Summary
这里的协议，提出通过该期间抗原呈递发生经由transinfection从预感染树突状细胞（DC）的CD4 + T细胞以测量细菌捕获。我们说明如何执行必要的步骤：原代细胞中，DC，DC / T细胞共轭形成感染和细菌的T细胞转染的测量隔离。
Introduction
当病原体感染其宿主，通常的先天和适应性免疫反应所必需的细菌清除的活化。先天性免疫是防御的第一道防线，防止大多数感染。先天免疫区分以精确的方式元件被间微生物大类保守的（病原体相关分子模式）1。先天免疫的机制包括物理障碍如皮肤，化学品的障碍（抗菌肽，溶菌酶）和先天的白细胞，包括吞噬细胞（巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞），肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，和天然杀伤细胞2。这些细胞识别和消灭病原体，无论是通过接触或通过细胞吞噬功能，其中包括病原体吞噬和杀害攻击他们。该系统不允许终身防守，而相比之下，适应性免疫，从而赋予针对p免疫记忆athogens。适应性免疫系统是防御的第二行，并且能够识别和反应以多种微生物和非微生物物质3的特定抗原。适应性免疫系统的主要组成部分是淋巴细胞，它包括B和T细胞。 B细胞参与了体液应答，分泌抗病原体或外源蛋白质。然而，T细胞代表了细胞介导的免疫力，调节细胞因子分泌或杀死病原体感染的细胞4的免疫应答。
抗原呈递细胞（APC），包括树突状细胞或巨噬细胞，先天免疫系统的组分，可以识别吞噬病原体和过程细菌成分成抗原，其由主要组织相容性复合物（MHC）5-7呈现在细胞表面上。后的APC已吞噬的病原体，它们通常迁移到引流淋巴结，在那里它们以T相互作用细胞。 T淋巴细胞可以通过它们的T细胞受体识别特异性的肽-MHC复合物。免疫突触（IS）发生在负载抗原的APC和淋巴细胞之间的界面中的抗原呈递8,9。有些细菌可以生存的吞噬功能，并在装甲运兵车系统传播。这种观点认为，受感染的APC作为细菌的水库或“特洛伊木马”，以促进细菌的蔓延10。装甲运兵车和采取的是在形成过程中发生淋巴细胞之间的亲密接触也可作为一个平台，交换膜，遗传物质和外来体的一部分，可以被劫持用于某些病毒感染的T细胞;这个过程被称为transinfection 11-13
一些病原性细菌（ 李斯特菌， 沙门氏菌和志贺氏菌 ）能够侵入T淋巴细胞在体内和修改其行为14-16。我们有最近描述了T淋巴细胞也能抗原呈递16的过程中捕获的细菌通过从以前感染树突细胞（DC）transinfection。 T细胞细菌捕获由transinfection极其比直接感染更有效（1,000-4,000x）。 T细胞捕获病原体和非病原菌显示比transinfection是由T细胞驱动的过程。引人注目的是，transinfected T（TIT）细胞迅速杀死细菌捕获和这样做的效率比专业的吞噬细胞16。这些结果，这打破免疫学的教条，表明适应性免疫的细胞可以执行是假想排他性的先天免疫的功能。此外，我们发现，乳头细胞分泌大量的促炎细胞因子和体内的细菌感染保护。
这里，我们提出用于研究细菌transinfection过程中的不同协议小鼠模型。该模型是基于使用CD4 + T细胞的转基因小鼠OTII，其中承担特异性的TCR的OVA（OVAp）的肽323-339中的I-17抗体的相互作用是特异性地与细菌感染的骨的上下文marrow-衍生的DC（DC培养上清）18,19装有OVAp，形成稳定的免疫突触。
T细胞transinfection可以可视化，并使用荧光显微镜进行跟踪。此外，流式细胞仪可用于通过取由细菌表达绿色荧光蛋白（GFP）16,20发出的荧光的优点检测感染的细胞。此外，T细胞transinfection可以通过更灵敏的方法，庆大霉素存活测定法，允许大量事件的测量来定量。庆大霉素是一种不能渗透的真核细胞的抗生素。因此，使用这种抗生素可以胞内细菌的分化幸存抗生素除了FROM外那些被打死21。
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Protocol
