओं दाग। डीसी के प्रवाह cytometry विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 3 ए और 3 बी में दिखाया गया है।
      1. नमूना प्रति 50 μl पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में अंतिम एकाग्रता के 2.5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में एक विरोधी माउस CD16 / CD32 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ DCS (5 x 10 5 कोशिकाओं / नमूना) सेते हैं। बाद में, MHCII (आइए / आईई) के खिलाफ एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ने, CD11c और 1 पर अलग fluorochromes साथ संयुग्मित जीआर 1: 100, 1: 200 और 1: क्रमश: पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में 500।
      2. अंत में, पीबीएस / बीएसए / EDTA बफर के साथ डीसी धोने और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण।
        नोट: कोशिकाओं में अच्छी तरह से भेदभाव कर रहे हैं, तो कोशिकाओं प्रतिजन लोड करने के लिए तैयार हैं।
    3. धो RPMI के साथ डीसी 10% (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) FBS और 10 माइक्रोग्राम / एमएल OTII OVAp (ओवीए 323-339 के साथ उन्हें सेते हैं; ISQA37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए 5 एक्स 10 6 डीसी प्रति RMPI 10% FBS के माध्यम से 1 मिलीलीटर में एक प्लास्टिक ट्यूब पर VHAAHAEINEAGR)। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, OVAp साथ incubating बिना डीसी छोड़ दें।
  3. डीसी का संक्रमण
    1. सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 10 बैक्टीरिया (डीसी 10 प्रतिशत बैक्टीरिया) के संक्रमण की बहुलता (MOI) पर डीसी को संक्रमित (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
    2. धो डीसी कोशिकाओं को बाह्य बैक्टीरिया का सबसे धोने के क्रम में RMPI 10% FBS और 450 XG पर अपकेंद्रित्र में पीबीएस और 1x में 3x। अंत में, 20 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) RMPI 10% FBS के माध्यम में resuspend कोशिकाओं।

OTII ट्रांसजेनिक चूहों से सीडी 4+ टी लिम्फोसाइटों के 2. अलगाव

नोट: चित्रा 1 इस दूसरे चरण का सार। लिम्फ नोड्स, बजाय सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए तिल्ली का इस्तेमाल किया जाना चाहिए लिम्फ नोड में सीडी 4 के अनुपात + लिम्फोसाइट क्योंकिएस (~ 50%) तिल्ली (~ 25%) और इसलिए शुद्धि अधिक प्रभावी हो जाएगा की तुलना में बड़ा है।

  1. लिम्फ नोड्स की एकल कोशिका सस्पेंशन बनाओ
    1. OTII ट्रांसजेनिक चूहों से 23 नोड्स वंक्षण, कक्षा, बाहु, ग्रीवा और mesenteric लिम्फ निकालें और RPMI 10% FBS के माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ एक प्लास्टिक पकवान में हस्तांतरण।
    2. दो तुहिनाच्छादित खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग कर एक बाँझ हुड के तहत पीस लिम्फ नोड्स। एक खुर्दबीन स्लाइड के एक तुहिनाच्छादित तरफ लिम्फ नोड्स, जगह और अंगों भूमि की गई है, जब तक दूसरी स्लाइड की तुहिनाच्छादित पक्ष के साथ रगड़ें।
    3. पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में एकल कक्ष निलंबन धो लें।
    4. एक सेल झरनी (70 माइक्रोन) संयोजी ऊतक को हटाने और पीबीएस / बीएसए / EDTA बफर के साथ धोने के लिए हालांकि कोशिकाओं फ़िल्टर।
    5. एसीके lysis बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और लाल रक्त कोशिकाओं को खत्म करने के लिए आरटी पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव
    1. कदम 2.1.3 और गिनती में के रूप में फिर से धोनाकोशिकाओं पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में 100 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर उन्हें resuspend। 1 पर सीडी 8, आईजीएम, B220, CD19, MHC वर्ग द्वितीय (मैं अटल बिहारी), CD11b, CD11c और DX5 के खिलाफ biotinylated एंटीबॉडी जोड़ें: 250 30 मिनट के लिए बर्फ पर सीडी 4+ टी कोशिकाओं की बाद में नकारात्मक चयन के लिए।
    2. पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में कोशिकाओं को धो लें और बर्फ पर 15 मिनट के लिए निर्माता प्रोटोकॉल में सिफारिश की एकाग्रता में streptavidin microbeads के साथ कोशिकाओं (100 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) सेते हैं।
    3. पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में कोशिकाओं को धो लें और सीडी 4+ टी सेल अलगाव से पहले एक सेल झरनी (30 माइक्रोन), हालांकि उन्हें फिल्टर।
    4. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक चुंबकीय सेल जुदाई मशीन का उपयोग नकारात्मक सेलेक्शन सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग।
    5. कोशिकाओं की गणना और (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) RPMI 10% FBS के माध्यम के साथ 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए समायोजित करें।
    6. फिक्स और प्रवाह से शुद्धता की जांच करने के लिए बर्फ पृथक सीडी 4+ टी कोशिकाओं (3 एक्स 10 5 कोशिकाओं) पर रखके रूप में कोशिकामापी 24 में वर्णित है। सीडी 4+ टी कोशिकाओं शुद्धि का एक उदाहरण चित्र -3 सी में दिखाया गया है।

