Summary
Voici un protocole est présenté pour mesurer la capture bactérienne par les cellules T CD4 + qui se produit lors de la présentation de l'antigène par les cellules dendritiques transinfection de pré-infectées (DC). Nous montrons comment effectuer les mesures nécessaires: l'isolement de cellules primaires, infection de DC, DC / T la formation de conjugués de la cellule, et la mesure des bactérienne transfection de cellules T.
Introduction
Quand un agent pathogène infecte son hôte, il ya généralement une activation des réponses immunitaires innées et adaptatives, nécessaires à la clairance bactérienne. L'immunité innée est la première ligne de défense qui empêche la plupart des infections. L'immunité innée distinguer dans un des éléments précis de façon qui sont conservés parmi les grands groupes de micro-organismes (motifs moléculaires associés à des pathogènes, PAMP) 1. Les mécanismes de l'immunité innée sont les barrières physiques telles que la peau, les barrières chimiques (des peptides antimicrobiens, lysozyme) et les leucocytes innées, qui incluent les phagocytes (macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques), les mastocytes, les éosinophiles, les basophiles et les cellules tueuses naturelles 2. Ces cellules identifier et éliminer les agents pathogènes, soit en les attaquant par contact ou par phagocytose, qui comprend pathogène engloutissant et le meurtre. Ce système ne permet pas de défense à vie, contrairement à l'immunité adaptative, qui confèrent une mémoire immunologique contre pathogens. Le système immunitaire adaptatif est la deuxième ligne de défense et est capable de reconnaître et de réagir à des antigènes spécifiques de multiples microbienne et des substances non-microbiennes 3. Les principaux composants du système immunitaire adaptatif sont les lymphocytes, qui incluent les cellules B et T. Les cellules B sont impliqués dans la réponse humorale, sécrétant des anticorps contre des agents pathogènes ou de protéines exogènes. Cependant, les cellules T représentent l'immunité à médiation cellulaire, la modulation de la réponse immunitaire ou la sécrétion des cytokines tuer les cellules infectées par des agents pathogènes 4.
Les cellules présentant l'antigène (CPA), notamment les cellules dendritiques ou les macrophages, les constituants du système immunitaire inné, capables de reconnaître les agents pathogènes de phagocytent et des composants bactériens de processus en antigènes, qui sont présentés à la surface des cellules par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) 7.5. Après APC ont phagocyté pathogènes, ils migrent habituellement dans les ganglions lymphatiques, la vidange où ils interagissent avec Tcellules. Les lymphocytes T peuvent reconnaître des complexes peptide-CMH spécifiques par leurs récepteurs de lymphocytes T. La synapse immunologique (SI) a lieu dans l'interface entre un antigène APC-chargé et une présentation de l'antigène des lymphocytes pendant 8,9. Certaines bactéries peuvent survivre phagocytose et de diffuser systématiquement au sein des APC. Dans cette perspective, les APC infectés servent de réservoirs bactériens ou «chevaux de Troie» qui facilitent la propagation bactérienne 10. Le contact intime entre les APC et les lymphocytes qui ont lieu au cours de la formation IS fonctionnent également comme une plate-forme pour l'échange d'une partie des membranes, le matériel génétique et les exosomes et peut être détourné pour certains virus pour infecter les cellules T; ce processus est appelé transinfection 11-13.
Certaines bactéries pathogènes (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica et Shigella flexneri) peuvent envahir les lymphocytes T in vivo et modifier leur comportement 14-16. Nous avonsrécemment décrits que les lymphocytes T sont également capables de capturer les bactéries par transinfection de cellules dendritiques préalablement infectées (PED) au cours de la présentation de l'antigène 16. T capter cellule bactérienne par transinfection extrêmement plus efficace (1,000-4,000x) que les infections directes. T pathogène des cellules de capture et des bactéries non pathogènes, indiquant que transinfection est un processus piloté par les cellules T. Il est frappant, transinfected T (TIT) cellules tuées rapidement les bactéries capturées et ont fait plus efficacement que les phagocytes professionnels 16. Ces résultats, qui cassent un dogme de l'immunologie, montrent que les cellules de l'immunité adaptative peuvent exécuter des fonctions qui étaient prétendument exclusif de l'immunité innée. En outre, nous avons montré que les cellules de Tit sécrètent de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires et protéger contre les infections bactériennes in vivo.