注：实验过程批准了委员会的马德里自治大学的研究伦理和动物福利与健康的马德里自治大学负责人的监督下，按照西班牙和欧洲的准则进行的。小鼠饲养在无特定病原（SPF）的住房，他们用二氧化碳培训并合格的人员（CO 2）吸入法实施安乐死。
1.鼠标骨髓来源的DC分化和感染
注意： 图1总结了该第一步骤。所有过程应进行在从该点上的引擎盖，仅使用无菌培养基，仪器，枪头和培养皿。
- 小鼠骨髓来源的DC分化
- 解剖胫骨和股骨从一个C57 / BL6小鼠22和转移到的塑料培养皿用10ml RPMI培养基。 互砍骨骺关闭，用无菌剪刀和揭露骨髓，其中有一个特色鲜明的红色。
- 注入的骨的内部与上使用无菌的Petri无菌注射器10 ml的磷酸盐缓冲盐水的（PBS）中含有0.5％牛血清白蛋白（BSA）和5mM乙二胺四乙酸（EDTA）（PBS / BSA / EDTA缓冲液）菜。
- 收集细胞悬浮液，并离心在一个管中于600×g离心在冷冻离心机（4℃）。
- 将细胞重悬于1毫升铵-氯化物钾（ACK）裂解缓冲液（0.15M的氯化铵 ，10毫KHCO 3和0.1mM EDTA）中，为了消除红血细胞温育30秒，室温。
- 加入10 mL的RPMI 1640培养基中含10％胎牛血清（FBS），并过滤通过细胞过滤网（70微米）离心以相同的速度（600×g离心），因为团块通过滤波消除之前去除骨碎片和细胞团块。
- 细胞计数的d调整至5×10 5个细胞/毫升的RPMI 10％FBS（含50μM的β-巯基乙醇，1mM丙酮酸钠），并添加20纳克/毫升的重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（RM-GM-CSF）作为终浓度。
- 添加该悬浮液到无菌的，微生物学品质15厘米培养皿，并培养在 CO 2培养箱中（37℃，5％的CO 2）。
- 每三天，降速两个非贴壁细胞和分离的细胞用5mM EDTA的PBS重悬在细胞密度为5×10 5个细胞/ ml，用含有20纳克/毫升RM-GM-CSF的新鲜培养基中。
- 的DC和抗原负载成熟
- 在9天，重悬细胞在培养基含有20纳克/毫升RM-GM-CSF的5×10 5细胞/密度毫升。然后加入20纳克/毫升脂多糖（LPS），以允许高的MHC-II表达的细胞上，并培育在非组织培养处理过的无菌的15厘米的培养皿24小时。
- 一前一后对LPS刺激的一天，染色一些DC细胞的抗鼠的CD11c，MHCII和Gr-1通过流式细胞仪检查的DC分化。流式细胞DC的分析的一个例子示于图3A和3B。
- 孵育树突（5×10 5个细胞/样品）用抗小鼠CD16 / CD32的单克隆抗体的终浓度在50μlPBS / BSA / EDTA每个样品缓冲液2.5微克/毫升。之后，加入50微升的抗体的抗MHCII（IA / IE）的CD11c和Gr-1在1偶联有不同荧光：100,1：200和1：500分别在PBS / BSA / EDTA缓冲液。
- 最后，洗净树突用PBS / BSA / EDTA缓冲液中，并根据制造商的协议通过流式细胞术分析。
注意：如果所述细胞是分化良好，细胞准备用于抗原负载。
- 洗涤的DCs用RPMI 10％FBS（无抗生素）中，用10微克/毫升OTII OVAp（OVA 323-339孵育它们; ISQAVHAAHAEINEAGR）上，在37ºC在1ml每5×10 6个树突状最小1小时RMPI 10％FBS培养基的塑料管。作为阴性对照，留下的DC而不OVAp孵化。
- DC的感染
- 在 CO 2培养箱中感染的DC在感染复数为10的细菌（每直流10细菌）1小时（MOI）（37℃，5％CO 2）。
- 洗涤直流细胞3×PBS中和1x在RMPI 10％FBS和离心机在450×g离心以洗掉大部分胞外细菌。最后，重悬细胞RMPI 10％FBS的培养基（无抗生素），在20×10 6个细胞/ ml。
从OTII转基因小鼠2.隔离CD4 + T淋巴细胞
注意： 图1总结了该第二步骤。淋巴结应当被用来代替脾脏分离CD4 + T细胞，因为外周血CD4 +淋巴细胞在淋巴结秒（〜50％）比在脾（〜25％），因此纯化会更有效放大。
- 让单细胞悬液淋巴结
