Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Published: January 13, 2016 doi: 10.3791/52976
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2, 1
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

Summary

هنا يرد بروتوكول لقياس التقاط البكتيريا عن طريق خلايا CD4 + T التي تحدث أثناء تقديم المستضد عبر transinfection من الخلايا الجذعية المصابة مسبقا (DC). وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الضرورية: عزل الخلايا الأولية، وإصابة DC، DC / T تشكيل المترافقة الخلية، وقياس البكتيرية ترنسفكأيشن الخلايا التائية.

Introduction

عندما يصيب الممرض مضيفه، عادة ما يكون هناك تفعيل الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، اللازمة لإزالة البكتيريا. المناعة الفطرية هي خط الدفاع الأول الذي يمنع معظم الالتهابات. المناعة الفطرية تميز في العناصر المحددة الطريقة التي يتم الحفاظ عليها في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة (أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، PAMPS) 1. آليات المناعة الفطرية وتشمل الحواجز المادية مثل الجلد، والحواجز المواد الكيميائية (الببتيدات المضادة للميكروبات، الليزوزيم) والكريات البيض الفطرية، والتي تشمل البالعات (الضامة، العدلات، والخلايا الجذعية)، الخلايا البدينة، الحمضات، الخلايا القاعدية، والخلايا القاتلة الطبيعية 2. هذه الخلايا تحديد وإزالة مسببات الأمراض، إما عن طريق مهاجمتهم من خلال الاتصال أو عن طريق البلعمة، والذي يتضمن العوامل المسببة للأمراض التي تجتاح والقتل. هذا النظام لا يسمح دفاع مدى الحياة، على النقيض من الحصانة على التكيف، والتي تمنح الذاكرة المناعية ضد صathogens. الجهاز المناعي التكيفي هو خط الدفاع الثاني وغير قادرين على التعرف والرد على مستضدات معينة من الجراثيم المتعددة والمواد غير الميكروبية 3. المكونات الرئيسية للجهاز المناعي التكيفي هي الخلايا الليمفاوية، والتي تشمل خلايا B و T. وتشارك خلايا B في الاستجابة الخلطية، إفراز أجسام مضادة ضد مسببات الأمراض أو البروتينات الخارجية. ومع ذلك، وخلايا T تمثل مناعة خلوية، تحوير الاستجابة المناعية مع إفراز السيتوكينات او قتل الخلايا المصابة الممرض 4.

مستضد الخلايا تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) بما في ذلك الخلايا الجذعية أو الضامة، مكونات نظام المناعة الفطري، يمكن التعرف على مسببات الأمراض يبلعم ومكونات عملية البكتيرية إلى المستضدات، والتي يتم تقديمها في سطح الخلية التي كتبها مجمع على التوافق النسيجي الكبرى (MHC) 5-7. بعد ناقلات الجنود المدرعة وphagocytized مسببات الأمراض، وعادة ما تهاجر إلى الغدد الليمفاوية تجفيف، حيث تتفاعل مع Tالخلايا. يمكن أن الخلايا الليمفاوية T تعترف مجمعات محددة الببتيد MHC بواسطة مستقبلات الخلايا T بهم. المشبك المناعي (IS) يحدث في واجهة بين APC-تحميل مستضد والخلايا اللمفاوية خلال تقديم المستضد 8،9. يمكن لبعض البكتيريا البقاء على قيد الحياة البلعمة وتنشر بشكل منتظم داخل ناقلات الجنود المدرعة. في هذا الرأي، ناقلات الجنود المدرعة المصابة بمثابة خزانات البكتيرية أو "أحصنة طروادة" التي تسهل انتشار بكتيريا 10. في اتصال حميم بين ناقلات الجنود المدرعة والخلايا الليمفاوية التي تحدث أثناء تشكيل هي وظيفة أيضا كمنصة لتبادل جزء من الأغشية، والمادة الوراثية وexosomes ويمكن خطف لبعض الفيروسات لتصيب خلايا T؛ وهذا ما يسمى عملية transinfection 11-13.

بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض (الليستريا المستوحدة، السالمونيلا الملهبة والشيجلا الفلكسنرية) قادرة على غزو الخلايا اللمفية تي في الجسم الحي وتعديل سلوكهم 14-16. لديناوصف مؤخرا أن الخلايا اللمفية تي هي أيضا قادرة على التقاط البكتيريا عن طريق transinfection من الخلايا الجذعية المصابة سابقا (DCS) أثناء تقديم المستضد 16. T خلية التقاط البكتيريا عن طريق transinfection جدا أكثر فعالية (1،000-4،000x) من العدوى المباشرة. T القبض على خلايا البكتيريا الممرضة وغير الممرض تشير من transinfection هو عملية يقودها خلايا T. لافت للنظر، transinfected T (تيط) خلايا قتل البكتيريا بسرعة القبض وفعلت ذلك أكثر كفاءة من البالعات المهنية 16. هذه النتائج، التي كسر عقيدة علم المناعة، وتبين أن خلايا المناعة التكيفية يمكن أن تؤدي المهام التي كانت حصرية من المفترض أن الحصانة الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أن الخلايا تيط تفرز كميات كبيرة من السيتوكينات الموالية للالتهابات وتحمي من العدوى البكتيرية في الجسم الحي.

هنا نقدم البروتوكولات المختلفة المستخدمة لدراسة عملية transinfection البكتيرية فينموذج الفأر. ويستند هذا النموذج على استخدام خلايا CD4 + T من الفئران المعدلة وراثيا OTII والتي تحمل محددة TCR لالببتيد 323-339 من OVA (OVAp) في سياق I-أب 17 التي تتفاعل بشكل خاص مع العظام بكتيريا المصابة كوسا- البلدان النامية المشتقة (BMDCs) 18،19 محملة OVAp، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعي مستقرة.

T خلية transinfection يمكن تصور وتتبع باستخدام المجهر مضان. بالإضافة إلى ذلك، التدفق الخلوي يمكن استخدامها للكشف عن الخلايا المصابة من خلال الاستفادة من مضان المنبعثة من البكتيريا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 16،20. وعلاوة على ذلك، T خلية transinfection يمكن قياس باتباع نهج أكثر حساسية، وفحص بقاء الجنتاميسين التي تسمح بقياس عدد كبير من الأحداث. جنتاميسين مضاد حيوي لا يمكن اختراق الخلايا حقيقية النواة. ولذلك، باستخدام هذه المضادات الحيوية يسمح التفريق بين البكتيريا داخل الخلايا التي نجت إضافة الاب المضادات الحيويةتلك الخلية أوم الذين قتلوا 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية قبل لجنة أخلاقيات البحوث في جامعة مدريد المستقلة وأجرى تحت إشراف جامعة مدريد المستقلة رئيس العام لرعاية صحة الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية الإسبانية والأوروبية. كانت ولدت الفئران في معين الممرض الحر (SPF) الإسكان، حيث الموت الرحيم كانت من قبل أفراد مدربين ومؤهلين باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2) طريقة الاستنشاق.

1. ماوس نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية التمايز والعدوى

ملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الأولى. ينبغي تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء محرك السيارة من هذه النقطة، وذلك باستخدام وسائل الاعلام فقط العقيمة، والصكوك، نصائح ماصة والأطباق الثقافة.