Ici, nous présentons les différents protocoles utilisés pour étudier le processus de transinfection bactérienne dansun modèle de souris. Ce modèle est basé sur l'utilisation de cellules T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII, qui portent un TCR spécifique de peptide OVA 323-339 de (OVAp) dans le cadre de I-Ab 17 qui interagissent spécifiquement avec os bactérienne infectée marrow- PED dérivés (BMDCs) 18,19 chargés de OVAp, formant des synapses immunitaires stables.
T transinfection cellulaire peut être visualisée et suivie par microscopie de fluorescence. En outre, la cytométrie en flux peut être utilisé pour détecter les cellules infectées en tirant parti de la fluorescence émise par des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) 16,20. En outre, T transinfection cellulaire peut être quantifiée par une approche plus sensible, le test de survie gentamicine qui permet la mesure d'un grand nombre d'événements. La gentamicine est un antibiotique qui ne peuvent pas pénétrer dans les cellules eucaryotes. Par conséquent, en utilisant cet antibiotique permet la différenciation des bactéries intracellulaires qui a survécu à l'ajout fr antibiotiqueceux extracellulaires om qui ont été tués 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Remarque: Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d'éthique de la recherche de l'Universidad Autónoma de Madrid et menés sous la supervision de l'Universidad Autónoma de Madrid chef de la protection des animaux et de la santé, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés en exempts d'agents pathogènes (SPF) logements spécifiques et ils ont été euthanasiés par du personnel formé et qualifié à l'aide de dioxyde de carbone (CO 2) méthode de l'inhalation.
1. souris dérivées de moelle osseuse PED Différenciation et Infection
Remarque: La figure 1 résume cette première étape. Toutes les procédures doivent être effectuées dans la hotte partir de ce point, en utilisant uniquement des médias, des instruments, des embouts de pipette stériles et des boîtes de culture.
- Souris dérivées de moelle osseuse PED Différenciation
- Disséquer les tibias et les fémurs d'un C57 / BL6 souris 22 et transférer dans un plat en plastique avec 10 ml de milieu RPMI. Couper chaque épiphyse off, avec des ciseaux stériles et d'exposer la moelle osseuse, qui a une couleur rouge vif caractéristique.
- Infuser à l'intérieur de l'os avec 10 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon / BSA / EDTA PBS) en utilisant une seringue stérile sur une Petri stérile plat.
- Recueillir la suspension de cellules et centrifugation dans un tube à 600 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C).
- Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de chlorure d'ammonium-potassium-réception (ACK) du tampon de lyse (0,15 M de NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3 et EDTA 0,1 mM) et on incube pendant 30 secondes à la température ambiante afin d'éliminer les globules rouges.
- Ajouter 10 ml de milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et filtrer à travers un tamis cellulaire (70 um) pour éliminer les fragments d'os et des amas de cellules avant la centrifugation à la même vitesse (600 x g), parce que des amas ont été éliminés par filtration.
- Compter les cellules d'und ajuster à 5 x 10 5 cellules / ml avec du milieu RPMI 10% SVF (contenant 50 uM B-mercaptoéthanol, du pyruvate de sodium 1 mM) et ajouter 20 ng / ml murin de colonies facteur recombinant granulocyte-macrophage stimulante (rm-GM-CSF) en tant que concentration finale.
- Ajouter cette suspension à un stérile, la qualité microbiologique, 15 cm boîte de Petri, et de la culture dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2).
- Tous les trois jours, ralentissent les deux cellules non adhérentes et les cellules individuelles avec EDTA 5 mM dans du PBS et remettre en suspension à 5 x 10 5 cellules / ml de la densité cellulaire, du milieu frais contenant 20 ng / ml rm-GM-CSF.