- 删除腹股沟，腋窝，上臂，颈和肠系膜淋巴结23 OTII转基因小鼠，并转移到一个塑料菜10 RPMI 10％FBS培养基中。
- 在使用两个磨砂显微镜载玻片无菌罩研磨淋巴结。放置在一个显微镜载玻片的磨砂侧淋巴结，擦第二张幻灯片，直到机关已接地的磨砂面。
- 洗单细胞悬浮液在PBS / BSA / EDTA缓冲液。
- 过滤该细胞虽然细胞过滤网（70微米）以除去结缔组织和洗涤用PBS / BSA / EDTA缓冲液。
- 将细胞重悬于1毫升ACK裂解缓冲液和为了消除红血细胞下室温温育1分钟。
- CD4 + T细胞的分离
- 如步骤2.1.3和计数再次清洗细胞重悬在它们在PBS / BSA / EDTA缓冲液100×10 6个细胞/ ml。 30分钟250在冰上购买负选择CD4 + T细胞的：添加生物素化的抗CD8，IgM抗体，B220，CD19，MHC II类（Ⅰ抗体），细胞CD11b，CD11c的和DX5 1。
- 在PBS / BSA / EDTA缓冲液中洗涤细胞，并培育的细胞（100×10 6个细胞/ ml）与链亲和素微珠在推荐在生产商的方案，在冰上15分钟的浓度。
- 在PBS / BSA / EDTA缓冲液中洗涤细胞，并筛选它们虽然之前的 CD4 + T细胞的分离细胞过滤网（30微米）。
- 通过使用磁性细胞分离机根据生产商的方案负向选择隔离的CD4 + T细胞。
- 计数细胞，并调整到4×10 6个细胞/毫升的RPMI 10％FBS的培养基（无抗生素）。
- 修复并保持在冰上分离的CD4 + T细胞 （3×10 5个细胞），以检查纯度，流动流式细胞仪所描述的24。的CD4 + T细胞的纯化的实例示于图3C。
3. T细胞Transinfection测量庆大霉素保护测定
注意： 图2总结了协议的这个第三步骤。
- T细胞Transinfection
- 孵育分离的CD4 + T细胞与受感染DC的细胞（1：1）（所述的DC感染1小时并洗涤以消除游离的细菌）处理30分钟，以允许在 CO 2培养箱中（37℃，免疫突触的形成，5％ 的 CO 2）。
- 添加0.5分离CD4 + T细胞（2×10 6个细胞）和0.1感染的DC（2×10 6个细胞）上的24孔培养板的毫升毫升。作为阴性对照，直接CD4 + T细胞的0.5 ml的感染在10细菌感染复数为30分钟。
- 包括使用从T细胞分离感染的DC额外的控制聚碳酸酯的transwell屏障（有3微米孔径的），阻碍的DC-T物理接触。加入0.1毫升的transwell内的DC和0.5ml CD4 + T细胞的入井（24孔板）的下室中。
- 最后，完成与RMPI中，直到为0.6毫升每口井，使等量的所有样本。
- 免疫突触形成30分钟后，添加庆大霉素100微克/毫升与在 CO 2培养箱中收集细胞前孵育1小时（37℃，5％CO 2）。
- 重隔离的 CD4 + T细胞的
- 收集非粘附细胞，重悬它们在PBS / BSA / EDTA缓冲液。大多数的DC仍然附着于塑料培养板。轻轻涡管，以确保细胞分解。保持500微升细胞上清液作为对照，表明庆大霉素一直运作良好。
- 从包含DC和T细胞一起在步骤2.2样品再分离CD4 + T细胞虽然大多数的DC的应安装在该板上。置于冰上对照样品。仅考虑小于2％的污染实验。的transinfection后CD4 + T细胞纯化的一例示于图3D。
- 裂解性T细胞和种子它们对细菌培养基琼脂板。
- 用PBS洗两次CD4 + T细胞。
- 计数细胞，并重悬它们以2×10 6个细胞/ PBS中毫升。
- 加入500微升0.1％的Triton X-100的在500μl的T细胞以裂解它们以1×10 6个细胞/ ml，释放细胞内细菌出T细胞。
- 使裂解的细胞的3串行十倍稀释和种子将50μl每种稀释液对细菌培养基琼脂平板上。分割板分成4部分和种子裂解的细胞的不同稀释度的每一个部分。代表性的结果示于图4。
- 作为对照，还对板在琼脂上的缀合物的储存细胞上清液，以确保庆大霉素运作良好。另外板块感染的DC作为额外的控制。万一低的DC有污染发生（<2％），减去对应于低直流污染菌落形成单位（CFU的）。
