Summary
Burada bir protokol, önceden enfekte edilmiş dendritik hücreler (DC) transinfection ile antijen sunumu sırasında ortaya çıkan, CD4 + T hücreleri tarafından bakteriyel yakalama ölçmek için sunulmuştur. Birincil hücreler, DC, DC / T hücre konjuge oluşumu enfeksiyon ve bakteri T hücre transfeksiyon ölçüm izolasyon: Biz gerekli adımları gerçekleştirmek için nasıl gösterir.
Introduction
Bir patojen konukçu bulaştığında, genellikle bakteriyel temizlenmesi için gerekli olan doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin, bir aktivasyon vardır. Doğuştan gelen bağışıklık çoğu enfeksiyonları önler ilk savunma hattıdır. Doğuştan gelen bağışıklık mikroorganizma ana gruba arasında korunan bir hassas bir şekilde elemanları (patojenle ilişkili molekül örnekleri, PAMPS) 1 ayırt. Doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları fagositler (makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler), mast hücreleri, eozinofiller, bazofiller ve doğal öldürücü hücreleri içerir, fiziksel deri gibi engelleri, kimyasal bariyerler (antimikrobiyal peptitler, lizozim) ile doğuştan gelen lökositler arasında, 2. Bu hücreler temas yoluyla veya patojenin içine çeken ve öldürme içeren fagositoz yoluyla onlara saldırarak ya tanımlamak ve patojenleri ortadan kaldırır. Bu sistem, p karşı bağışıklık belleğini kazandıran adaptif bağışıklık aksine, yaşam boyu savunma izin vermezathogens. Adaptif bağışıklık sistemi savunma İkinci satır ve tanımak ve birden mikrobik olmayan mikrobiyal maddelerin 3 spesifik antijenlere tepki yapabiliyor. Adaptif immün sisteminin ana bileşenleri B ve T hücrelerini içerir lenfositlerdir. B hücreleri, patojenler veya dışsal proteinlere karşı antikorlar salgılayan, hümoral yanıt olarak dahil edilmektedir. Bununla birlikte, T hücreleri sitokin sekresyon veya öldürme patojen ile enfekte olmuş hücrelerde 4 bağışıklık tepkisini modüle hücre aracılı bağışıklık temsil etmektedir.
Büyük histo uyumlu kompleks (MHC) 5-7 hücre yüzeyinde sunulur antijenler içine fagosite ederler patojenler ve işlem bakteriyel bileşenler tanıyabilir dendritik hücreler ya da makrofajlar, doğal bağışıklık sisteminin bir parçası, aşağıdakileri içeren Antijen sağlayan hücreler (APC 'ler). APC 'ler patojenleri fagosite sonra, bunlar genellikle T etkileşime boşaltma lenf düğümlerine göçHücreler. T lenfositleri, T hücre reseptörleri tarafından spesifik peptit-MHC kompleksleri tanıyabilir. Bağışıklık sinaps (IS) antijen sunumu 8,9 sırasında antijen yüklü APC ve lenfosit arasındaki ara yüzeyde oluşur. Bazı bakteriler fagositozu hayatta ve APC 'içinde sistematik olarak yaymak olabilir. Bu görüşe göre, enfekte ZPT bakteriyel rezervuar veya bakteriyel yayılmasını kolaylaştıran 10 "Truva atları" olarak hizmet vermektedir. APC 've BS oluşumu sırasında gerçekleşecek lenfositler arasındaki yakın temas, aynı zamanda membranların, genetik materyalin ve eksozom parçası alışverişi için bir platform olarak işlev ve T hücreleri enfekte bazı virüsler için kaçırdılar olabilir; bu işlem 11-13 transinfection olarak adlandırılır.
Bazı patojen bakterilerin (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica ve Shigella flexneri) in vivo T lenfositleri istila ve davranışlarını 14-16 değiştirmek edebiliyoruz. SahibizSon zamanlarda T lenfositleri de antijen sunumu 16 sırasında önceden enfekte dendritik hücreler (DC) dan transinfection bakterilerin yakalamak mümkün olduğunu anlattı. T hücresi doğrudan enfeksiyonlara daha (1,000-4,000x) derece daha etkili transinfection bakteri yakalama. Transinfection daha gösteren T hücreleri yakalama patojen olmayan patojen bakteriler T hücreleri tarafından tahrik edilen bir işlemdir. Çarpıcı, hücreler hızla yakalanan bakterileri öldüren ve profesyonel fagositler 16 daha çok fazla verimli yaptım T (TİT) transinfected. Immünoloji bir dogmayı kırmak Bu sonuçlar, adaptif bağışıklık hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sözde münhasır olan işlevleri yerine göstermektedir. Buna ek olarak, meme ucu hücreleri pro-enflamatuar sitokinlerin büyük miktarlarda salgılarlar ve in vivo bakteriyel enfeksiyonlara karşı koruma gösterdi.
