Summary
הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה של transfection תא T חיידקים.
Introduction
כאשר הפתוגן מדביק המארח שלה, בדרך כלל יש הפעלה של המערכת החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות, הכרחי לקבלת אישור בקטריאלי. חסינות מולדת היא קו הגנה הראשון המונע הזיהומים ביותר. חסינות מולדת להבחין באלמנטים מדויקים דרך שהשתמרו בקרב קבוצות רחבות של מיקרואורגניזמים (הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, PAMPS) 1. המנגנונים של מערכת חיסון מולדת כוללים מחסומים פיזיים כגון עור, מחסומי כימיקלים (פפטידים מיקרוביאלית, יזוזים) וכדוריות דם לבנות המולדים, הכוללים את phagocytes (מקרופאגים, נויטרופילים, ותאים דנדריטים), תאי פיטום, אאוזינופילים, בזופילים, ותאי הרג טבעיים 2. תאים אלה לזהות ולחסל פתוגנים, בין אם על ידי תוקף אותם באמצעות מגע או באמצעות phagocytosis, הכולל מחולל האופפת והרג. מערכת זו אינה מאפשרת הגנה לכל החיים, בניגוד לחסינות אדפטיבית, המעניק זיכרון חיסוני כנגד עמ 'athogens. המערכת החיסונית אדפטיבית היא קו הגנה השני, והוא מסוגל לזהות ולהגיב לאנטיגנים ספציפיים של חיידקים מרובים וחומרים שאינם חיידקים 3. המרכיבים העיקריים של המערכת החיסונית אדפטיבית הם לימפוציטים, הכוללים תאי B ו- T. תאי B מעורבים בתגובת הלחות, מפריש נוגדנים נגד פתוגנים או חלבונים אקסוגניים. עם זאת, תאי T מייצגים את חסינות התא בתיווך, ויסות התגובה החיסונית עם הפרשת ציטוקינים או תאים נגועים בפתוגן הרג 4.
תאי הצגת אנטיגן (נגמ"שים) כוללים תאים דנדריטים או מקרופאגים, מרכיבים של מערכת החיסון המולדת, יכול לזהות פתוגנים phagocytose ורכיבי חיידקי תהליך לאנטיגנים, המוצגים על פני התא על ידי histocompatibility סרן מורכב (MHC) 5-7. לאחר נגמ"שים שphagocytized פתוגנים, הם בדרך כלל להעביר לבלוטות הלימפה ניקוז, שבו הם מתקשרים עם Tתאים. לימפוציטים מסוג T יכול לזהות מתחמי פפטיד-MHC ספציפיים על ידי קולטני תאי T שלהם. סינפסה החיסונית (IS) מתרחשת בממשק שבין APC-עמוס אנטיגן והלימפוציטים במהלך מצגת אנטיגן 8,9. חיידקים מסוימים יכולים לשרוד phagocytosis ולהפיץ באופן שיטתי בתוך נגמ"שים. בתצוגה זו, נגמ"שים נגועים לשמש כמאגרי חיידקים או "סוסים טרויאניים" המאפשרים התפשטות חיידקי 10. קשר האינטימי בין נגמ"שים וימפוציטים שיתקיימו במהלך ההיווצרות גם לתפקד כפלטפורמה להחלפה של חלק מקרומים, חומר גנטי וexosomes ויכול להיות שנחטף לכמה וירוסים להדביק תאי T; תהליך זה נקרא transinfection 11-13.