3. टी सेल Transinfection मापन Gentamicin संरक्षण परख द्वारा

नोट: चित्रा 2 प्रोटोकॉल के इस तीसरे चरण का सार।

  1. टी सेल Transinfection
    1. संक्रमित डीसी कोशिकाओं (1: 1) के साथ अलग सीडी 4+ टी कोशिकाओं को सेते सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस में प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन की अनुमति के लिए 30 मिनट के लिए (डीसी 1 घंटे के लिए संक्रमित और समाप्त करने के लिए धोया गया मुक्त बैक्टीरिया), 5% सीओ 2)।
    2. जोड़ें पृथक सीडी 4+ टी कोशिकाओं (2 एक्स 10 6 कोशिकाओं) और एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली पर संक्रमित DCS (2 एक्स 10 6 कोशिकाओं) का 0.1 मिलीग्राम के 0.5 मिलीलीटर। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 30 मिनट के लिए 10 जीवाणुओं की एक MOI में सीधे 0.5 मिलीलीटर सीडी 4+ टी कोशिकाओं के संक्रमित।
    3. का उपयोग करते हुए टी कोशिकाओं से संक्रमित डीसी को अलग करने के लिए अतिरिक्त नियंत्रण शामिलडीसी टी शारीरिक संपर्क बाधा (ताकना आकार के 3 माइक्रोन) के साथ एक पॉली कार्बोनेट transwell बाधा,। अच्छी तरह से (24 अच्छी तरह से थाली) के निचले डिब्बे में 0.1 transwell अंदर डीसी की मिलीग्राम और सीडी 4+ टी कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. अंत में, RMPI मध्यम के साथ पूरा सभी नमूनों में बराबर मात्रा बनाने के लिए प्रत्येक कुएं में 0.6 मिलीलीटर नहीं है जब तक।
    5. प्रतिरक्षा synapse गठन के 30 मिनट के बाद, जेंटामाइसिन के 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ने और सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पहले 1 घंटे के लिए सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
  2. पुन अलगाव सीडी 4+ टी कोशिकाओं की
    1. गैर पक्षपाती कोशिकाओं को इकट्ठा और पीबीएस / बीएसए / EDTA के बफर में resuspend। डीसी के अधिकांश प्लास्टिक संस्कृति की थाली में जुड़े रहते हैं। भंवर ट्यूबों धीरे सेल disaggregation सुनिश्चित करने के लिए। जेंटामाइसिन अच्छी तरह से काम किया है कि दिखाने के लिए नियंत्रण के रूप में सेल सतह पर तैरनेवाला के 500 μl रखें।
    2. 2.2 कदम के रूप में एक साथ डीसी और टी कोशिकाओं होते हैं कि नमूनों से सीडी 4+ टी कोशिकाओं को फिर से अलग-थलग, डीसी की हालांकि सबसे प्लेट पर संलग्न किया जाना चाहिए था। बर्फ पर नियंत्रण के नमूने रखें। खाते में कम से कम 2% संदूषण के साथ ही प्रयोगों ले लो। Transinfection के बाद सीडी 4+ टी कोशिकाओं शुद्धि का एक उदाहरण चित्रा 3 डी में दिखाया गया है।
  3. Lyse टी कोशिकाओं और बैक्टीरिया मध्यम अगर प्लेटों पर उनके बीज।
    1. पीबीएस के साथ दो बार सीडी 4+ टी कोशिकाओं को धो लें।
    2. कोशिकाओं की गणना और पीबीएस में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर उन्हें resuspend।
    3. टी कोशिकाओं के बाहर इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया रिहा, 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर उन्हें lyse करने के लिए टी कोशिकाओं के 500 μl में 0.1% ट्राइटन X-100 के 500 μl जोड़ें।
    4. Lysed कोशिकाओं के 3 सीरियल दशमलव dilutions बनाओ और बैक्टीरिया मध्यम अगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 50 μl बीज। 4 भागों में प्लेटों फूट डालो और प्रत्येक भाग में lysed कोशिकाओं के विभिन्न dilutions के बीज। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में दिखाया जाता है।
      1. एक नियंत्रण के रूप में, यह भी थालीकि जेंटामाइसिन सुनिश्चित करने के लिए अगर पर conjugates के संग्रहीत सेल सतह पर तैरनेवाला, अच्छी तरह से काम किया है। इसके अलावा एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में संक्रमित डीसी थाली। मामले में कम डीसी संदूषण (<2%), कम डीसी संदूषण के लिए इसी कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) घटाना होता है।