- Maturation des CD et Antigen Chargement
- Au jour 9, remettre les cellules à 5 x 10 5 cellules / ml de la densité dans un milieu contenant 20 ng / ml rm-GM-CSF. Ensuite, ajouter 20 ng / ml de lipopolysaccharide (LPS) pour permettre l'expression du CMH-II élevée sur les cellules et incuber dans une culture traitée stérile plat 15 cm Petri non-tissulaire pendant 24 heures.
- Après unejour de LPS-stimulation, tacher certaines cellules DC avec des anticorps contre CD11c de la souris, MHCII et Gr-1 pour vérifier la différenciation des PED par cytométrie de flux. Un exemple d'analyse par cytométrie en flux des DC est représenté sur la Figure 3A et 3B.
- Incuber les DC (5 x 10 5 cellules / échantillon) avec un anticorps monoclonal anti-souris-CD16 / CD32 à 2,5 ug / ml de concentration finale dans 50 ul de PBS / BSA / EDTA par échantillon. Ensuite, ajouter 50 ul d'anticorps contre MHCII (IA / IE), CD11c et Gr-1 conjugué avec différents fluorochromes à 1: 100, 1: 200 et 1: 500 en / BSA tampon PBS / EDTA respectivement.
- Enfin, laver avec DC / BSA tampon PBS / EDTA et analyser par cytométrie de flux selon le protocole du fabricant.
Remarque: Si les cellules sont bien différenciées, les cellules sont prêtes pour l'antigène chargement.
- Wash DC avec du RPMI 10% de FBS (sans antibiotiques) et les incuber avec 10 ng / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) sur un tube en plastique dans 1 ml de IPMB 10% FBS par 5 x 10 6 PED pour un minimum de 1 heure à 37 ºC. Comme témoin négatif, laissez PED sans incubation avec OVAp.
- Infection des PED
- Infect DC à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 bactéries par des bactéries (10) à courant continu pendant 1 heure dans un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% CO 2).
- Laver les cellules DC 3x dans PBS et 1x en IPMB 10% de FBS et centrifuger à 450 xg afin de laver la plupart des bactéries extracellulaires. Enfin, remettre les cellules en milieu RPMI 10% SVF (sans antibiotiques) à 20 x 10 6 cellules / ml.
2. Isolement des lymphocytes T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII
Remarque: La figure 1 résume cette seconde étape. Les ganglions lymphatiques doivent être utilisés à la place de la rate pour isoler des cellules T CD4 +, car la proportion de lymphocytes T CD4 + dans les ganglions lymphatiquess (~ 50%) est plus grande que dans la rate (~ 25%) et donc la purification serait plus efficace.
- Assurez suspension unicellulaire de ganglions lymphatiques
- Retirer le inguinale, axillaire, brachiale, col de l'utérus et les nœuds lymphatiques mésentériques de souris transgéniques 23 OTII et transférer dans un récipient plat en plastique avec 10 ml de RPMI 10% FBS milieu.
- Ganglions lymphatiques Grind sous une hotte stérile en utilisant deux lames de microscope dépoli. Placez les ganglions lymphatiques sur un côté givré d'une lame de microscope, et frotter avec le côté givré de la deuxième diapositive jusqu'à organes ont été broyées.
- Laver suspension cellulaire unique dans un tampon PBS / BSA / EDTA.
- Filtrer les cellules si un tamis cellulaire (70 um) pour éliminer le tissu conjonctif et laver avec tampon PBS / BSA / EDTA.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 1 min à température ambiante afin d'éliminer les globules rouges.
- Isolement de cellules T CD4 +
- Laver à nouveau comme à l'étape 2.1.3 et comptageremettre en suspension les cellules à 100 x 10 à 6 cellules / ml dans / BSA tampon PBS / EDTA. Ajouter anticorps biotinylés contre CD8, IgM, B220, CD19, CMH de classe II (I-Ab), CD11b, CD11c et DX5 au 1: 250 pendant 30 min sur de la glace pour la sélection tard négatif de cellules T CD4 +.