כמה חיידקים פתוגניים (חיידקי ליסטריה, סלמונלה enterica וflexneri Shigella) יכולים לפלוש לימפוציטים מסוג T in vivo ולשנות את ההתנהגות שלהם 14-16. יש לנותאר לאחרונה כי לימפוציטים מסוג T הוא גם מסוגל לתפוס חיידקים על ידי transinfection מהתאים דנדריטים נגועים בעבר (DCS) במהלך הצגת אנטיגן 16. תא T ללכוד חיידקים על ידי transinfection מאוד יעיל יותר (1,000-4,000x) מאשר זיהומים ישירים. הפתוגן T ללכוד תאים וחיידקים שאינם פתוגן המציין מ transinfection הוא תהליך מונע על ידי תאי T. באופן מפתיע, transinfected T (ציצי) תאים נהרגו במהירות את החיידקים שנתפסו ועשו זאת בצורה יעילה יותר מאשר phagocytes המקצועי 16. תוצאות אלו, שתשבורנה דוגמה לאימונולוגיה, מראות כי התאים של חסינות אדפטיבית יכולים לבצע פעולות שהיו כביכול בלעדיים של החסינות המולדת. בנוסף, הראינו כי תאי ציצי מפרישים כמויות גדולות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ולהגן מפני זיהומים חיידקיים בvivo.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים השונים המשמשים ללימוד תהליך transinfection חיידקים במודל עכבר. מודל זה מבוסס על השימוש בתאים מסוג CD4 + T מעכברים מהונדסים OTII, אשר נושאים ספציפי TCR לפפטיד 323-339 של OVA (OVAp) בהקשר של I-17 Ab כי אינטראקציה ספציפית עם עצם חיידקים נגוע מארו DCs נגזר (BMDCs) 18,19 עמוס OVAp, יוצר סינפסות חיסוני יציבה.
transinfection תא T ניתן דמיין ומעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש לזיהוי תאים נגועים על ידי ניצול של הקרינה הנפלטת ידי חיידקים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 16,20. יתר על כן, transinfection תא T ניתן לכמת על ידי גישה רגישה יותר, assay הישרדות גנטמיצין המאפשר מדידה של מספר גדול של אירועים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה שלא יכול לחדור תאים האיקריוטים. לכן, שימוש באנטיביוטיקה זו מאפשרת בידול של חיידקים תאיים ששרד את fr בנוסף לאנטיביוטיקהאלה תאיים אום שנהרגו 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: נהלי ניסוי אושרו על ידי הוועדה לחקר אתיקה של Universidad de האוטונומית מדריד ונערכו בפיקוחו של Universidad de האוטונומי מדריד ראש רווחת בעלי החיים והבריאות בהתאם להנחיות ספרדיות ואירופאיות. עכברים גדלו בדיור ספציפי הפתוגן חופשי (SPF) והם מורדמים על ידי צוות מיומן ומוסמך באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שיטת שאיפה.
1. עכבר מח עצם נגזר DCs בידול וזיהום
הערה: איור 1 מסכם הצעד הראשון הזה. צריכה להתבצע כל הנהלים בברדס מנקודה זו ואילך, רק באמצעות תקשורת, מכשירים, טיפים פיפטה סטרילית ומנות תרבות.
- בידול DCs נגזר מח עצם עכבר
- לנתח tibias ועצמות ירך מאחד C57 / BL6 עכבר 22 ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI. חותך כל epiphysis את, עם מספריים סטרילי ולחשוף מח עצם, שבו יש צבע אדום בהיר אופייני.
- להשרות את החלק הפנימי של העצם עם 10 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) וחומצת 5 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ / BSA / EDTA PBS) באמצעות מזרק סטרילי על פטרי סטרילי צַלַחַת.
- אסוף את ההשעיה תא צנטריפוגות בצינור ב 600 XG בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס).
- Resuspend תאי 1 מיליליטר של אמוניום-כלוריד-אשלגן חיץ (ACK) lysing (0.15 מ '4 Cl NH, 10 מ"מ KHCO 3 ו 0.1 mM EDTA) דגירה במשך 30 שניות בRT כדי לחסל תאי דם אדומים.
- הוסף 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ולסנן דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר שברי עצמות וגושי תא לפני צנטריפוגה באותה המהירות (600 XG) כי גושים בוטלו על ידי סינון.
- ספירת התאיםד להתאים ל5 x 10 5 תאים / מיליליטר עם RPMI 10% FBS (B-mercaptoethanol 50 מיקרומטר המכיל, פירובט נתרן 1 מ"מ) ולהוסיף 20 ng / ml גורם רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג שולט בקולוניה- גירוי (RM-GM-CSF) כריכוז סופי.
- הוסף השעיה זו לאיכות סטרילי, מיקרוביולוגים, 15 סנטימטר צלחת פטרי, ותרבות בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- כל שלושה ימים, ספין למטה שני תאים שאינם חסיד ותאים מנותקים עם 5 מ"מ EDTA ב PBS וגלול בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות תאים, עם מדיום טרי המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF.