Burada bakteriyel transinfection sürecini incelemek için kullanılan farklı protokoller sunmakFare modeli. Bu model, bakteri bulaşmış kemik ile spesifik olarak etkileşime I-Ab 17 bağlamında OVA (OVAp) peptit 323-339 için TCR spesifik taşıyan transgenik farelerin OTII, CD4 + T hücrelerinin kullanımına dayanmaktadır iliği stabil bağışıklık sinaps meydana OVAp yüklü DH'ler türetilmiş (BMDCs) 18,19.
T hücre transinfection görüntülendi ve floresan mikroskobu kullanarak izlenebilir. Buna ek olarak, akış sitometrisi, yeşil floresan proteini (GFP) 16,20 ifade bakteriler tarafından yayılan floresan yararlanarak tarafından enfekte edilen hücreleri tespit edilmesi için de kullanılabilir. Ayrıca, T hücresi transinfection daha hassas bir yaklaşım, etkinlikleri sayıda ölçümünü sağlar gentamisin sağkalım analizi ile tayin edilebilir. Gentamisin ökaryotik hücreleri içine giremeyeceği bir antibiyotiktir. Bu nedenle, bu antibiyotiği kullanarak antibiyotik ilave fr hayatta hücre içi bakteri farklılaşmasını veriyor21 öldürüldüğü om dışı olanlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Deneysel işlemler Universidad Autonoma de Madrid Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanan ve İspanyol ve Avrupa kurallarına uygun olarak Hayvan Refahı ve Sağlık Universidad Autonoma de Madrid Başkanı'nın gözetiminde yapılmıştır. Fareler spesifik patojen free (SPF) konut yetiştirilen ve onlar karbon dioksiti kullanarak eğitimli ve kalifiye personel (CO 2) inhalasyon yöntemi ile ötenazi uygulandı.
1. Fare Kemik DH'ler Farklılaşma ve Enfeksiyon İliği-türevli
Not: Şekil 1, bu ilk adımı özetlemektedir. Tüm prosedürler, sadece steril ortam, alet, pipet uçları ve kültür yemekleri kullanarak, bu noktadan kaputu yapılmalıdır.
- Fare Kemik İliği türetilmiş DH'ler Farklılaşma
- Bir C57 / BL6 fare 22'den tibia ve femur ayır ve RPMI ortamında 10 ml olan bir plastik çanak içine aktarın. Steril makas, her epifiz kesti ve karakteristik parlak kırmızı renge sahiptir kemik iliği, maruz kalmaktadır.
- Steril bir Petri steril bir şırınga kullanılarak 0.5% sığır serum albümini ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) (BSA) ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (PBS / BSA / EDTA tamponu) kemiğin içine infüze çanak.
- Soğutmalı santrifüj (4 ° C) 600 x g'de bir tüp hücre süspansiyonu ve santrifüj toplayın.
- Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) parçalama tamponu (0.15 M NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve 0.1 mM EDTA) içinde çözülmüştür, 1 ml hücrelerin tekrar ve kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir.
- Kümeleri filtreleme ile elimine edilmiştir, çünkü aynı hızda (600 xg) santrifüjlemeden önce kemik parçaları ve hücre kümeleri kaldırmak üzere bir hücre filtresinden (70 um) üzerinden,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile RPMI 1640 ortamının 10 ml ilave edilir ve filtre edin.
- Hücreleri saymak bird RPMI% 10 FBS içeren (50 uM B-merkaptoetanol, 1 mM sodyum piruvat) 5 x 10 5 hücre / ml ayarlayın ve 20 ng / ml birleşik faregiller granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (rm-GM-CSF) ekleyin nihai bir konsantrasyona kadar.
- Bir CO2 inkübatöründe steril, mikrobiyolojik kalite, 15 cm Petri için, ve kültür Bu süspansiyonu ekleyin (37 ° C,% 5 CO2).
- Her üç gün, 20 ng / ml rm-GM-CSF ihtiva eden taze ortam ile, hücre yoğunluğu 5 x 10 5 hücre / ml'de yıkanarak yapışmayan hücreler ve PBS içinde 5 mM EDTA ile müstakil hücreleri ve tekrar süspansiyon hem de aşağı doğru dönerler.