4.定量流式细胞术检测T细胞Transinfection
注意： 图2总结了这一步骤。
- T细胞Transinfection
- 感染的BMDCs如在步骤1.3，但使用表达GFP的细菌在这种情况下。
- 染色CD4 + T细胞（分离自淋巴结在步骤2.2）用细胞追踪氯甲基氨基香豆素（CMAC）30分钟，在37ºC根据制造商的协议。
- 用RMPI 10％FBS（无抗生素）洗两次标记的CD4 + T细胞。
- 孵育感染的DC（后1小时培养的细菌）与标记的CD4 +T细胞30分钟，以允许免疫突触的形成，在37ºC包括所有说明步骤3.1.1控制。
- 感染的CD4 + T细胞染色
- 直流-T的免疫突触的形成在30分钟后，收集细胞和在PBS / BSA / EDTA清洗。
- 之后洗涤两次用PBS / BSA / EDTA缓冲液，分离凝集细胞轻轻涡旋管中。
- 固定的样品在0.2ml / PBS含3％PFA中15分钟，在室温的管中。然后把它们洗干净的PBS。
- 孵育抗小鼠CD16 / CD32单克隆抗体（2.5微克/毫升）的PBS / BSA / EDTA为50μl/样品15分钟在冰上阻断树突状细胞的Fc受体。
- 在50μl/ PBS / BSA / EDTA的样品添加兔抗细菌抗体（10μg/ ml的作为最终浓度）处理30分钟在冰上染色细胞外细菌。
- 用PBS / BSA / EDTA洗涤细胞并孵育抗小鼠的CD11c抗体偶联有藻红蛋白（PE）和一个本身抗兔condary抗体偶联有其它荧光像的Alexa-647氟在1：PBS / BSA / EDTA对在冰上30分钟，200在100μl/样品。
- 洗涤细胞并通过流式细胞仪分析样品。不要忘记包括使用非荧光的细菌作为阴性对照和样品标记有在实验中使用，以补偿样品和调整仪设置25的流中的每个荧光染料的只是一个transinfected T细胞的样品。代表性的分析结果列于图5。
注意：如果细菌不表达GFP，以区分细胞内外的细菌，标记胞菌，修复和透化的样品用Triton X-100，在0.5％在PBS中5分钟。随后染色细菌总数（内+外）用不同的荧光染料。
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Representative Results
本文我们描述了如何从感染的骨髓衍生-DC和如何通过两种不同的方法来测量细菌transinfection执行小鼠T细胞细菌transinfection：流式细胞仪和庆大霉素存活测定法图1总结的步骤，以获得细胞。通过骨髓细胞与GM-CSF连续9天的孵化产生的DC。随后，区议会熟化与LPS以增加它的膜MHCII与OVA（OVAp）的特定的肽加载它们以后。作为对照，有些区议会没装OVAp。二者的DC（OVAp加载的和非加载）感染在感染复数为10的细菌（MOI）。另一方面，CD4 + T细胞是从OTII的转基因小鼠，其识别特定OVAp的淋巴结中分离;图2示出了执行量化和T细胞transinfection包括合适的阴性对照的步骤。作为descri睡前，有些区议会没装OVAp。在这种情况下，存在的DCs和T细胞，但不是免疫突触的形成之间的相互作用由于缺乏OVAp的。一个附加的控制包括，与聚碳酸酯的transwell屏障（有3微米孔径的），阻碍的DC-T物理接触分离DC和T细胞。域控制器都包含在里面的透孔;因此它们不能够穿过该孔径。另外一个不利的控制也纳入，直接T细胞的感染，直接在10细菌MOI培养的T细胞。 T细胞transinfection可以量化由两种方法：流式细胞仪或庆大霉素存活测定法。为了通过流量测量仪，DCS应已预先用细菌-GFP和CD4 + T细胞感染的染色用细胞追踪器（T细胞-蓝）。后缀合物的形成，细胞应染色抗体的DC（CD11c的-PE）。胞外细菌也应以quantif染色ÿ感染的CD4 + T细胞通过流式细胞术以后的百分比。为了测量transinfection庆大霉素存活测定法，细胞与庆大霉素1小时杀死胞外细菌，则T细胞被再分离到种子上琼脂平板上。小数连续稀释制成种子50微升每种稀释液上琼脂平板和便利的CFU的数量。