- התבגרות של טעינת DCs וAntigen
- ביום 9, resuspend התאים בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות במדיום המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF. ואז להוסיף 20 ng / ml של lipopolysaccharide (LPS) כדי לאפשר ביטוי גבוה MHC-II בתאי דגירה בצלחת שטופלה תרבות הלא-רקמת סטרילי 15 סנטימטר פטרי במשך 24 שעות.
- לאחר אחדיום של LPS-גירוי, להכתים כמה תאי DC עם נוגדנים נגד CD11c עכבר, MHCII וGr-1 כדי לבדוק בידול DCs על ידי cytometry זרימה. דוגמא לניתוח cytometry הזרימה של DCs מוצגת באיור 3 א ו3B.
- דגירה DCS (5 x 10 5 תאים / מדגם) עם נוגדנים חד שבטיים נגד העכבר-CD16 / CD32 על 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר של ריכוז סופי ב -50 μl PBS / BSA EDTA חיץ / לדגימה. לאחר מכן, להוסיף 50 μl של הנוגדנים נגד MHCII (IA / IE), CD11c וGr-1 מצומדות עם fluorochromes שונה ב1: 100, 1: 200 ו- 1: 500 ב- PBS / BSA / חיץ EDTA בהתאמה.
- לבסוף, לשטוף DCs עם PBS / BSA / חיץ EDTA ולנתח ידי cytometry זרימה על פי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: אם התאים מובחנים היטב, תאים מוכנים לטעינת אנטיגן.
- לשטוף DCs עם RPMI 10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) דגירה אותם עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) בצינור פלסטיק 1 מיליליטר של RMPI 10% בינוניים FBS לכל 5 x 10 6 DCs עבור שעה 1 המינימום ב 37 מעלות צלזיוס. כביקורת שלילית, לעזוב DCs ללא דוגרים עם OVAp.
- זיהום של DCs
- להדביק DCs על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים (10 חיידקים לDC) לשעה 1 בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- לשטוף את תאי DC פי 3 ב- PBS ו1x בFBS 10% RMPI צנטריפוגות ב 450 XG כדי לשטוף את רוב החיידקים תאיים. לבסוף, תאים גלולים ב 10% בינוניים RMPI FBS (ללא אנטיביוטיקה) בשעת 20 x 10 6 תאים / מיליליטר.
2. בידוד של CD4 + T לימפוציטים מעכברים הטרנסגניים OTII
הערה: איור 1 מסכם שלב שני זה. יש להשתמש בבלוטות הלימפה במקום טחול לבודד תאי CD4 + T, כי חלקם של לימפוציטים מסוג CD4 + בבלוטה לימפהs (~ 50%) הוא גדול יותר מאשר בטחול (~ 25%) ולכן הטיהור תהיה יעילה יותר.
- הפוך השעיה תא בודד של בלוטות לימפה
- הסר מפשעתי, בבית השחי, זרוע, צוואר רחם וימפה mesenteric צמתים 23 מעכברים מהונדסים OTII ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של 10% בינוניים FBS RPMI.
- בלוטות לימפה לטחון מתחת למכסת מנוע סטרילי באמצעות שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות לימפה בצד חלבית של שקופית מיקרוסקופ אחד, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד איברים היו קרקע.
- לשטוף השעיה תא בודדת במאגר PBS / BSA / EDTA.
- סנן את התאים למרות מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר רקמות חיבור ולשטוף עם PBS / BSA / חיץ EDTA.
- Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ACK דגירה דקות 1 ב RT כדי לחסל תאי דם אדומים.
- בידוד של תאי CD4 + T
- לשטוף שוב כמו בשלב 2.1.3 וספירהתאי resuspend אותם ב 100 x 10 6 תאים / מיליליטר PBS / BSA / חיץ EDTA. להוסיף נוגדני biotinylated נגד CD8, IgM, B220, CD19, MHC class II (I-Ab), CD11b, CD11c וDX5 ב 1: 250 במשך 30 דקות על קרח לבחירה מאוחר יותר שלילית של תאי CD4 + T.
- לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA דגירה התאים (100 x 10 6 תאים / מיליליטר) עם microbeads streptavidin בריכוז מומלץ בפרוטוקול של היצרן במשך 15 דקות על קרח.
- לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA ולסנן אותם למרות שמסננת תא (30 מיקרומטר) לפני הבידוד של תאי CD4 +.
- בודד תאי CD4 + T על ידי סלקציה שלילית באמצעות מכונה הפרדת תא מגנטית על פי הפרוטוקול של היצרן.
- ספירת התאים ולהתאים עד 4 x 10 6 תאים / מיליליטר עם 10% בינוניים RPMI FBS (ללא אנטיביוטיקה).
- לתקן ולשמור על תאי קרח מבודד CD4 + T (3 x 10 5 תאים) כדי לבדוק את טוהר על ידי זרימהcytometer כמתואר 24. דוגמא לטיהור תאי CD4 + T מוצגת באיור 3 ג.
3. תא T Transinfection מדידה על ידי assay הגנת גנטמיצין
הערה: איור 2 מסכם שלב שלישי זה של הפרוטוקול.
- Transinfection תא T
- דגירה תאי CD4 + T מבודדים עם תאים נגועים DC (1: 1) (חיידקים חופשיים DCs נדבקו לשעת 1 ורחץ לחסל) למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- הוסף 0.5 מיליליטר של תאים מבודדים CD4 + T (2 x 10 6 תאים) ושל 0.1 מיליליטר של DCs הנגוע (2 x 10 6 תאים) על צלחת תרבות 24 גם. כביקורת שלילית, להדביק ישירות 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T במשרד פנים של 10 חיידקים למשך 30 דקות.
- כולל בקרות נוספות הפרדת DCs נגוע מתאי T באמצעותמחסום transwell פוליקרבונט (עם 3 מיקרומטר של גודל נקבובית), מונע מגע פיזי DC-T. להוסיף 0.1 מיליליטר של DCs בתוך transwell ו 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T לתא התחתון של הקידוח (24 גם צלחת).
- לבסוף, להשלים עם מדיום RMPI עד שיש 0.6 מיליליטר בכל טוב לעשות כמויות שווה בכל הדגימות.
- לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של גנטמיצין ודגירה עבור שעה 1 לפני איסוף תאים בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- Re-הבידוד של תאי CD4 + T
- איסוף תאים שאינם חסיד וresuspend אותם במאגר PBS / BSA / EDTA. רוב DCs נשאר צמוד לצלחת תרבות הפלסטיק. צינורות מערבולת בעדינות כדי להבטיח disaggregation תא. שמור 500 μl של supernatant תא בקרה כדי להראות שגנטמיצין עבד היטב.
- לבודד-מחדש תאי CD4 + T מדגימות המכילות DCs ותאי T יחד כמו בשלב 2.2, אם כי רוב DCs צריך מצורף על הצלחת. שמור את דגימות שליטה על קרח. קח בחשבון רק ניסויים עם זיהום פחות מ -2%. דוגמא לסוג CD4 + T טיהור תאים לאחר transinfection מוצגת באיור 3D.
- תאי T Lyse וזרעם על חיידקים צלחות בינוניים-אגר.
- לשטוף את תאי CD4 + T פעמיים עם PBS.
- ספירת תאי resuspend אותם ב 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ב PBS.
- הוסף 500 μl של 0.1% Triton X-100 ב -500 μl של תאי T לlyse ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר, משחרר את החיידקים מחוץ לתאי T תאיים.
- לעשות 3 דילולים עשרוניים סידוריים של תאי lysed וזרע 50 μl של כל דילול על צלחות אגר בינוניות חיידקים. לחלק צלחות ל -4 חלקים וזרע דילולים השונים של תאי lysed בכל חלק. תוצאות נציגים מוצגות באיור 4.
- כביקורת, גם צלחתsupernatant מאוחסן תא של conjugates על אגר, כדי להבטיח גנטמיצין שעבד היטב. גם צלחת DCs הנגוע כבקרה נוספת. במקרה זיהום DCs נמוך מתרחש (<2%), להפחית את יחידות המושבה להרכיב (CFUs) המתאימות לזיהום DC נמוך.