- DH'ler ve Antijen Yükleniyor Olgunlaşma
- 9. günde en, 20 ng / ml rm-GM-CSF ihtiva eden bir ortam içinde yoğunluğu 5 x 10 5 hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri. Daha sonra hücreler, yüksek MHC-II ifadesini sağlayacak ve 24 saat boyunca olmayan bir doku kültürü ile muamele edilmiş, steril 15 cm Petri için inkübe 20 ng / lipopolisakarit (LPS) ilave edin.
- Birinden sonraLPS stimülasyon günü, flow sitometri DC'ler farklılaşmayı kontrol etmek için fare CD11c, MHCII ve Gr-1 karşı antikorlar ile bazı DC hücreleri leke. DC'lerin akış sitometri analizi bir örneği Şekil 3A ve 3B'de gösterilmiştir.
- Örnek başına 50 ul PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde nihai konsantrasyon 2.5 mg / ml'de bir anti-fare-CD16 / CD32 monoklonal antikor ile DC'ler (5 x 10 5 hücre / numune) inkübe edin. Daha sonra, MHC II (IA / IE) karşı antikorların 50 ul, CD11c ve 1 farklı florokromlar ile konjuge Gr-1: 100, 1: 200 ve 1: sırası ile, PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde 500.
- Son olarak, PBS / BSA / EDTA tamponu ile yıkayın ve DC'ler üreticinin protokolüne göre, akış sitometrisi ile analiz edin.
Not: Hücreler iyi diferansiye ise, hücreler antijen yükleme için hazırız.
- Yıkama RPMI DH'ler,% 10 (antibiyotiksiz), FBS ve 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339 ile inkübe; ISQA37 ° C'de en az 1 saat boyunca 5 x 10 6 DH'ler her RMPI% 10 FBS ortamı, 1 ml bir plastik boru üzerine VHAAHAEINEAGR). Bir negatif kontrol olarak, OVAp ile inkübe olmayan DH'ler bırakın.
- DH'lerinin Enfeksiyon
- Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 1 saat boyunca 10 bakteri (DC başına 10 bakteriler) enfeksiyon çeşitliliğinde (MOI) enfekte DC'ler (37 ° C,% 5 CO2).
- Yıkama DC hücreleri hücre-dışı bakteriler en yıkamak için RMPI% 10 FBS ve 450 x g'de santrifüje PBS ve 1x 3x. Son olarak, 20 x 10 6 hücre / ml'de (antibiyotiksiz) RMPI% 10 FBS ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
OTII Transgenik fareler ile CD4 + T lenfositlerinin izolasyonu 2.
Not: Şekil 1, bu ikinci adımı özetler. Lenf düğümleri, yerine CD4 + T hücreleri izole etmek için dalak kullanılması gereken lenf nodu CD4 + lenfositlerin oranı nedeniyles (~% 50) dalak (~% 25) ve bu nedenle, saflaştırma daha etkili olacağını daha büyüktür.
- Lenf nodu Tek hücreli Süspansiyon yapın
- OTII transgenik farelerin 23 düğümleri inguinal, aksiller, brakial, servikal ve mezenterik lenf çıkarın ve RPMI% 10 FBS ortamı 10 ml ile plastik kabına aktarın.
- İki buzlu mikroskop slaytlar kullanılarak steril kaputun altında eziyet lenf nodları. Tek mikroskop lamı buzlu tarafındaki lenf düğümleri yerleştirin ve organlar toprak olmuştur kadar ikinci sürgünün buzlu tarafı ile ovalayın.
- PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde tek bir hücre süspansiyonu yıkayın.
- Bir hücre süzgecinden (70 mikron) bağ dokusu kaldırmak ve PBS / BSA / EDTA tamponu ile yıkamak için olsa hücreleri Filtre.
- ACK lisiz tamponu 1 ml hücrelerin tekrar ve kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin.
- CD4 + T hücreleri izole edilmesi
- Adım 2.1.3 ve sayısında tekrar yıkayınHücreler, PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde 100 x 10 6 hücre / ml'de tekrar süspansiyon onları. 1 de CD8, IgM, B220, CD19, MHC sınıf II (I-Ab), CD11b, CD11c ve DX5 karşı biyotinile antikor ekleyin: 250 30 dakika boyunca buz üzerinde, CD4 + T hücreleri daha sonra negatif seçim için.
- PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde hücrelerin yıkayın ve buz üzerinde 15 dakika süre ile, üreticinin protokolünde tavsiye edilen konsantrasyon streptavidin mikro-hücreleri ile (100 x 10 6 hücre / ml) inkübe edilir.
- PBS / BSA / EDTA tampon hücreleri yıkayın ve CD4 + T hücre izolasyonu önce bir hücre süzgeç (30 mikron) olsa bunları filtre.