- Laver les cellules dans / BSA tampon PBS / EDTA et on incube les cellules (100 x 10 6 cellules / ml) avec des microbilles de streptavidine à la concentration recommandée dans le protocole du fabricant pendant 15 minutes sur de la glace.
- Laver les cellules dans / BSA tampon PBS / EDTA et filtrer si un tamis cellulaire (30 um) avant l'isolement de cellules T CD4 +.
- Isoler les cellules T CD4 + par une sélection négative en utilisant un appareil de séparation magnétique de cellules selon le protocole du fabricant.
- Compter les cellules et ajuster 4 x 10 6 cellules / ml avec du RPMI 10% FBS (sans antibiotiques).
- Fixer et de garder sur les cellules T CD4 + de glace isolé (3 x 10 5 cellules) pour vérifier la pureté par le fluxcytomètre de la manière décrite 24. Un exemple de cellules T CD4 + purification est représenté sur la figure 3C.
3. cellules T Transinfection mesure par dosage protection gentamicine
Remarque: La figure 2 résume cette troisième étape du protocole.
- T Transinfection cellulaire
- Incuber les cellules T CD4 + isolées avec des cellules infectées DC (1: 1) (les pays en développement ont été infectées pendant 1 h et lavé pour éliminer les bactéries libres) pendant 30 minutes pour permettre la formation de la synapse dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2).
- Ajouter 0,5 ml de cellules T CD4 + isolées (2 x 10 6 cellules) et 0,1 ml des CD infectées (2 x 10 6 cellules) sur une plaque de culture à 24 puits. Comme contrôle négatif, infecter directement 0,5 ml de cellules T CD4 + à une MOI de 10 bactéries pendant 30 min.
- Inclure des contrôles supplémentaires qui séparent DC infectées à partir de cellules T à l'aideune barrière polycarbonate Transwell (avec 3 um de taille de pore), ce qui empêche DC-T contact physique. Ajouter 0,1 ml de DC à l'intérieur du transwell et 0,5 ml de cellules T CD4 + dans le compartiment inférieur du puits (plaque 24 puits).
- Enfin, complet avec support IPMB jusqu'à ce qu'il y est de 0,6 ml dans chaque puits pour faire des volumes égaux dans tous les échantillons.
- Après 30 min de la formation des synapses immunitaire, ajouter 100 pg / ml de gentamicine et incuber pendant 1 heure avant de recueillir les cellules dans un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% CO 2).
- Re-isolement de cellules T CD4 +
- Recueillir les cellules non adhérentes et les remettre en suspension dans du tampon PBS / BSA / EDTA. La plupart des pays en développement restent attachés à la plaque de culture en plastique. Tubes Vortex doucement pour assurer la désagrégation de la cellule. Gardez 500 pi de surnageant cellulaire que le contrôle de montrer que la gentamicine a bien fonctionné.
- Ré-isoler les cellules T CD4 + à partir d'échantillons contenant les DC et les cellules T en même temps que dans l'étape 2.2, Bien que la plupart des pays en développement auraient fixé sur la plaque. Gardez les échantillons de contrôle sur la glace. Prenez en compte que les expériences de contamination inférieur à 2%. Un exemple de cellules T CD4 + après purification transinfection est représenté sur la figure 3D.
- Lyse cellules T et les épépiner sur Bactéries Plaques Moyen-agar.
- Laver les cellules T CD4 + deux fois avec du PBS.
- Compter les cellules et remettre en suspension les 2 à 6 x 10 cellules / ml dans du PBS.
- Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 dans 500 ul de cellules T pour les lyser à 1 x 10 6 cellules / ml, en libérant les bactéries intracellulaires sur les cellules T.
- Faire des dilutions en série 3 décimales de cellules lysées et ensemencer 50 ul de chaque dilution sur des plaques de gélose bactéries moyennes. Diviser plaques en 4 portions et épépiner les différentes dilutions de cellules lysées dans chaque partie. Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 4.
- Comme témoin, la plaque aussi lestocké surnageant cellulaire des conjugués sur de la gélose, de sorte que la gentamicine a bien fonctionné. Aussi plaque DC infectées comme un contrôle supplémentaire. En cas de contamination se produit à faible PED (<2%), soustraire les unités formant colonie (UFC) correspondant à la contamination DC faible.