4. मात्रा फ्लो द्वारा टी सेल Transinfection की

नोट: चित्रा 2 इस कदम का सार।

  1. टी सेल Transinfection
    1. 1.3 चरण में के रूप में BMDCs संक्रमित है, लेकिन इस मामले में GFP व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग करें।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार 37 से 30 मिनट के लिए एक सेल पर नजर रखने chloromethyl aminocoumarin (CMAC) के साथ (2.2 चरण में लिम्फ नोड्स से अलग) दाग सीडी 4+ टी कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस।
    3. दो बार (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) RMPI 10% FBS के साथ लेबल सीडी 4+ टी कोशिकाओं को धो लें।
    4. संक्रमित डीसी सेते लेबल सीडी 4+ के साथ (बैक्टीरिया के साथ 1 घंटा ऊष्मायन के बाद)30 मिनट के लिए टी कोशिकाओं कदम 3.1.1 में समझा सभी नियंत्रण सहित 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिरक्षा synapse गठन की अनुमति है।
  2. संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं का धुंधला
    1. डीसी टी प्रतिरक्षा synapse गठन के 30 मिनट के बाद, कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पीबीएस / बीएसए / EDTA में से धो लें।
    2. पीबीएस / बीएसए / EDTA बफर, धीरे नलियों vortexing से अलग एकत्रित कोशिकाओं के साथ दो washes के बाद।
    3. 0.2 मिलीग्राम / पीबीएस आरटी पर 15 मिनट के लिए 3% पीएफए ​​युक्त ट्यूब में नमूनों को ठीक करें। फिर पीबीएस में से धो लें।
    4. वृक्ष के समान कोशिकाओं के एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए बर्फ पर 15 मिनट के लिए पीबीएस / बीएसए / EDTA के 50 μl / नमूने में विरोधी माउस-CD16 / CD32 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ सेते हैं।
    5. कोशिकी बैक्टीरिया दाग बर्फ पर 30 मिनट के लिए 50 μl / पीबीएस / बीएसए / EDTA के नमूने में विरोधी बैक्टीरिया एंटीबॉडी (अंतिम एकाग्रता के रूप में 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के एक खरगोश जोड़ें।
    6. पीबीएस / बीएसए / EDTA के साथ कोशिकाओं को धो लें और phycoerythrin (पीई) के साथ संयुग्मित माउस CD11c के खिलाफ एक एंटीबॉडी और एक एसई के साथ सेतेखरगोश के खिलाफ condary एंटीबॉडी 1 पर एलेक्सा-स्त्राव 647 जैसे अन्य fluorochrome साथ संयुग्मित: बर्फ पर 30 मिनट के लिए पीबीएस / बीएसए / EDTA के 200 μl 100 में / नमूना।
    7. कोशिकाओं को धो लें और प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण। गैर फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के नमूने क्षतिपूर्ति और सेटिंग्स 25 प्रवाह cytometry समायोजित करने के लिए प्रयोग में इस्तेमाल प्रत्येक fluorochrome का सिर्फ एक साथ लेबल के रूप में नकारात्मक नियंत्रण और नमूने का उपयोग transinfected टी कोशिकाओं का एक नमूना शामिल करने के लिए मत भूलना। प्रतिनिधि विश्लेषण चित्रा 5 में दिखाया गया है।
      नोट: बैक्टीरिया GFP व्यक्त नहीं करते हैं, तो 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% पर ट्राइटन X-100 के साथ नमूने, intracellular और बाह्य बैक्टीरिया, लेबल कोशिकी बैक्टीरिया भेद ठीक है, और permeabilize के लिए। बाद में एक अलग fluorochrome साथ कुल बैक्टीरिया (इंट्रासेल्युलर + बाह्य) दाग।