- Üreticinin protokolüne uygun olarak, bir manyetik hücre ayrıştırma makinesi kullanılarak negatif seçim yoluyla CD4 + T hücreleri izole edin.
- Hücre sayımı ve (antibiyotiksiz) RPMI% 10 FBS ortamı ile 4 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlanır.
- Fix ve akış ile saflık kontrol etmek için buz izole CD4 + T hücrelerinin (3 x 10 5 hücre) devamolarak sitometresi 24 nitelendirdi. CD4 + T hücreleri arıtılmadan bir örneği, Şekil 3C'de gösterilmiştir.
3. T Hücre Transinfection ölçüm Gentamisin Koruma Tahlili ile
Not: Şekil 2 protokolün bu üçüncü adımı özetler.
- T hücresi Transinfection
- Enfekte DC hücreleri (1: 1) ile izole edilmiş CD4 + T hücrelerini inkübe bir CO2 inkübatör (37 ° C immün sinaps oluşumuna imkan vermek üzere, 30 dakika boyunca (DC'ler 1 saat enfekte edilmiş ve yok etmek için yıkanmıştır bakterisiz),% 5 CO2).
- Ekle izole CD4 + T hücreleri (2 x 10 6 hücre) ve 24-çukurlu bir kültür plakasında enfekte DCler (2 x 10 6 hücre) 0.1 ml 0.5 ml. Negatif bir kontrol olarak, 30 dakika boyunca 10 bakteri MOI doğrudan 0,5 mi, CD4 + T hücreleri enfekte etmektedir.
- Kullanarak T hücrelerinden enfekte DH'leri ayıran ek kontroller şunlardırDC-T fiziksel temas engelleyen (gözenek büyüklüğü 3 um) ile bir polikarbonat transwell bariyer. Oyuk (24 çukurlu plaka) alt bölmeye 0,1 transwell içindeki DH'lerin ml ve CD4 + T hücrelerinin 0,5 ml ilave edilir.
- Son olarak, RMPI orta ile tam tüm örneklerde eşit hacimlerde yapmak için her kuyuda 0.6 ml kalmayıncaya kadar.
- Bağışıklık sinaps oluşumu 30 dakika sonra, gentamisin 100 ug / ml ekleyin ve CO2 inkübatöründe hücreleri toplama önce 1 saat boyunca inkübe (37 ° C,% 5 CO2).
- Yeniden izolasyon CD4 + T hücrelerinin
- Yapışmayan hücreleri toplayın ve PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon bunları. DH'lere çoğu plastik kültür plakasına bağlı kalır. Vortex tüpler yavaşça hücre ayrıştırılmasına yönelik çabalara sağlamak. Gentamisin iyi çalışmış olduğunu göstermek için kontrol olarak hücre yüzer 500 ul tutun.
- Adım 2.2 gibi birlikte DH'ler ve T hücrelerini ihtiva örneklerinden CD4 + T hücrelerinin yeniden izole, DH'lerin rağmen çoğu plaka üzerinde takılı olmalıdır. Buz üzerinde kontrol örnekleri tutun. Dikkate% 2'den az kirlenme sadece deneyler alın. Transinfection sonra CD4 + T hücreleri arıtılmadan bir örneği, Şekil 3D'de gösterilmektedir.
- Lyse T Hücreleri ve Bakteriler Orta agar Tabaklar üzerinde onları Tohum.
- PBS ile iki kez, CD4 + T hücreleri yıkanır.
- Hücre sayımı ve PBS içinde 2 x 10 6 hücre / ml'de tekrar süspansiyon onları.
- T hücrelerinin, hücre içi bakteri üzerinden serbest, 1 x 10 6 hücre / ml'de onları parçalamak için T hücrelerinin 500 ul% 0.1 Triton X-100 500 ul ekle.
- Tabii tutulan parçalanmış hücrelerin 3 seri ondalık dilüsyonları yapılır ve bakterilerin orta agar plakaları üzerinde her seyreltme 50 ul tohum. 4 kısma plakaları bölün ve her bölüm içinde lize hücrelerin farklı sulandırmalar tohum. Örnek sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir.
- Bir kontrol olarak, aynı zamanda plakaBu gentamisin sağlamak için agarda konjügatlann saklanan hücre süpernatanı, iyi çalıştı. Ayrıca ek bir kontrol olarak enfekte DC'ler plaka. Durumda, düşük kirlenme DCler (<% 2), düşük DC kirlenme karşılık gelen koloni oluşturan birim (CFU) çıkarma oluşur.
4. sayısallaştırılması Akım Sitometrisi T hücre Transinfection arasında
Not: Şekil 2 bu adımı özetler.