4. כימות Transinfection תא T על ידי cytometry הזרימה
הערה: איור 2 מסכם את הצעד הזה.
- Transinfection תא T
- להדביק BMDCs כמו בשלב 1.3, אבל להשתמש בחיידקי GFP להביע במקרה זה.
- תאי CD4 + T הכתם (מבודדים מבלוטות לימפה בשלב 2.2) עם aminocoumarin chloromethyl גשש תא (CMAC) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס פי הפרוטוקול של היצרן.
- לשטוף את תאי CD4 + T שכותרתו פעמיים עם FBS RMPI 10% (ללא אנטיביוטיקה).
- דגירה DCs הנגוע (לאחר דגירה 1 שעות עם חיידקים) עם CD4 + כותרתתאי T למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית על 37 מעלות צלזיוס כולל את כל הבקרות והסבירו בשלב 3.1.1.
- צביעת תאי CD4 + T נגועים
- לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית DC-T, לאסוף תאים ולשטוף אותם בPBS / BSA / EDTA.
- לאחר שתי שטיפות עם PBS חיץ / BSA / EDTA, תאים מצטברים נפרדים בעדינות על ידי vortexing הצינורות.
- תקן את הדגימות ב0.2 מיליליטר / שפופרת של PBS המכיל 3% PFA במשך 15 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף אותם בPBS.
- דגירה עם נוגדן אנטי עכבר CD16 / CD32 חד שבטי (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 15 דקות על קרח כדי לחסום קולטני Fc של תאים דנדריטים.
- הוסף ארנב נגד חיידקי נוגדן (10 מיקרוגרם / מיליליטר כריכוז סופי) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח להכתים חיידקים תאיים.
- לשטוף את התאים עם PBS / BSA / EDTA ודגירה עם נוגדן נגד CD11c עכבר מצומדות עם Phycoerythrin (PE) וseנוגדן condary נגד ארנב מצומדות עם fluorochrome אחר כמו Alexa-פלואוריד 647 ב 1: 200 ב100 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח.
- לשטוף את התאים ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. אל תשכח לכלול מדגם של תאי T transinfected באמצעות חיידקים הלא ניאון שליטה שלילית וכדגימות שכותרתו עם רק אחד מכל fluorochrome השתמש בניסוי כדי לפצות את הדגימות ולהתאים את הזרימה cytometry הגדרות 25. ניתוח נציג מוצג באיור 5.
הערה: אם חיידקים אינם מבטאים GFP, להבחין תאית וחיידקים תאיים, חיידקים תאיים תווית, לתקן, וpermeabilize דגימות עם טריטון X-100 ברמה של 0.5% ב- PBS במשך 5 דקות. לאחר מכן כתם חיידקים כולל (תאית + תאי) עם fluorochrome שונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במסמך שתארנו כיצד לבצע transinfection חיידקי תא T עכברי ממח עצם נגוע נגזר DCs ואיך למדוד transinfection חיידקים באמצעות שתי גישות שונות: cytometry הזרימה וגנטמיצין הישרדות assay איור 1 מסכם את ההליך כדי לקבל את התאים.. DCs מופקים על ידי דגירה של תאי מח עצם עם GM-CSF ל9 ימים. אז, DCS הם maturated עם LPS להגדיל MHCII על קרומו כדי לטעון אותם מאוחר יותר על עם פפטיד ספציפי של OVA (OVAp). כביקורת, כמה DCs אינם עמוס OVAp. DCs שני (OVAp-הטעון ושאינם טעונים) נגועים בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים. מצד השני, תאי CD4 + T מבודדים מבלוטות הלימפה של עכברים הטרנסגניים OTII, אשר מזהים את OVAp הספציפי. איור 2 מתאר