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Representative Results

फ्लो और जेंटामाइसिन अस्तित्व परख चित्रा 1 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया का सार है:। के साथ साथ हम संक्रमित अस्थि मज्जा व्युत्पन्न-डीसी और कैसे दो अलग अलग दृष्टिकोण के माध्यम से जीवाणु transinfection को मापने के लिए से murine टी सेल बैक्टीरियल transinfection प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन किया। डीसी 9 दिनों के लिए जीएम-सीएसएफ के साथ अस्थि मज्जा कोशिकाओं के ऊष्मायन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। फिर, डीसी ओवीए (OVAp) की एक विशेष पेप्टाइड के साथ बाद में उन्हें लोड करने के लिए अपनी झिल्ली पर MHCII बढ़ाने के लिए LPS के साथ maturated कर रहे हैं। एक नियंत्रण के रूप में, कुछ डीसी OVAp के साथ लोड नहीं कर रहे हैं। (OVAp-भरी हुई है और गैर-लोडेड) दोनों डीसी संक्रमण की बहुलता 10 बैक्टीरिया के (MOI) में संक्रमित हैं। दूसरी ओर, सीडी 4+ टी कोशिकाओं विशिष्ट OVAp समझते हैं जो OTII ट्रांसजेनिक चूहों के लिम्फ नोड्स से अलग कर रहे हैं। 2 प्रदर्शन और उचित नकारात्मक नियंत्रण सहित टी सेल transinfection यों की प्रक्रिया दर्शाया गया है। Descri के रूप मेंसोने से पहले, कुछ डीसी OVAp के साथ लोड नहीं कर रहे हैं। इस मामले में, कारण OVAp के अभाव के डीसी और टी कोशिकाओं, लेकिन नहीं प्रतिरक्षा synapse गठन के बीच एक संवाद है। एक अतिरिक्त नियंत्रण डीसी टी शारीरिक संपर्क में बाधा उत्पन्न करती है, जो (ताकना आकार के 3 माइक्रोन) के साथ एक पॉली कार्बोनेट transwell बाधा के साथ डीसी और टी कोशिकाओं को अलग करने, शामिल है। डीसी transwell के अंदर शामिल कर रहे हैं; एक परिणाम के रूप में वे इस छेद के आकार के माध्यम से पारित करने में सक्षम नहीं हैं। एक और नकारात्मक नियंत्रण भी 10 जीवाणुओं की एक MOI में सीधे टी कोशिकाओं incubating द्वारा, प्रत्यक्ष टी सेल संक्रमण शामिल किया है। टी सेल transinfection दो दृष्टिकोण से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है: प्रवाह cytometry या जेंटामाइसिन अस्तित्व परख। प्रवाह cytometry द्वारा मापने के लिए, डीसी बैक्टीरिया GFP और सीडी 4+ टी कोशिकाओं के साथ पहले से संक्रमित किया गया है चाहिए एक सेल नजर रखने के साथ दाग (टी कोशिकाओं-नीला)। संयुग्म गठन के बाद, कोशिकाओं DCS (CD11c पीई) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग होना चाहिए। कोशिकी बैक्टीरिया भी quantif करने के लिए दाग होना चाहिएY cytometry पर बाद में प्रवाह से संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं का प्रतिशत। जेंटामाइसिन अस्तित्व परख द्वारा transinfection मापने के लिए, कोशिकाओं को बाह्य बैक्टीरिया को मारने के लिए 1 घंटे के लिए जेंटामाइसिन के साथ incubated हैं, तो टी कोशिकाओं अगर प्लेट पर बीज के लिए फिर से अलग कर रहे हैं। दशमलव धारावाहिक dilutions अगर प्लेट पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 50 μl बीज और CFUs की गिनती की सुविधा के लिए बना रहे हैं।