- T hücre Transinfection
- Aşama 1.3 olarak BMDCs Infect, ancak bu durumda GFP ifade eden bakteriler kullanılır.
- Üreticinin protokolüne uygun olarak 37 ° C'de, 30 dakika için bir hücre izleyici klorometil aminokumarin (CMAC) ile (adım 2.2 lenf düğümleri izole edilmiş) Leke CD4 + T hücreleri ° C.
- Iki kez (antibiyotiksiz) RMPI,% 10 FBS ile etiketlenmiş CD4 + T hücreleri yıkanır.
- Enfekte DC'ler inkübe etiketli CD4 + ile (bakteriler ile 1 saat inkübe edildikten sonra)30 dakika boyunca T hücreleri adım 3.1.1 açıklayan tüm kontrolleri de dahil olmak üzere 37 ºC'de bağışıklık sinaps oluşumunu sağlamak için.
- Enfekte CD4 + T hücrelerinin boyanması
- DC-T bağışıklık sinaps oluşumu 30 dakika sonra, hücrelerin toplanması ve PBS / BSA / EDTA içinde yıkayın.
- PBS / BSA / EDTA tampon hafifçe tüpler vorteks ayrı birleştirilmiş hücrelerin iki kez yıkamadan sonra.
- 0,2 ml / PBS oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3 PFA ihtiva eden bir tüp içinde örnekleri saptamak. Daha sonra PBS ile yıkayın.
- Dendritik hücrelerin Fc reseptörleri bloke etmek için, buz üzerinde 15 dakika boyunca PBS / BSA / EDTA 50 ul / numune içinde anti-fare-CD16 / CD32 monoklonal antikoru (2,5 ng / ml) ile inkübe edin.
- Hücre dışı bakteriler leke buz üzerinde 30 dakika boyunca 50 ul / PBS / BSA / EDTA Örnek içinde anti-bakteriyel antikoru (nihai konsantrasyon olarak 10 ug / ml) bir tavşan ekleyin.
- PBS / BSA / EDTA ile hücrelerin yıkayıp fikoeritrin (PE) ile konjuge fare CD11c karşı antikor ve bir se inkübetavşan karşı condary antikor 1 Alexa Fluor 647-gibi diğer florokrom ile birleşmiş: buz üzerinde 30 dakika boyunca PBS / BSA / EDTA 200 ul 100 / örnek.
- Hücreleri yıkayın ve flow sitometri örnekleri analiz. Floresan olmayan bakterilere örnekleri telafi ve ayarları 25 sitometri akışını ayarlamak için deneyde kullanılan her florokrom sadece biri ile etiketlenmiş olarak negatif kontrol ve numuneleri kullanılarak transinfected T hücrelerinin bir örnek eklemeyi unutmayın. Örnek analizi, Şekil 5 'de gösterilmiştir.
Not: Bakteri GFP ifade yoksa, 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile numune, hücre içi ve hücre dışı bakteriler, etiket hücre dışı bakteriler ayırt düzeltme ve nüfuz edilebilir kılınması için. Daha sonra farklı bir florokromla toplam bakteri (hücre içi + dışı) leke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akış sitometri ve gentamisin yaşam tahlil Şekil 1 hücreleri elde etmek prosedürü özetler:. Bu yazıda enfekte kemik iliği kaynaklı-DH'ler ve nasıl iki farklı yaklaşım yoluyla bakteri transinfection ölçmek için fare T hücre bakteriyel transinfection nasıl gerçekleştirileceği açıklanan. DCler, 9 gün boyunca GM-CSF ile kemik iliği hücrelerinin inkübe etmek suretiyle oluşturulur. Daha sonra DCler, OVA (OVAp) belirli bir peptid ile daha sonra bunları yüklemek için kendi zar üzerinde MHCII geliştirmek için LPS ile olgunlaştırılır. Bir kontrol olarak, bazı DCler OVAp yüklü değildir. (OVAp-yüklü ve yüksüz) Her iki DCler enfeksiyon çokluğu 10 bakteri (MOI) enfekte edilmiştir. Öte yandan, CD4 + T hücrelerinin spesifik OVAp tanıyan OTII transgenik farelerin, lenf düğümleri izole edilir. 