4. Quantification des cellules T Transinfection par cytométrie en flux
Remarque: La figure 2 résume cette étape.
- T Mobile Transinfection
- Infecter BMDCs comme dans l'étape 1.3, mais utiliser GFP exprimant bactéries dans ce cas.
- Stain cellules CD4 + T (isolés à partir de ganglions lymphatiques dans l'étape 2.2) avec un aminocoumarine tracker cellule de chlorométhyle (CCMC) pendant 30 min à 37 ºC selon le protocole du fabricant.
- Laver les cellules T CD4 + marqués deux fois avec IPMB 10% de FBS (sans antibiotiques).
- Incuber DC infectées (après 1 h d'incubation avec des bactéries) avec marqué CD4 +Les cellules T pour 30 min pour permettre la formation de synapse immunologique à 37 ºC, y compris tous les contrôles expliquant à l'étape 3.1.1.
- Coloration des cellules infectées par T CD4 +
- Après 30 min de DC-T création de la synapse, recueillir des cellules et lavez-les dans du PBS / BSA / EDTA.
- Après deux lavages avec du tampon PBS / BSA / EDTA, les cellules agrégés distincts par vortex doucement les tubes.
- Fixer les échantillons dans 0,2 ml / tube de PBS contenant 3% de PFA pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez-les dans du PBS.
- Incuber avec l'anticorps monoclonal anti-souris-CD16 / CD32 (2,5 pg / ml) dans 50 ul / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 15 minutes sur de la glace pour bloquer les récepteurs Fc des cellules dendritiques.
- Ajouter un lapin anti-bactéries anticorps (10 pg / ml comme concentration finale) à 50 ul / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 30 minutes sur de la glace pour colorer les bactéries extracellulaires.
- Laver les cellules avec du PBS / BSA / EDTA et on incube avec un anticorps contre CD11c de souris conjugué à de la phycoérythrine (PE) et un soicondaire anticorps contre lapin conjugué avec d'autres comme fluorochrome Alexa-Fluor 647 au 1: 200 dans 100 pi / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 30 minutes sur la glace.
- Laver les cellules et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Ne pas oublier d'inclure un échantillon de cellules T transinfected utilisant des bactéries non-fluorescentes comme contrôle négatif et les échantillons étiquetés avec un seul de chaque fluorochrome utilisé dans l'expérience pour compenser les échantillons et d'ajuster la cytométrie de flux paramètres 25. Analyse représentative est représentée sur la Figure 5.
Remarque: si les bactéries ne pas exprimer la GFP, de distinguer les bactéries extracellulaires et intracellulaires, extracellulaires étiquette bactéries, en fixer et perméabiliser les échantillons avec du Triton X-100 à 0,5% dans du PBS pendant 5 min. Ensuite tacher bactéries intracellulaires totaux (+ extracellulaire) avec un fluorochrome différent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ici, nous avons décrit comment effectuer transinfection bactérienne des cellules T murin de la moelle osseuse infectée dérivée-PED et comment mesurer transinfection bactérienne via deux approches différentes: la cytométrie en flux et de la gentamicine survie dosage figure 1 résume la procédure pour obtenir les cellules.. DCs sont générés par incubation de cellules de moelle osseuse avec le GM-CSF pendant 9 jours. Ensuite, les PED sont maturée avec LPS pour augmenter MHCII sur sa membrane pour les charger plus tard avec un peptide spécifique de l'OVA (OVAp). Comme contrôle, certains pays en développement ne sont pas chargées avec OVAp. Les deux contrôleurs de domaine (OVAp-chargées et non-chargées) sont infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 bactéries. D'autre part, les cellules T CD4 + sont isolées à partir des ganglions lymphatiques de souris transgéniques OTII, qui reconnaissent la OVAp spécifique. La figure 2 illustre la procédure à effectuer et quantifier transinfection des cellules T, y compris les témoins négatifs appropriés. Comme descrilit avant, certains pays en développement ne sont pas chargées avec OVAp. Dans ce cas, il