3 चित्र में दिखाया गया है, डीसी भेदभाव फ्लो (चित्रा 3 ए और 3 बी) द्वारा जाँच की जानी है। डीसी CD11c और MHCII (चित्रा 3) और नहीं जीआर -1, न्यूट्रोफिल की एक मार्कर है जो व्यक्त करना चाहिए। चित्रा 3 बी में प्रस्तुत किया है, कुछ न्यूट्रोफिल (जीआर -1, एमएचसी की 3.27% -) संस्कृति में प्रस्तुत किए गए, लेकिन न्यूट्रोफिल प्रदूषण का अधिक से अधिक 5% के साथ डीसी संस्कृति नहीं किया जाना चाहिए। सीडी 4+ टी कोशिकाओं पवित्रता Ly से अलगाव के बाद जाँच की जानी चाहिएमील प्रति घंटे नोड्स (चित्रा 3 सी) और डीसी से अलग होने के बाद गठन (चित्रा 3 डी) conjugates। Conjugates गठन के बाद प्रदूषणों से कम से कम 2% के साथ खाते में प्रयोग लेने।

चित्रा 4 साल्मोनेला का उपयोग कर टी transinfection प्रयोग का एक उदाहरण से पता चलता है। चित्रा -4 ए में सचित्र, प्लेटों में गिना जा सकता लेग अगर प्लेट और कॉलोनी के गठन इकाइयों पर बड़े हो गए प्रत्येक भाग। साल्मोनेला में धारावाहिक dilutions बीज के लिए चार भागों में बांटा जाता है। चित्रा -4 ए में दिखाया गया है, साल्मोनेला संक्रमित डीसी से टी कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया था और इस प्रक्रिया को स्पष्ट रूप से OVAp मान्यता (चित्रा -4 ए और चित्रा 4 बी के बाईं पर प्लेट) के साथ बढ़ाया गया था। डीसी और टी कोशिकाओं के बीच संपर्क बाधा एक शारीरिक बाधा नहीं थी हालांकि, जब वास्तव में कोई transinfection एक प्रत्यक्ष टी कर के मामले के रूप में, वहाँ था सेल संक्रमण (चित्रा -4 ए और चित्रा 4 बी के अधिकार पर प्लेट)।

चित्रा 5 में दिखाया गया है, टी सेल transinfection एक उज्ज्वल GFP व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। डीसी और टी कोशिकाओं एक आगे और पक्ष तितर बितर साजिश में आकार और जटिलता से भेदभाव किया जा सकता है, लेकिन विभिन्न मार्कर अच्छी तरह से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सीडी 4+ टी कोशिकाओं CD11c के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ एक सेल ट्रैकर (CMAC) और डीसी के साथ लेबल रहे थे। वे CMAC के साथ लेबल (नहीं CD11c पीई के साथ) और व्यक्त कर रहे हैं क्योंकि कोशिकी बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित किया जा सकता इसलिए एलेक्सा स्त्राव 647., संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओं का प्रतिशत के साथ संयुग्मित साल्मोनेला और माध्यमिक एंटीबॉडी विरोधी खरगोश के खिलाफ एक खरगोश एंटीबॉडी के साथ दाग थे GFP (बैक्टीरिया GFP), लेकिन वे बाह्य बैक्टीरिया (एलेक्सा स्त्राव 647) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं कर रहे थे।