2 gerçekleştirmek ve uygun negatif kontroller de dahil olmak üzere, T hücresi transinfection ölçmek için prosedürü gösterir Şekil. DESCRI gibiYatakta daha önce bazı DC'ler OVAp yüklü değildir. Bu durumda, bağlı OVAp yokluğu DH'ler ve T hücreleri, ancak bağışıklık sinaps oluşumu arasında bir etkileşim yoktur. Ek bir DC akım-T fiziksel temas engellemektedir (gözenek büyüklüğü 3 um) ile bir polikarbonat transwell bariyer ile DClerin ve T-hücreleri ayıran dahildir. DC'ler transwell içinde bulunan; Bir sonuç olarak, bu gözenek boyutuna geçmesi mümkün değildir. Başka bir negatif kontrol de 10 bakteri MOI doğrudan T hücrelerini inkübe edilerek, doğrudan T hücresi enfeksiyonu dahil edilmiştir. T hücresi transinfection iki yaklaşım tarafından belirlenebilir: akış sitometrisi veya gentamisin-Canlılık deneyi. Akış sitometrisi ile ölçmek için DH'ler bakteri-GFP ve CD4 + T hücreleri ile önceden enfekte olmuş olması gereken bir hücre izci ile leke (T-hücreleri-mavi). Konjuge oluştuktan sonra, hücreler DC'ler (CD11c-PE) karşı antikorlar ile boyanmış olmalıdır. Hücre dışı bakteriler de quantif için boyanmış olmalıdıry sitometrisi sonra akış ile enfekte CD4 + T hücrelerinin yüzdesi. Gentamisin sağkalım analizi ile transinfection ölçmek için, hücreler, hücre dışı bakterileri öldürmek için 1 saat boyunca gentamisin ile inkübe edilir, daha sonra, T hücreleri, agar plaka üzerine tohum tekrar izole edilir. Ondalık seri seyreltmeleri agar plaka üzerindeki her bir seyreltme 50 ul tohum ve CFU sayma kolaylaştırmak için yapılmaktadır.
Şekil 3'te gösterildiği gibi, DC farklılaşma akış sitometrisi (Şekil 3A ve 3B) ile kontrol edilmesi gerekir. DC'ler CD11c ve MHCII (Şekil 3A) ve Gr-1, nötrofil bir belirtecidir ifade etmelidir. Şekil 3B'de görüldüğü gibi, bazı nötrofil (Gr-1 +, MHC 3,27 -%), kültürden sunulmuştur, ancak nötrofiller kirlenme% 5'ten fazla olan DH'ler kültürü kullanılmamalıdır. CD4 + T hücreleri, saflık ly izolasyon sonra kontrol edilmelidirmph düğümleri (Şekil 3C) ve DCler ayrılma sonrasında formasyonu (Şekil 3B) konjugatlar. Konjügatlar oluşumundan sonra kirleticilerin% 2'den az olan hesaba deneyler alın.
Şekil 4, Salmonella kullanılarak T transinfection deneyin bir örneği göstermektedir. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, plakalar sayabiliriz LB agar plakaları ve koloni oluşturan birimler üzerinde büyüdüğü her bir bölümü. Salmonella seri seyreltmeleri tohum dört kısım halinde ayrılır. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, Salmonella ile enfekte DCler T hücreleri tarafından yakalanır ve bu işlem, açıkça OVAp tanıma (Şekil 4A ve Şekil 4B'de solunda plakaları) ile geliştirilmiştir. DH'ler ve T hücreleri arasındaki teması engelleyen bir fiziksel engel olduğu, ancak, hemen hemen hiç transinfection doğrudan T yapmanın durumunda olduğu gibi, orada Hücre enfeksiyonu (Şekil 4A ve 4B Şekil sağında plakalar).
Şekil 5 de gösterildiği gibi, T hücresi transinfection parlak GFP ifade bakterileri kullanılarak akış sitometrisi tayin edilebilir. DH'ler ve T hücrelerinin bir ön ve yan saçılma arsa boyutuna ve karmaşıklığına göre ayırt edilebilir, ancak farklı belirteçler de ayırt etmek için kullanılabilir. CD4 + T hücreleri, CD11c karşı bir antikor ile, bir hücre, izleyicinin (CMAC) ve DCler ile etiketlenmiştir. Bunlar cmac ile etiketlenmiş (değil CD11c-PE) ile ifade edilmiştir, çünkü hücre dışı bakteriler sayılabilir olabilir Bu nedenle, Alexa Fluor 647, enfekte CD4 + T hücrelerinin yüzdesi ile konjuge Salmonella ve ikincil antikor anti-tavşan karşı tavşan antikoru ile boyandı GFP (bakteri-GFP), ancak hücre dışı bakteriler (Alexa Fluor 647) karşı antikor ile boyandı değildi.