ya une interaction entre les PED et les cellules T, mais pas à l'abri la formation des synapses en raison de l'absence de OVAp. Un contrôle supplémentaire est inclus, en séparant les PED et les cellules T avec une barrière polycarbonate Transwell (avec 3 um de la taille des pores), qui empêche DC-T contact physique. PED sont inclus à l'intérieur du transwell; par conséquent, ils ne sont pas capables de passer à travers cette taille de pores. Un autre témoin négatif est également incorporé, l'infection directe des cellules T, en incubant des cellules T directement à une MOI de 10 bactéries. T transinfection cellulaire peut être quantifiée par deux approches: la cytométrie en flux ou une analyse de survie de la gentamicine. Pour mesurer par cytométrie de flux, les PED aurait été infecté précédemment avec des cellules des bactéries-GFP et T CD4 + tache avec un tracker cellulaire (cellules T-bleu). Après la formation conjugué, les cellules doivent être colorés avec des anticorps contre les PED (CD11c-PE). Les bactéries extracellulaires devraient également être colorées afin de QUANTIFy le pourcentage de cellules T CD4 + infectées par cytométrie de flux par la suite. Pour mesurer transinfection par dosage de survie gentamicine, les cellules sont incubées avec la gentamicine pendant 1 heure pour tuer les bactéries extracellulaires, puis les cellules T sont réisolés pour ensemencer sur plaque de gélose. Des dilutions en série sont faites décimaux pour ensemencer 50 ul de chaque dilution sur plaque de gélose et de faciliter le comptage des CFU.
Comme le montre la figure 3, la différenciation DC doit être vérifiée par cytométrie de flux (figure 3A et 3B). DC devrait exprimer CD11c et MHCII (figure 3A) et non Gr-1, qui est un marqueur des neutrophiles. Comme présenté dans la figure 3B, certains neutrophiles (3,27% du Gr-1 +, CMH -) ont été présentés dans la culture, mais la culture PED avec plus de 5% de la contamination des neutrophiles ne devraient pas être utilisés. Cellules T CD4 + pureté doit être vérifié après l'isolement de Lynœuds mph (figure 3C) et après la séparation de DC conjugue formation (Figure 3D). Prendre en compte les expériences avec moins de 2% des contaminants après la formation de conjugués.
La figure 4 montre un exemple d'expérience de transinfection T en utilisant Salmonella. Comme illustré sur la figure 4A, les plaques sont divisés en quatre parties pour ensemencer les dilutions en série dans chaque partie. Salmonella ont poussé sur plaques de gélose LB et les unités formant des colonies peuvent être comptées. Comme représenté sur la figure 4A, Salmonella a été capturé par les cellules T infectées et à partir de DCs ce processus a été nettement améliorée avec reconnaissance OVAp (plaques du côté gauche de la figure 4A et la figure 4B). Cependant, quand il y avait une barrière physique empêchant le contact entre les cellules DCS et T, il n'y avait pratiquement pas de transinfection, comme dans le cas de faire directement un T l'infection des cellules (des assiettes sur la droite de la figure 4A et la figure 4B).
Comme le montre la Figure 5, des cellules T transinfection peut être quantifiée par cytométrie de flux en utilisant des bactéries exprimant une GFP lumineux. Cellules DCS et T peuvent être différenciés selon la taille et la complexité dans un complot avant et diffusion latérale, mais différents marqueurs peuvent être utilisés pour bien les distinguer. Cellules T CD4 + ont été marquées avec un tracker cellulaire (CCMC) et DCS avec un anticorps contre CD11c. Bactéries extracellulaires ont été colorées avec un anticorps de lapin contre Salmonella et l'anticorps anti-lapin secondaire conjugué à Alexa Fluor 647. Par conséquent, le pourcentage de cellules T CD4 + infectées peuvent être quantifiés car ils sont étiquetés avec CCMC (pas de CD11c-PE) et exprimé GFP (bactéries-GFP), mais ils ne sont pas colorées avec l'anticorps contre les bactéries extracellulaires (Alexa Fluor 647).