ntent "के लिए: रख-together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
डीसी पीढ़ी और सीडी 4+ टी कोशिकाओं अलगाव की चित्रा 1 फ्लो चार्ट। चित्रा के बाएं हाथ की तरफ, प्रक्रिया अस्थि मज्जा कोशिकाओं से वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) को अलग करने के लिए विस्तृत है। Femurs और tibias विदारक के बाद, अस्थि मज्जा कोशिकाओं हड्डियों के इंटीरियर से निकाले जाते हैं। बाद में, लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) lysed रहे हैं और अस्थि मज्जा कोशिकाओं 9 दिनों के लिए पुनः संयोजक murine granulocyte बृहतभक्षककोशिका colony- उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के साथ सुसंस्कृत हैं। वे अच्छी तरह से भेदभाव कर रहे हैं एक बार, डीसी प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल द्वितीय (MHCII) अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ incubated हैं। फिर, DCS एक विशिष्ट ovoalbumin पेप्टाइड (OVAp) के साथ भरी हुई है और संक्रमण की बहुलता 10 बैक्टीरिया के (MOI) से संक्रमित हैं। उनमें से कुछ एक नियंत्रण के रूप में OVAp के साथ लोड नहीं कर रहे हैं। चित्रा के दाहिने हाथ की तरफ, कैसे करने के लिएOTII ट्रांसजेनिक चूहों का प्रतिनिधित्व किया है से सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग। लिम्फ नोड्स (LNS) एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त हटा दिया है और जमीन हैं। अंत में, सीडी 4+ टी कोशिकाओं को एक चुंबकीय सेल जुदाई मशीन का उपयोग नकारात्मक चयन द्वारा अलग कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. टी सेल transinfection प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। (बैक्टीरिया हरे रंग में चित्रित कर रहे हैं) और OVAp भरी हुई-DCS (लाल कोशिकाओं) संक्रमित प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन की अनुमति के सीडी 4+ टी कोशिकाओं (नीला कोशिकाओं) के साथ incubated हैं। संक्रमित DCS (लेकिन OVAp के साथ लोड नहीं) भी बातचीत दोनों कोशिकाओं के बीच लेकिन प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन के बिना अनुमति देता है जो टी कोशिकाओं के साथ incubated हैं। एक अतिरिक्त नियंत्रण सीडी 4+ को अलग करने, शामिल है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
और पृथक सीडी 4+ टी कोशिकाओं-डीसी निकाली गई अस्थि मज्जा का विश्लेषण कोशिकामापी चित्रा 3. प्रवाह। द्वारा विश्लेषण अस्थि मज्जा व्युत्पन्न-डीसी का प्रतिनिधि डॉट भूखंडोंफ़्लो साइटॉमेट्री। (ऊपरी सही चक्र 85.8%) (बी) के डीसी MHCII लेकिन नहीं जीआर 1 (; निचले सही चक्र 85%) व्यक्त (ए) डीसी MHCII और CD11c व्यक्त किया। हालांकि, जीआर 1 लेकिन नहीं MHCII कोशिकाओं (ऊपरी बाएँ चक्र) व्यक्त की है कि कोशिकाओं के एक 3.27% थी। इन कोशिकाओं को मामूली दूषित न्यूट्रोफिल थे। (सी और डी) लिम्फ नोड्स (सी) से अलग सीडी 4+ टी कोशिकाओं की पवित्रता का प्रतिनिधित्व histograms, और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डी) के साथ संयुग्म गठन के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
जेंटामाइसिन अस्तित्व परख द्वारा मात्रा चित्रा 4 टी सेल transinfection। लेग अगर प्लेटों decima करने के लिए इसी 4 भागों में विभाजित किया गयाlysed सीडी 4+ टी कोशिकाओं के एल धारावाहिक dilutions। (-) (ए) कालोनी साल्मोनेला enterica की इकाइयों उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति में टी सेल transinfection करने के लिए इसी लेग अगर प्लेटों पर बढ़ी गठन संक्रमित डीसी की सतह पर OVAp की, और (डीसी / टी सेल संपर्क की इजाजत दी परिस्थितियों में - ताइवान) या ऐसे संपर्कों (+ ताइवान) बाधा एक शारीरिक बाधा की उपस्थिति में। प्रत्यक्ष टी सेल संक्रमण (नकारात्मक नियंत्रण) को इसी एक खाली प्लेट भी दिखाया गया है। डीसी / टी सेल से संपर्क करें (+ ताइवान) बाधा था जब लगभग कोई transinfection नहीं था। संक्रमित डीसी से टी कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया जीवाणु की दर दिखा कई प्रयोगों से कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) (बी) मात्रा। प्रत्यक्ष टी सेल संक्रमण, और डीसी / टी सेल संपर्क बाधा की स्थिति टी सेल संक्रमण का कोई स्तर के लिए थोड़ा उत्पादन। डीसी / टी सेल संपर्क की अनुमति दी गई है, वहाँ टी सेल transinfection था, और यह प्रतिजन मान्यता (+ OVAp) द्वारा बढ़ाया गया था। कॉलम सलाखों 3 मैं का मतलब प्रतिनिधित्वndependent प्रयोगों। त्रुटि सलाखों एसडी संकेत मिलता है। महत्वपूर्ण मतभेद पी <0,0001 करने के लिए इसी *** द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. टी सेल transinfection प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा। प्रतिनिधि डॉट साजिश transinfection प्रक्रिया के बाद डीसी और टी सेल conjugates दिखा। सीडी 4+ टी कोशिकाओं छोटे और के रूप में आगे दौर और पक्ष तितर बितर कर रहे हैं (एफसीएस - एसएससी) डॉट दाग से पता चलता है, और अच्छी तरह से भेदभाव किया जा करने के लिए, वे एक सेल ट्रैकर (CMAC) के साथ दाग रहे थे। CD11c व्यक्त डीसी CMAC के साथ लेबल और अनियमित आकार के साथ टी सीडी 4+ टी कोशिकाओं की तुलना में बड़े होते हैं नहीं कर रहे हैं। Extracel के लिए इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया-GFP लेकिन नकारात्मक युक्त संक्रमित सीडी 4+ टी कोशिकाओंनिचले सही चक्र में दिखाए गए हैं lular बैक्टीरिया (6.19%)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