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
DC üretimi ve CD4 + T hücreleri izole Şekil 1. Akış şeması. Şeklin sol tarafında, işlem, kemik iliği hücrelerinden dendritik hücreler (DC'ler) ayırt etmek için detaylı olarak anlatılmıştır. Uyluk ve kaval kemiklerinden diseksiyon sonra, kemik iliği hücreleri kemik iç tarafından çıkarılır. Daha sonra, kırmızı kan hücrelerinin (RBC) lize edilir ve kemik iliği hücreleri 9 gün süreyle yeniden birleştirici sıçangil granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenmiştir. Bunlar iyi farklılaşmış sonra DH'ler Majör Histokompatibilite Kompleksi II (MHC II) ifade geliştirmek için lipopolisakarit (LPS) ile inkübe edilir. Daha sonra DCler, belirli bir ovoalbumin peptid (OVAp) ile yüklenir ve bir enfeksiyon çokluğu 10 bakteri ile (MOI) enfekte edilmiştir. Bazıları, bir kontrol olarak OVAp yüklü değildir. Şeklin sağ tarafında, nasılOTII transgenik fareler temsil edilir CD4 + T hücreleri izole eder. Lenf düğümleri (LN) tek bir hücre süspansiyonu elde etmek, çıkarıldı ve öğütülür. Son olarak, CD4 + T hücreleri manyetik hücre ayırma makinesi kullanılarak negatif seleksiyon tarafından izole edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2, T hücresi transinfection prosedürünün akış şeması. (Bakteri yeşil tasvir edilmiştir) ve OVAp yüklü-DCler (kırmızı hücreler) Enfekte bağışıklık sinaps oluşumuna imkan vermek üzere, CD4 + T hücreleri (mavi hücre) ile inkübe edilir. Enfekte DCler (ancak OVAp ile yüklenmemiş), aynı zamanda, her iki hücre arasındaki etkileşimi fakat bağışıklık sinaps oluşumu izin verdiği T hücreleri ile inkübe edilir. İlave bir kontrol CD4 + ayırma dahildir Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ve izole CD4 + T-hücreleri-DCler kemik iliğinden elde edilen analiz sitometresi Şekil 3. Akış. Analiz kemik iliği kaynaklı-DC'lerin Örnek nokta diyagramlarıakım sitometri. (; Sağ üst kadranda% 85.8) (B) DH'leri MHCII değil Gr-1 (; sağ alt kadranda% 85) ifade (A) DH'leri MHCII ve CD11c dile getirdi. Bununla birlikte, Gr-1 değil, MHC II hücreleri (üst sol kadran) ifade eden hücrelerin bir% 3.27 oldu. Bu hücreler hafif kontamine nötrofiller idi. (C ve D) lenf düğümleri (C) izole CD4 + T hücrelerinin saflığını temsil Histogramları ve dendritik hücreler (D) ile eşlenik oluşumundan sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Gentamisin sağkalım analizi ile nicelleştirilmiştir Şekil 4. T hücresi transinfection. LB agar kaplarının üzerine Decima'ya karşılık gelen 4 parçaya bölündülize CD4 + T hücrelerinin l seri seyreltileri. (-) (A) The Salmonella enterica birimleri varlığında (+) ya da yokluğunda T hücresi transinfection tekabül eden LB agar plakaları üzerinde büyüyen oluşturan enfekte DC yüzeyi üzerinde OVAp, ve (DC / T hücresi temas sağlayan koşullarda - TW) ya da temas (+ TW) engelleyen fiziksel bir engel varlığında gerçekleştirilir. Doğrudan T hücre enfeksiyonu (negatif kontrol) tekabül eden boş bir levha da gösterilmiştir. DC / T hücre iletişim (+ TW) engellemiştir edildi neredeyse hiçbir transinfection yoktu. Enfekte DCler T hücreleri tarafından yakalanan bakteriyel oranını gösteren çeşitli deneylerden koloni oluşturan birim (CFU) (B) miktarının belirlenmesi. Doğrudan T hücresi enfeksiyonu, ve DC / T hücre temasını engelleyen koşullar T hücre enfeksiyonu için hiç seviyelere çok az üretirler. DC / T hücre kontakları izin verildi, orada T hücre transinfection oldu ve antijen tanıma (+ OVAp) tarafından geliştirilmiştir. Sütun çubukları 3 i ortalamasını temsil etmektedirndependent deneyler. Hata çubukları, SD göstermektedir. Önemli farklılıklar p <0.0001 karşılık gelen *** tarafından temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. T hücre transinfection flow sitometri ile ölçülmüştür. Temsili nokta arsa transinfection sürecinden sonra DC'ler ve T hücre konjugatlar gösteren. CD4 + T hücreleri, küçük ve yuvarlak olarak öne ve yan dağılım vardır (FCS - SSC) dot blot gösterileri ve iyi farklılaşmış olması için, bir hücre izci (CMAC) ile boyandı. CD11c eksprese DCler cmac ile etiketlenmiş ve düzensiz şekle sahip T CD4 + T hücrelerinde daha büyük olan değildir. Ekstrasellüler için hücre içi bakteri-GFP ama negatif içeren Enfekte CD4 + T hücreleriSağ alt kadranda gösterilmiştir lular bakteriler (6.19%). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T hücreleri veya T lenfositleri adaptif bağışıklık yanıtı 26 hücre-aracılı bağışıklığın bir rol oynayabilir ve ait lökosit türüdür. T hücreleri in vitro enfekte olma dirençli ama bazı raporlar, in vivo 14,15 enfekte olabilir göstermektedir. Bağışıklık sinaps sırasında APC ve T hücrelerinin samimi kişiler HIV gibi bazı virüsler 11 de dahil olmak üzere biyolojik madde 13, alışverişi için platformlar olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda dogma, T hücrelerinin bu aksine gösterilmiştir, adaptif bağışıklık hücrelerinin paradigma, aynı zamanda etkin bir şekilde bulaşmış DC'lerden 11,16 dan transinfection bakterilerin yakalamak mümkün. Bu yazıda o enfekte BMDCs gelen in vitro T hücre bakteriyel transinfection ölçmek için protokoller detaylı gösteriyor.
T hücre bakteriyel transinfection antijen tanıma 16 tarafından geliştirilmiştir. Biz, CD4 + T hücreleri kullanılarak izole gösterdiBelirli bir OVAp tanıyan OTII transgenik fareler, BMDCs OVAp (burada veriler Salmonella enterica gelen sunulmuştur), farklı bakteri ile enfekte edilmiş fareler ile yüklendi. OTII farelerden izole CD4 + T hücre bağışıklık sinaps oluşumuna imkan vermek üzere, 30 dakika boyunca enfekte DCler ile inkübe edilir. Burada sunulan veriler T hücreleri zaman bu kısa sürede DC'lerden yakalayabilir bakterilerin karşılık gelmektedir. Bu enfekte DC'ler T hücrelerinin daha uzun maruz kalma daha büyük bir bakteriyel yakalar (gösterilmemiştir) ile sonuçlanmıştır biliyoruz ancak T hücreleri aynı zamanda çok hızlı bir şekilde Alınan bakterileri yok gibi, daha uzun DC / T hücresi süresi temas sırasında meydana gelen bakteriyel transinfection ölçülmesi zor olduğu kanıtlanmıştır . Gentamisin yaşam deneyi o tek bulaştırmaktan bakteriyi 21 tespit edebiliyor, çünkü T hücre transinfection ölçmek için çok hassas bir yöntemdir. Gentamisin ile inkübasyondan sonra T hücreleri izole edilir ve bakteriler orta ağar pl tohum parçalanmış, sadece hücre dışı bakterileri öldürmek olduğunuates. DC'lerle konjugatları oluşturan sonra T hücrelerinin izolasyonu protokolü kapsamında önemli bir adımdır. Kirleticilerin% 2'den az olan sadece deneyler dikkate alınmalıdır. DC kirlenme akış sitometrisi ve düşük DC kirlenme tekabül CFU çıkarılmalıdır ile ölçülebilir. Seçenek olarak ise, CD4 + T hücreleri, hücre tasnif saflık kullanılarak geliştirilebilir.
Diğer bir yaklaşım, T hücresi transinfection GFP bakteri ifade ile uyumlu bir florofor ile hücre dışı bakteriler etiketleme kullanılarak akış sitometrisi tarafından tayin edilmesi. Bu yaklaşımın bir sınırlama bakteri otofloresan arka plana karşı enfekte hücreleri tespit etmek için yeterince parlak olan bir GFP ifade etmek zorunda olmasıdır. Alternatif olarak, bakteri hücre izci ile DH'leri enfekte önce lekeli olabilir. Başka bir yaklaşım, hücre dışı bakteriler boyanmış T hücrelerini geçirgenleştiren, sonra tüm bakteriler (hücre içi + dışı) etiketleme olurduFarklı bir florokrom.
Bu protokolün geleceğe ilişkin, manyetik parçacıkları ile süslenmiş bakterileri kullanarak, enfekte DH'lere uzun maruz sonra bakterileri ele T hücrelerinin sayısını ölçmek için bir protokol kurmak için çalışıyoruz. Bakterileri yakalayan T hücreleri manyetik parçacıkların tutacak ve bu nedenle mıknatıslar kullanarak bunları izole etmek kolay olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