את ההליך לביצוע ולכמת transinfection תא T כולל הבקרות השליליות המתאימות. כdescriמיטה לפני, כמה DCs אינם עמוס OVAp. במקרה זה, יש אינטראקציה בין DCs ותאי T, אך לא היווצרות סינפסה חיסונית בשל העדר OVAp. שליטה נוספת כלולה, הפרדת DCs ותאי T עם מחסום transwell פוליקרבונט (עם 3 מיקרומטר של גודל נקבובית), אשר מונע מגע פיזי DC-T. DCs כלולים בתוך transwell; כתוצאה מכך הם אינם יכולים לעבור בגודל נקבובית זה. שליטה נוספת שלילית גם שולבה, זיהום תא T הישיר, על ידי דוגרים תאי T ישירות במשרד פנים של 10 חיידקים. transinfection תא T ניתן לכמת על ידי שתי גישות: cytometry זרימה או assay הישרדות גנטמיצין. כדי למדוד על ידי cytometry זרימה, DCS צריך נדבקו בעבר עם תאי חיידקים-GFP וCD4 + T להכתים עם גשש תא (תאי T-כחולים). לאחר היווצרות המצומד, צריכים להיות מוכתמים התאים עם נוגדנים נגד DCS (CD11c-PE). החיידקים תאיים גם צריכים להיות מוכתמים כדי quantify אחוז תאי CD4 + T נגועים על ידי cytometry זרימה בשלב מאוחר יותר. כדי למדוד transinfection ידי assay הישרדות גנטמיצין, תאים הודגרו עם גנטמיצין עבור שעה 1 כדי להרוג חיידקים תאיים, אז תאי T מחדש מבודדים זרע על צלחת אגר. דילולים סידוריים עשרוניים עשויים זרע 50 μl של כל דילול על צלחת אגר ולהקל על ספירת CFUs.
כפי שניתן לראות באיור 3, בידול DC יש להיבדק על ידי cytometry זרימה (איור 3 א ו3B). DCs צריך להביע CD11c וMHCII (איור 3 א) ולא Gr-1, אשר מהווה סמן של נויטרופילים. כפי שהוצג באיור 3, כמה נויטרופילים (3.27% מGr-1 +, MHC -) הוצגו בתרבות, אבל לא אמורה לשמש תרבות DCs עם יותר מ -5% מזיהום נויטרופילים. טוהר תאי CD4 + T צריך להיבדק לאחר הבידוד מlyבלוטות קמ"ש (איור 3 ג) ואחרי הפרידה מDCs conjugates היווצרות (3D איור). קח בחשבון את הניסויים עם פחות מ -2% ממזהמים לאחר היווצרות conjugates.
איור 4 מראה דוגמא של ניסוי transinfection T באמצעות סלמונלה. כפי שמודגם באיור 4 א, צלחות מחולקות בארבע מנות זרע דילולים הסידוריים בכל חלק. סלמונלה גדלו על צלחות אגר LB ויחידות מושבה יוצרים ניתן לספור. כפי שניתן לראות באיור 4 א, סלמונלה נתפסה על ידי תאי T מDCs נגוע ותהליך זה היה באופן ברור משופר עם הכרת OVAp (צלחות בצד השמאל של איור 4 א ואיור 4). עם זאת, כאשר היה מכשול פיזי המונע המגע בין תאי DCs וT, לא היה כמעט שום transinfection, כמו במקרה של עשיית T ישיר זיהום תא (צלחות בצד הימין של איור 4 א ואיור 4).
כפי שניתן לראות בתרשים 5, transinfection תא T ניתן לכמת ידי cytometry זרימה באמצעות חיידקים המבטאים GFP בהיר. יכולים להיות מובחנים תאי DCs וT על ידי גודל ומורכבות בעלילה פיזור קדימה וצד, אבל סמנים שונים יכולים לשמש כדי להבדיל אותם היטב. תאי CD4 + T תויגו עם גשש תא (CMAC) וDCs עם נוגדן נגד CD11c. חיידקים תאיים הוכתמו נוגדן ארנב נגד סלמונלה ונגד ארנב נוגדנים משני מצומדות עם אלקסה פלואוריד 647. לפיכך, אחוז תאי CD4 + T הנגועים ניתן לכמת משום שהם מתויגים עם CMAC (לא עם CD11c-PE) והביעו GFP (חיידקים-GFP), אבל הם לא היו מוכתמים בנוגדנים נגד חיידקים תאיים (אלקסה פלואוריד 647).
