T细胞通过树突状细胞的转感染捕获细菌

摘要

本文介绍了一种用于检测CD4⁺ T细胞在抗原呈递过程中通过预先感染的树突状细胞（DC）发生易感感染（transinfection）时捕获细菌的实验方案。我们展示了如何完成以下必要步骤：原代细胞的分离、DC的感染、DC与T细胞共轭物的形成，以及细菌在T细胞中易感感染的检测。

摘要

最近，我们发现与已有描述相反的情况：CD4⁺ T细胞（适应性免疫细胞的典型代表）可通过一种称为“转感染”（transinfection）的过程，从受感染的树突状细胞（DCs）中捕获细菌。本文描述了在抗原呈递过程中发生的转感染过程的分析方法。该过程的揭示依赖于使用来自转基因OTII小鼠的CD4⁺ T细胞，这些T细胞携带一种特异性识别卵清蛋白肽段（OVAp）的T细胞受体（TCR），因此能够与负载了该特异性OVAp的感染性树突状细胞形成稳定的免疫复合物。通过活细胞成像技术可监测绿色荧光蛋白（GFP）标记的细菌在DC与T细胞间传递的动态过程，同时可通过流式细胞术对细菌转感染进行定量分析。此外，还可采用一种更为灵敏的方法——基于使用庆大霉素（gentamicin）的定量法，该抗生素为非穿透性氨基糖苷类，可杀灭胞外细菌而无法杀灭胞内细菌。这一经典方法此前已在微生物学中用于研究细菌感染效率。本文详细阐述从原代细胞分离到转感染定量的完整实验流程。

引言

当病原体感染宿主时，通常会激活先天性和适应性免疫反应，这是清除细菌所必需的。先天性免疫是防止大多数感染的第一道防线。先天性免疫能够精确识别在多种微生物群体中保守存在的成分（即病原体相关分子模式，PAMPs）¹。先天性免疫的机制包括物理屏障（如皮肤）、化学屏障（如抗菌肽、溶菌酶）以及先天性白细胞，后者包括吞噬细胞（巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及自然杀伤细胞²。这些细胞通过直接接触攻击或通过吞噬作用（包括对病原体的 engulfing 和杀灭）来识别并清除病原体。与适应性免疫不同，该系统不能提供终身防御，而适应性免疫则赋予针对病原体的免疫记忆。适应性免疫系统是第二道防线，能够识别并针对多种微生物和非微生物物质的特异性抗原作出反应³。适应性免疫系统的主要组分是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞。B细胞参与体液免疫，分泌针对病原体或外源性蛋白质的抗体。而T细胞则介导细胞免疫，通过分泌细胞因子调节免疫反应，或杀伤被病原体感染的细胞⁴。

抗原呈递细胞（APC），包括树突状细胞和巨噬细胞，是先天免疫系统的重要组成部分，能够识别并吞噬病原体，并将细菌组分加工为抗原，通过主要组织相容性复合体（MHC）^5-7呈递至细胞表面。APC吞噬病原体后，通常迁移至引流淋巴结，在此与T细胞相互作用。T淋巴细胞通过其T细胞受体识别特异性的肽-MHC复合物。在抗原....

方案

注意：实验方案已获马德里自治大学研究伦理委员会批准，并在马德里自治大学动物福利与健康负责人监督下，依照西班牙及欧洲相关指南实施。小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，由经过培训且具备资质的人员采用二氧化碳（CO₂）吸入法实施安乐死。

1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的分化与感染

注意：图1总结了此第一步。从此时起，所有操作均应在生物安全柜中进行，并仅使用无菌培养基、器械、移液器吸头和培养皿。

1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的分化
   1. 从一只 C57/BL6 小鼠中解剖出胫骨和股骨 ²² 转移至含有10 ml RPMI培养基的塑料培养皿中。
   2. 用无菌剪刀切除每个骨骺，暴露骨髓，骨髓具有特征性的鲜红色。
   3. 使用无菌注射器在无菌培养皿中将含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）注入骨组织内部（PBS/BSA/EDTA缓冲液）。
   4. 收集细胞悬液，于4 °C下在预冷的离心机中以600 x g离心。
   5. 将细胞重悬于 1 ml 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（0.15 M NH₄Cl）中₄Cl, 10 mM KHCO₃₃ 并加入0.1 ....