如图3，DC分化已被通过流式细胞术（图3A和3B）检查。议会应表达的CD11c和MHCII（图3A），而不是的Gr-1，这是嗜中性粒细胞的标志物。如示于图3B中，一些嗜中性粒细胞（的的Gr-1 +，MHC 3.27％ - ）被呈现在培养，但培养的DCs与嗜中性白细胞污染的5％以上，不应使用。 CD4 + T细胞的纯度应在分离后从LY进行检查英里节点（图3C），并从树突分离后缀合物的形成（图3D）。考虑到实验后缀合物形成的污染物小于2％。
图4显示了使用沙门氏菌 Ťtransinfection实验的一个例子。 如图4A所示，板被分为四个部分的种子在每一个部分。 沙门氏菌的连续稀释都生长在LB琼脂平板和菌落形成单位进行计数。 如图4A所示 ，沙门氏菌，从感染的DC捕获由T细胞和此过程明显增强用OVAp识别（上图4A和图4B的左侧板）。然而，当有一个物理屏障阻碍DC和T细胞之间的接触，基本上没有transinfection，如在操作的一个直接T的情况下细胞感染（上图4A和图4B的右板）。
如图5，T细胞transinfection可以通过流动进行定量仪利用细菌表达明亮的GFP。 DC和T细胞可以按大小和复杂性在向前和侧向散射图中有区别，但不同的标记物可以用来很好区分。 的 CD4 + T细胞用细胞追踪器（CMAC）和DC用针对CD11c的抗体。胞外细菌用针对沙门氏菌和第二抗体抗兔兔抗体缀合的Alexa Fluor 647因此，受感染的 CD4 + T细胞的百分比可以量化，因为它们被标以CMAC（未用表面CD11c-PE）和表达绿色荧光蛋白（细菌-GFP），但他们并没有用针对外菌（的Alexa Fluor 647）的抗体。
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直流发生和 CD4 + T 细胞的分离 的图1流程图 。在该图的左手侧，则处理区分骨髓细胞的树突状细胞（DC）是详细。解剖股骨和胫骨后，骨髓细胞进行提取，从骨骼内部。随后，红血细胞（RBC）裂解和骨髓细胞是用重组鼠粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的9天培养。一旦被分化良好，树突一起保温脂多糖（LPS），以增加主要组织相容性复合物II（MHCII）的表达。然后，树突加载与特定卵白蛋白的肽（OVAp）和感染的感染复数为10的细菌（MOI）。它们中的一些不装载OVAp作为对照。在图的右手侧，如何隔离CD4 + T细胞从OTII转基因小鼠被表示。淋巴结（逻辑节点）是除去，地面，从而获得单细胞悬浮液。最后，CD4 + T细胞是通过使用磁性细胞分离机的负筛选分离得到。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2流程图的T细胞transinfection过程。感染（细菌在绿色描绘）和OVAp加载-DCS（红细胞）孵育CD4 + T细胞（蓝色细胞），以允许免疫突触的形成。感染的DC（但不装载OVAp）也一起孵育的T细胞，这使得这两个单元之间，但没有免疫突触的形成的相互作用。一个额外的控制包括，分离CD4 + 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.流式细胞仪骨髓-DC和分离的CD4 + T细胞的分析 。代表性点阵图骨髓-DC的由分析流式细胞仪。 （A）中的DCs表达MHCII和的CD11c（85.8％;右上象限）（B）中的DCs表达MHCII但不是的Gr-1（85％;右下象限）。但是，有细胞中表达的Gr-1，但不MHCII细胞（左上部分）的3.27％。这些细胞轻微污染的中性粒细胞。 （C和D）占CD4 + T细胞从淋巴结（C）中分离出纯度直方图，并结合形成以树突状细胞（D）后， 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. T细胞transinfection庆大霉素存活试验量化。 LB琼脂平板分成4部分相当于Decima的裂解CD4 + T细胞的升连续稀释。 （A）的菌落形成沙门氏菌为单位在LB琼脂平板生长相应于T细胞transinfection在存在（+）或不存在（ - ）OVAp的感染的DC的表面上，并在条件允许的DC / T细胞接触（ - TW），或在一个物理屏障阻碍这种接触（+ TW）的存在。还示出对应于直接的T细胞感染（阴性对照）的空盘。曾几何时，DC / T细胞接触受到阻碍（+ TW）几乎没有transinfection。 （B）中从几个实验示出的细菌通过T细胞感染的DC中捕获的速率量化的菌落形成单位（CFU的）。直接T细胞的感染和条件阻碍DC / T细胞接触产生很少或几乎没有级别的T细胞的感染。当被允许的DC / T细胞的接触，有T细胞transinfection，并且它是由抗原识别（+ OVAp）增强。柱条代表的3 I的平均ndependent实验。误差棒表示标准差。显著差异是由***表示，对应P <0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. T细胞transinfection定量流式细胞仪。代表散点图显示树突状细胞和T细胞的结合物transinfection过程之后。 CD4 + T细胞是小而圆的前向和侧向散射（FCS - SSC）斑点印迹显示，并为了很好地分化，它们进行染色用细胞追踪器（CMAC）。区议会表达的CD11c凡是不注CMAC，并于T CD4 + T细胞形状不规则较大。含有胞内细菌-GFP但阴性extracel感染的CD4 + T细胞细胞性细菌（6.19％），显示在右下象限。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
T细胞或T淋巴细胞是一种类型的白细胞中发挥在细胞介导的免疫中发挥中心作用，并属于适应性免疫反应26。 T细胞是难治被感染在体外 ，但一些报道表明，它们可以感染体内 14,15。 APC和T细胞的过程中免疫突触的紧密接触作为交换生物材料 13，包括某些病毒如HIV 11的平台。据最近表明，违背了教条，T细胞，适应性免疫细胞的范例，也能够有效地捕获细菌通过transinfection从感染的DC 11,16。在这里我们展示他的详细方案，以量化的T细胞细菌transinfection 在体外感染的BMDCs。
T细胞细菌transinfection是由抗原识别16增强。我们发现，通过使用CD4 + T细胞分离自OTII转基因小鼠识别特定OVAp，DC培养上清装载OVAp和感染不同的细菌（这里的数据是由肠道沙门氏菌介绍）小鼠。 CD4 + T细胞从OTII小鼠分离孵育与受感染的DC 30分钟，以允许免疫突触的形成。这里给出的数据对应于T细胞可以从发达国家在这短短的时间段捕获细菌。我们知道，T细胞再暴露于感染的DC导致更大的细菌捕获（未示出），但由于T细胞也破坏了具有摄取细菌非常快，在较长的DC / T细胞时的接触发生的细菌transinfection定量证明是困难。庆大霉素存活测定法是一种非常灵敏的方法来定量T细胞transinfection因为它能够检测一个单侵染细菌21。孵化与庆大霉素之后，刚刚杀死细菌外，T细胞分离并溶解到种子上的细菌培养基琼脂PL阿泰。 T细胞的形成缀合物与树突后隔离是在协议中的一个关键步骤。仅与污染物的小于2％的实验，应考虑在内。 DC的污染可以通过流式细胞仪和相应的低直流污染的CFU应减去进行测量。可替代地，CD4 + T细胞的纯度可以通过使用细胞分选得到改善。
另一种方法来定量T细胞transinfection是通过流式细胞术，使用表达GFP的细菌和与相容的荧光团标记的胞外细菌。这种方法的一个限制是，细菌有以表达绿色荧光蛋白是足够明亮的反对自体荧光背景检测感染的细胞。另外，细菌感染可能与树突状细胞跟踪器之前被染色。另一种方法是染色细胞外的细菌，透化的T细胞，然后标记所有细菌（细胞内+胞外）用不同的荧光染料。
关于这个协议的未来发展方向，我们正在试图建立一个协议，以量化T细胞捕获较长的论述后细菌感染的DC，使用细菌饰有磁性粒子的数量。 T细胞捕获细菌将保留磁性粒子，因此它应该很容易通过使用磁铁孤立他们。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