ntent "FO: לשמור-together.within עמודים =" 1 ">
תרשים זרימה של איור 1. דור DC ובידוד תאי CD4 + T. בצד שמאל של הדמות, התהליך להבדיל תאים דנדריטים (DCS) מתאי מח עצם הוא מפורט. לאחר לנתח עצמות ירך וtibias, תאי מח עצם מופקים מחלק הפנימי של העצמות. לאחר מכן, תאי דם אדומים (RBC) הם lysed ותאי מח עצם בתרבית עם גורם רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג שולט בקולוניה- גירוי (GM-CSF) ל9 ימים. ברגע שהם מובחנים היטב, DCS מודגרת עם lipopolysaccharide (LPS) כדי להגדיל את הקומפלקס הגדול histocompatibility השני ביטוי (MHCII). אז, DCS נטענים עם פפטיד ספציפי ovoalbumin (OVAp) ונגוע בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים. חלקם לא עמוס OVAp כביקורת. בצד ימין של הדמות, איךבודד תאי CD4 + T מעכברים מהונדסים OTII מיוצגים. בלוטות הלימפה (LNs) יוסרו וקרקע, קבלת השעיה תא בודד. לבסוף, תאי CD4 + T מבודדים על ידי סלקציה שלילית באמצעות מכונה הפרדת תא מגנטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תרשימי זרימה של הליך transinfection תא T. מאשרום (חיידקים מתוארים בירוק) וטעון DCs OVAp (תאים אדומים) מודגרת עם תאי CD4 + T (תאים כחולים) כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית. DCs הנגוע (אך לא עמוס OVAp) גם מודגרת עם תאי T, המאפשר אינטראקציה בין שני התאים אך ללא היווצרות סינפסה חיסונית. שליטה נוספת כלולה, הפרדה מסוג CD4 + אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. זרימה cytometer הניתוח של מח עצם נגזר DCs ותאי CD4 + T מבודדים. חלקות נקודת נציג נגזר DCs מח העצם נותחו על ידיcytometry זרימה. () DCs הביע MHCII וCD11c (85.8%; ברבע ימני עליון) (ב) DCs הביעו MHCII אבל לא Gr-1 (85%; ברבע ימני תחתון). עם זאת, היו 3.27% מתאים שהביעו תאי Gr-1 אך לא MHCII (רבע שמאלי עליון). תאים אלה היו נויטרופילים מזוהמים קלים. (C ו- D) היסטוגרמות המייצגות את טוהר של תאי CD4 + T המבודדים מהבלוטות לימפה (C), ולאחר היווצרות המצומד עם תאים דנדריטים (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
transinfection איור 4. T התא לכמת ידי assay הישרדות גנטמיצין. צלחות אגר LB חולקו ל -4 חלקים המתאימים לדסימהדילולים סידוריים l של תאי CD4 + T lysed. () המושבה להרכיב יחידות של enterica סלמונלה גדלו על צלחות אגר LB המתאימה לtransinfection תא T בנוכחות (+) או היעדר (-) של OVAp על פני השטח של DC הנגוע, ובתנאים שייאפשרו מגע תא DC / T (- TW) או בנוכחות של מכשול פיזי המונע קשר כזה (+ TW). צלחת ריקה המתאימה לזיהום ישיר T תא (שליטה שלילית) מוצגת גם. לא היה כמעט transinfection כאשר קשר תא DC / T עוכב (+ TW). כימות (B) של יחידות יצירת מושבה (CFUs) מכמה ניסויים שהראו השיעור של חיידקים שנתפס על ידי תאי T מDCs הנגוע. זיהום ישיר T תא, ותנאים המונעים מגע תא DC / T לייצר לא מעט רמות זיהום תא T. כאשר אנשי קשר DC / T תא הורשו, היה transinfection תא T, וזה היה מוגבר על ידי הכרת אנטיגן (+ OVAp). ברים עמודה מייצגים את הממוצע של 3 שניסויי ndependent. ברים שגיאה מצביעים SD. הבדלים משמעותיים מיוצגים על ידי ***, המקביל לp <0,0001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
transinfection תא T 5. איור לכמת ידי cytometry זרימה. עלילת נקודת נציג מראה DCs וconjugates תא T לאחר תהליך transinfection. תאי CD4 + T הם קטנים ועגול כמו קדימה והצד פיזור (FCS - SSC) מופעי dot למחוק, וכדי להיות מובחן היטב, הם היו מוכתמים בגשש תא (CMAC). DCs להביע CD11c אינו מסומן בCMAC וגדול יותר מתאי T מסוג CD4 + T עם צורה לא סדירה. תאי CD4 + T נגוע המכילים חיידקים-GFP תאיים אך שלילי לextracelחיידקי lular (6.19%) מוצגים ברבע הימני התחתון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי T או התאים T הם סוג של כדוריות דם לבנות שתפקיד מרכזי בחסינות תא בתיווך ושייך לתגובה החיסונית אדפטיבית 26. תאי T הם עקשן ללהידבק במבחנה אבל כמה דיווחים מצביעים על כך שהם יכולים להיות נגועים בvivo 14,15. הקשר האינטימי של תאי APC ו- T בסינפסה החיסונית לשמש פלטפורמות להחלפת חומר ביולוגי 13, כוללים כמה וירוסים כגון HIV 11. לאחרונה הוצגו כי בניגוד לדוגמא, תאי T, את הפרדיגמה של תאים של חסינות אדפטיבית, הם גם מסוגל ללכוד ביעילות חיידקים על ידי transinfection מDCs הנגוע 11,16. במסמך זה אנו מראים שהוא מפורט פרוטוקולים לכמת transinfection חיידקי תא T במבחנה מBMDCs הנגוע.