टी कोशिकाओं या टी lymphocytes अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से 26 सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और है कि ल्यूकोसाइट्स का एक प्रकार है। टी कोशिकाओं इन विट्रो में संक्रमित होने के लिए आग रोक रहे हैं, लेकिन कुछ रिपोर्टों वे विवो 14,15 में संक्रमित हो सकता है कि संकेत मिलता है। प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन दौरान एपीसी और टी कोशिकाओं की अंतरंग संपर्कों ऐसे एचआईवी 11 के रूप में कुछ वायरस सहित जैविक सामग्री 13, आदान प्रदान के लिए प्लेटफॉर्म के रूप में काम करते हैं। यह हाल ही में हठधर्मिता, टी कोशिकाओं के लिए है कि विपरीत दिखाया गया था, अनुकूली प्रतिरक्षा की कोशिकाओं के प्रतिमान भी कुशलता से संक्रमित डीसी 11,16 से transinfection द्वारा बैक्टीरिया पर कब्जा करने में सक्षम हैं। इस के साथ साथ हम वह संक्रमित BMDCs से इन विट्रो में टी सेल बैक्टीरियल transinfection यों को प्रोटोकॉल विस्तृत दिखा।

टी सेल बैक्टीरियल transinfection प्रतिजन मान्यता 16 द्वारा बढ़ाया गया था। हम सीडी 4+ टी कोशिकाओं का उपयोग करके से अलग से पता चला किएक विशिष्ट OVAp पहचानने OTII ट्रांसजेनिक चूहों, BMDCs OVAp और (यहाँ डेटा साल्मोनेला enterica से प्रस्तुत किया जाता है) अलग बैक्टीरिया से संक्रमित चूहों के साथ भरा हुआ है। OTII चूहों से अलग सीडी 4+ टी सेल प्रतिरक्षा synapse गठन की अनुमति के लिए 30 मिनट के लिए संक्रमित डीसी के साथ incubated हैं। यहाँ प्रस्तुत डेटा टी कोशिकाओं समय की इस छोटी सी अवधि में डीसी से कब्जा कर सकते हैं कि बैक्टीरिया के अनुरूप हैं। हम संक्रमित डीसी करने के लिए टी कोशिकाओं की अब निवेश बड़ा बैक्टीरियल कब्जा () नहीं दिखाया में हुई है कि पता है, लेकिन टी कोशिकाओं को भी बहुत जल्दी uptaken जीवाणुओं को नष्ट, के रूप में लंबे समय तक डीसी / टी सेल समय संपर्कों के दौरान होने वाली बैक्टीरियल transinfection की मात्रा का ठहराव मुश्किल साबित हुई । जेंटामाइसिन अस्तित्व परख यह एक एकल से संक्रमण जीवाणु 21 का पता लगाने में सक्षम है क्योंकि टी सेल transinfection यों की एक बहुत ही संवेदनशील तरीका है। जेंटामाइसिन साथ ऊष्मायन के बाद टी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं और बैक्टीरिया मध्यम अगर PL पर बीज के लिए lysed, सिर्फ बाह्य बैक्टीरिया को मारने किAtes। डीसी के साथ conjugates के गठन के बाद टी कोशिकाओं के अलगाव के प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम है। प्रदूषणों से कम से कम 2% के साथ ही प्रयोगों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। डीसी संदूषण फ्लो और कम डीसी संदूषण के लिए इसी CFUs घटाया जाना चाहिए द्वारा मापा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सीडी 4+ टी कोशिकाओं पवित्रता सेल छँटाई का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है।