结果

本文介绍了如何从感染的小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）向T细胞进行细菌转感染，以及如何通过两种不同方法——流式细胞术和庆大霉素保护实验——来检测细菌转感染。图1总结了细胞制备的流程。通过将骨髓细胞在GM-CSF中培养9天来诱导生成树突状细胞。随后，使用LPS对DC进行成熟处理，以增加其膜表面MHCII的表达，便于后续负载卵清蛋白特异性肽段（OVAp）。作为对照，部分DC不负载OVAp。将负载与未负载OVAp的DC均以感染复数（MOI）为10的细菌进行感染。另一方面，从OTII转基因小鼠的淋巴结中分离CD4⁺ T细胞，该T细胞可特异性识别OVAp。图2展示了进行并定量T细胞转感染的实验流程，包括适当的阴性对照。如前所述，部分DC未负载OVAp，在此情况下DC与T细胞之间存在相互作用，但由于缺乏OVAp，无法形成免疫突触。另一个对照组则使用聚碳酸酯transwell小室（孔径3 μm）将DC与T细胞分隔开，以阻止二者之间的直接接触；DC被置于transwell内部，因其体积较大而无法穿过该.......

讨论

T细胞或T淋巴细胞是一类白细胞，在细胞介导的免疫中发挥核心作用，属于适应性免疫应答。²⁶T细胞对感染具有抗性 体外 但有部分报道称它们也可能被感染 体内^14,15. 抗原提呈细胞与T细胞在免疫突触过程中的紧密接触，为生物物质的交换提供了平台¹³，包括某些病毒，如HIV¹¹最近研究表明，与传统观念相反，作为适应性免疫细胞典范的T细胞也能够通过从感染的树突状细胞（DCs）进行的转感染，有效摄取细菌。^11,16. 本文展示了定量测定T细胞细菌转感染的详细方案 体外 来自感染的BMDCs。

抗原识别可增强T细胞的细菌转感染¹⁶。我们通过使用来自OTII转基因小鼠的CD4⁺ T细胞（该T细胞识别特定的OVAp抗原）、负载OVAp的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）以及感染了不同细菌的小鼠（本文数据来自Salmonella enterica）来展示这一现象。将来自OTII小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	菲舍尔科技	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na 丙酮酸盐	赛默飞世尔科技	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript
70 μm 细胞筛	BD	352350
30 μm 注射器滤器 无菌	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
庆大霉素	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB 培养基	Pronadisa	1231
琼脂	Pronadisa	1800
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100
CD8 生物素标记	BD 生物科学	553029
IgM 生物素标记	ImmunoStep	克隆 RMM-1
B220 生物素标记	BD 生物科学	553086
CD19 生物素标记	BD 生物科学	553784
MHC-II 生物素标记 (I-A/I-E)	BD 生物科学	553622
CD11b 生物素标记	ImmunoStep	11BB-01mg
CD11c 生物素标记	ImmunoStep	11CB3-01mg
DX5 生物素标记	BD 生物科学	553856
Gr-1 生物素标记	BD 生物科学	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
抗沙门氏菌抗体	ABD Serotec	8209-4006
CD11c-PE	BD 生物科学	553802
CD4-APC	Tonbo 生物科学	20-0041-U100
Gr-1-APC	BD 生物科学	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD 生物科学	553623
Alexa Fluor 647 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体，高度交叉吸附	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-氨基-4-氯甲基香豆素)	Life Technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
链霉亲和素磁珠	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD 生物科学