transinfection חיידקי תא T היה מוגבר על ידי הכרת אנטיגן 16. אנחנו הראיתי כי על ידי שימוש בתאים מסוג CD4 + T מבודדים מעכברים הטרנסגניים OTII הכרת OVAp ספציפי, BMDCs עמוס OVAp ועכברים נגועים בחיידקים שונים (כאן הנתונים מוצגים מenterica סלמונלה). תאי CD4 + מבודדים מעכברי OTII מודגרת עם DCs הנגוע למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית. הנתונים שהוצגו כאן מתאים לחיידקים שתאי T יכולים ללכוד מDCs בתקופה קצרה זו של זמן. אנו יודעים כי חשיפות ארוכות יותר של תאי T לDCs הנגוע הביאו לוכד חיידקים גדולים יותר (לא מוצג), אך כתאי T גם להשמיד את חיידקי uptaken מהר מאוד, כימות של transinfection חיידקים המתרחש במהלך מגעים זמן תא כבר DC / T הוכיח להיות קשה . assay הישרדות גנטמיצין הוא שיטה רגישה מאוד לכמת transinfection תא T כי היא מסוגלת לזהות חיידק חולני אחד 21. לאחר דגירה עם גנטמיצין שהורגים רק חיידקים תאיים, תאי T מבודדים וlysed זרע על חיידקים בינוניים אגר plאטס. הבידוד של תאי T לאחר טביעה conjugates עם DCs הוא שלב קריטי בפרוטוקול. ניסויים רק עם פחות מ -2% ממזהמים צריכים להילקח בחשבון. זיהום DC ניתן למדוד על ידי cytometry הזרימה וCFUs המתאים לזיהום DC נמוך צריכים להיות מופחת. לחלופין, טוהר תאי CD4 + T ניתן לשפר באמצעות מיון תא.
גישה נוספת לכמת transinfection תא T הוא על ידי cytometry זרימה, באמצעות GFP להביע חיידקים ותיוג החיידקים תאיים עם fluorophore תואם. מגבלה אחת של גישה זו היא שחיידקים יש להביע GFP שהוא מספיק בהיר לאיתור תאים נגועים על רקע autofluorescence. לחלופין, חיידקים יכולים להיות מוכתמים לפני הדבקת DCs עם גשש תא. גישה אחרת תהיה מכתימה את החיידקים תאיים, permeabilizing תאי T, אז תיוג כל החיידקים (תאיים + תאי)עם fluorochrome שונה.
לגבי כיוונים עתידיים של פרוטוקול זה, אנחנו מנסים להגדיר את פרוטוקול לכמת את מספר תאי T שנתפסו חיידקים לאחר אקספוזיציה ארוכה יותר לDCs הנגוע, על ידי שימוש בחיידקים מעוטרים בחלקיקים מגנטיים. תאי T לכידת חיידקים ישמרו חלקיקים המגנטיים ולכן זה צריך להיות קל לבודד אותם על ידי שימוש במגנטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