MÉNAGEMENT "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figure 1. tableau de flux de production DC et T CD4 + cellules d'isolement. Sur le côté gauche de la figure, le processus de différencier les cellules dendritiques (CD) à partir de cellules de la moelle osseuse est détaillée. Après dissection fémurs et tibias, cellules de moelle osseuse sont extraits de l'intérieur de l'os. Par la suite, les globules rouges (RBC) sont lysées et cellules de moelle osseuse sont mis en culture avec le facteur de stimulation de colonies murin recombinant granulocyte-macrophage (GM-CSF) pendant 9 jours. Une fois qu'ils sont bien différenciés, les PED sont incubées avec le lipopolysaccharide (LPS) pour augmenter complexe majeur d'histocompatibilité II (MHCII) expression. Ensuite, les DC sont chargées avec un peptide spécifique ovalbumine (OVAp) et infectées avec une multiplicité d'infection (MOI) de 10 bactéries. Certains d'entre eux ne sont pas chargées avec OVAp comme témoin. Sur le côté droit de la figure, commentisoler les cellules T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII est représenté. Les ganglions lymphatiques (LNS) sont enlevés et le sol, l'obtention d'une suspension à cellule unique. Enfin, les cellules T CD4 + sont isolées par sélection négative en utilisant une machine de séparation magnétique de cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Organigramme de T procédure de transinfection cellulaire. Infected (bactéries sont représentés en vert) et OVAp chargés-PED (cellules rouges) sont incubées avec des cellules T CD4 + (cellules bleues) pour permettre la formation de la synapse immunitaire. DC infectées (mais pas chargé avec OVAp) sont également incubés avec des cellules T, qui permet l'interaction entre les deux cellules mais sans création de la synapse. Un contrôle supplémentaire est inclus, séparant CD4 + S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. cytomètre de flux analyse de moelle osseuse dérivée-PED et les cellules T CD4 + isolées. Tracés de points représentatifs de la moelle osseuse provenant-DCS analysés parcytométrie de flux. (A) PED exprimé MHCII et CD11c (85,8%; quadrant supérieur droit) (B) PED exprimé MHCII mais pas Gr-1 (85%; quadrant inférieur droit). Cependant, il y avait un 3,27% des cellules qui exprimaient des cellules CMH II GR-1 (mais pas quadrant supérieur gauche). Ces cellules ont été légères neutrophiles contaminés. (C et D) histogrammes représentant la pureté des cellules T CD4 + isolées à partir de ganglions lymphatiques (C), et après la formation de conjugués avec des cellules dendritiques (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. T transinfection cellulaire quantifié par un essai de survie gentamicine. Plaques d'agar LB ont été divisés en 4 parties correspondant à Décimal dilutions en série de cellules T CD4 + lysées. (A) unités formant des colonies de Salmonella enterica augmenté sur des plaques de gélose LB correspondant à T transinfection des cellules en présence (+) ou absence (-) de OVAp sur la surface de DC infectées et dans des conditions permettant un contact continu / cellules T (- TW) ou en présence d'une barrière physique empêchant de tels contacts (+ TW). Une assiette vide correspondant à l'infection des cellules T directe (contrôle négatif) est également affiché. Il n'y avait presque pas de transinfection lorsque DC / T contact cellulaire a été entravée (+ TW). (B) Quantification des unités formant colonie (UFC) de plusieurs expériences montrant le taux de bactéries capturés par les cellules T de DC infectées. L'infection directe des cellules T, et les conditions entravant DC / T contact cellulaire produisent peu ou pas de niveaux d'infection de cellules T. Lorsque les contacts de cellules DC / T ont été autorisés, il y avait des cellules T transinfection, et elle a été améliorée par reconnaissance de l'antigène (+ OVAp). Barres de colonnes représentent la moyenne de 3 independent expériences. Les barres d'erreur indiquent la SD. Des différences significatives sont représentés par ***, correspondant à p <0,0001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. T transinfection cellulaire quantifiée par cytométrie de flux. Dot plot Représentant montrant les PED et les conjugués de cellules T après le processus de transinfection. Lymphocytes T CD4 + sont petites et