एक और दृष्टिकोण टी सेल transinfection GFP बैक्टीरिया व्यक्त करने और एक संगत fluorophore साथ कोशिकी बैक्टीरिया लेबलिंग का उपयोग कर, प्रवाह cytometry से है जिसका अंदाजा लगाना। इस दृष्टिकोण की एक सीमा बैक्टीरिया autofluorescence पृष्ठभूमि के खिलाफ संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल है कि एक GFP व्यक्त करने के लिए किया है। वैकल्पिक रूप से, बैक्टीरिया एक सेल नजर रखने के साथ डीसी को संक्रमित करने से पहले कलंकित किया जा सकता है। एक और दृष्टिकोण, बाह्य बैक्टीरिया धुंधला हो जाना टी कोशिकाओं permeabilizing, तो सभी बैक्टीरिया (इंट्रासेल्युलर + बाह्य) लेबलिंग होगाएक अलग fluorochrome साथ।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य दिशाओं के बारे में, हम चुंबकीय कणों के साथ सजाया बैक्टीरिया का उपयोग करके, संक्रमित डीसी करने के लिए लंबे समय तक प्रदर्शनी के बाद बैक्टीरिया पर कब्जा कर लिया है कि टी कोशिकाओं की संख्या यों के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए कोशिश कर रहे हैं। बैक्टीरिया पर कब्जा टी कोशिकाओं चुंबकीय कणों बनाए रखने होगा और इसलिए यह चुंबक का उपयोग करके उन्हें अलग करने के लिए आसान होना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Fisher Scientific SH3025501
r-GMCSF Peprotech 315-03
LPS SIGMA L2630-10mg
Na Pyruvate Thermo Scientific SH3023901
2-ME Gibco 31350-010
OVAp OTII (323–339) GenScript
Cell Strainer 70uM BD 352350
 30 uM Syringe Filcons Sterile BD 340598
AutoMacs Classic Miltenyi Biotec 130-088-887
Gentamicin Normon 624601.6
Transwell Costar 3415
LB Pronadisa 1231
Agar Pronadisa 1800
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100
CD8 biot BD Biosciences 553029
IgM Biot ImmunoStep Clone RMM-1
B220 Biot BD Biosciences 553086
CD19 biot BD Biosciences 553784
MHC-II Biot (I-A/I-E) BD Biosciences 553622
CD11b biot Immunostep 11BB-01mg
CD11c biot Immunostep 11CB3-01mg
DX5 biot BD Biosciences 553856
Gr-1 biot BD Biosciences 553125
CD16/CD32 ImmunoStep M16PU-05MG
anti Salmonella ABD Serotec 8209-4006
CD11cPE BD Biosciences 553802
CD4-APC Tonbo Biosciences 20-0041-U100
Gr-1 APC BD Biosciences 553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC BD Biosciences 553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Invitrogen A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) Life technologies C2110
BSA SIGMA A7030-100G
Streptavidin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-101
BD FACSCanto II BD Biosciences

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 107 transinfection प्रतिजन प्रस्तुति टी कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं बैक्टीरिया जेंटामाइसिन अस्तित्व परख
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Cruz-Adalia, A., Ramírez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacón, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (107), e52976, doi:10.3791/52976 (2016).

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