rondes comme avant et la dispersion latérale (FCS - SSC) montre dot blot, et afin d'être bien différenciée, ils ont été colorées avec un tracker cellulaire (CCMC). DC exprimant CD11c ne sont pas étiquetés avec le CCD et sont plus grandes que les cellules de forme irrégulière T T CD4 +. Cellules T CD4 + infectés contenant des bactéries-GFP intracellulaire mais négatif pour extracelbactéries lulaires (6,19%) sont présentés dans le quadrant inférieur droit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellules T ou lymphocytes T sont un type de leucocytes qui jouent un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire et appartiennent à la 26 réponse immunitaire adaptative. Les cellules T sont réfractaires à être infectés in vitro mais certains rapports indiquent qu'ils peuvent être infectés in vivo 14,15. Les contacts intimes de cellules APC et T au cours de synapse immunologique servent de plates-formes d'échange de matériel biologique 13, y compris certains virus tels que le VIH 11. Il a été récemment montré que, contrairement au dogme, les cellules T, le paradigme de cellules de l'immunité adaptative, sont également capable de capturer efficacement les bactéries par transinfection de DC infectées 11,16. Ici, nous montrons il a détaillé les protocoles de quantifier les cellules T transinfection bactérienne in vitro à partir BMDCs infectées.
Lymphocytes T transinfection bactérienne a été renforcée par la reconnaissance de l'antigène 16. Nous avons montré que l'utilisation de cellules T CD4 + isolé à partir deSouris transgéniques OTII reconnaissant un OVAp spécifique, BMDCs chargés avec OVAp et des souris infectées par des bactéries différentes (ici des données sont présentées à partir de Salmonella enterica). Des cellules T CD4 + isolées à partir des souris OTII sont incubées avec des DC infectées pendant 30 min pour permettre la formation de la synapse immunologique. Les données présentées ici correspondent aux bactéries que les cellules T peut capturer de PED dans ce court laps de temps. Nous savons que de plus longues expositions de cellules T à DC infectées ont donné lieu à des captures bactériennes plus grands (non représenté), mais que les cellules T détruisent également les bactéries uptaken très rapidement, la quantification des transinfection bactérienne survenant pendant les longs DC / T contacts de temps de cellule avérée difficile . Essai de survie gentamicine est un procédé très sensible de quantifier des cellules T transinfection car il est capable de détecter une seule bactérie infectante 21. Après incubation avec la gentamicine qui tuent les bactéries extracellulaires seulement, les cellules T sont isolés et lysées pour ensemencer sur les bactéries milieu gélose plAtes. L'isolement des lymphocytes T après la formation de conjugués avec des DC est une étape critique dans le protocole. Seuls les expériences avec moins de 2% de contaminants doivent être pris en compte. Contamination DC peut être mesurée par cytométrie de flux et UFC correspondant à la contamination DC bas devraient être soustraites. En variante, les cellules T CD4 + pureté peut être améliorée en utilisant le tri de cellules.
Une autre approche pour quantifier transinfection de cellule T est par cytométrie en flux, en utilisant des bactéries exprimant la GFP et le marquage des bactéries extracellulaires compatible avec un fluorophore. Une limitation de cette approche est que les bactéries ont à exprimer une GFP qui est suffisamment lumineux pour détecter les cellules infectées par le fond d'autofluorescence. Alternativement, les bactéries peuvent être colorées avant d'infecter les PED avec un tracker cellule. Une autre approche serait la coloration des bactéries extracellulaires, perméabilisant les cellules T, puis étiqueter toutes les bactéries (+ intracellulaire extracellulaire)avec un fluorochrome différent.
En ce qui concerne les orientations futures de ce protocole, nous essayons de mettre en place un protocole de quantifier le nombre de cellules T qui a capturé les bactéries après plus exposé aux PED infectés, en utilisant des bactéries décorées avec des particules magnétiques. Cellules T capture bactéries pourraient conserver les particules magnétiques et il devrait donc être facile de les isoler à l'aide d'aimants.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