  1. الماوس نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية التمايز
    1. تشريح tibias وعظام الفخذ من واحد C57 / BL6 الماوس 22 ونقل في طبق من البلاستيك مع 10 مل من RPMI المتوسطة. قطع كل من الكردوس، مع مقص العقيمة وفضح نخاع العظام، والتي لديها سمات مشرق اللون الأحمر.
    2. يبث في داخل العظم مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 5 ملي ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (PBS عازلة / BSA / EDTA) باستخدام محقنة معقمة على بتري معقمة طبق.
    3. جمع تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 600 x ج في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية).
    4. Resuspend الخلايا في 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر العازلة (0.15 M NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3 و 0.1 ملي EDTA) واحتضان لمدة 30 ثانية في RT من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.
    5. إضافة 10 مل من RPMI 1640 متوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وتصفية من خلال مصفاة الخلية (70 ميكرون) لإزالة شظايا العظام وكتل الخلايا قبل الطرد المركزي في نفس السرعة (600 x ج) لأنه تم القضاء على كتل من قبل التصفية.
    6. عد الخلايا لد التكيف مع 5 × 10 5 خلية / مل مع RPMI 10٪ FBS (التي تحتوي على 50 ميكرومتر B-المركابتويثانول، 1 ملي البيروفات الصوديوم) وإضافة 20 نانوغرام / مل المؤتلف الفئران colony- عامل تحفيز-محببة بلعم (RM-GM-CSF) كما تركيز النهائي.
    7. هذا إضافة إلى تعليق العقيمة، والجودة الميكروبيولوجية، 15 سم طبق بتري، والثقافة في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
    8. كل ثلاثة أيام، وتدور أسفل كل من الخلايا غير ملتصقة وخلايا منفصلة مع 5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل من كثافة الخلايا، مع المتوسطة الطازجة تحتوي على 20 نانوغرام / مل RM-GM-CSF.
  2. نضوج البلدان النامية ومستضد تحميل
    1. في يوم 9، resuspend الخلايا في 5 × 10 5 خلية / مل من الكثافة في المتوسط ​​تحتوي على 20 نانوغرام / مل RM-GM-CSF. ثم إضافة 20 نانوغرام / مل من lipopolysaccharide في (LPS) للسماح عالية التعبير MHC-II على الخلايا واحتضان في غير الأنسجة المعالجة ثقافة عقيمة طبق بيتري 15 سم لمدة 24 ساعة.
    2. بعد واحديوم LPS التحفيز، وصمة عار بعض الخلايا DC مع الأجسام المضادة ضد CD11c والماوس، MHCII وGR-1 للتحقق البلدان النامية التمايز التدفق الخلوي. ويرد مثال على تحليل التدفق الخلوي من البلدان النامية في الشكل 3A و 3B.
      1. احتضان البلدان النامية (5 × 5 10 خلايا / عينة) مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للفأر CD16 / CD32 على 2.5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي في 50 ميكرولتر PBS / BSA / EDTA العازلة لكل عينة. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة ضد MHCII (IA / IE)، CD11c وو GR-1 مترافق مع fluorochromes مختلفة في 1: 100، 1: 200 و 1: 500 في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA على التوالي.
      2. وأخيرا، وغسل البلدان النامية مع برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA وتحليل التدفق الخلوي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
        ملاحظة: إذا كانت الخلايا المتمايزة جيدا، وخلايا جاهزة للمستضد التحميل.
    3. غسل البلدان النامية مع RPMI 10٪ FBS (بدون المضادات الحيوية)، واحتضان لهم 10 ميكروغرام / مل OTII OVAp (OVA 323-339؛ ISQAVHAAHAEINEAGR) على أنبوب من البلاستيك في 1 مل من RMPI 10٪ FBS المتوسطة في 5 × 10 6 البلدان النامية للحد الأدنى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ونتيجة لسيطرة سلبية، وترك البلدان النامية دون يحتضنها مع OVAp.
  3. إصابة البلدان النامية
    1. تصيب البلدان النامية في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 البكتيريا (10 جرثومة لكل DC) لمدة 1 ساعة في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
    2. غسل الخلايا DC 3X في برنامج تلفزيوني و1X في RMPI 10٪ FBS والطرد المركزي في 450 x ج من أجل غسل معظم البكتيريا خارج الخلية. وأخيرا، وخلايا resuspend في RMPI 10٪ FBS المتوسطة (بدون المضادات الحيوية) في 20 × 10 6 خلية / مل.

2. عزل CD4 + T اللمفاوية من الفئران المعدلة وراثيا OTII

ملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الثانية. وينبغي أن تستخدم الغدد الليمفاوية بدلا من الطحال لعزل خلايا CD4 + T، لأن نسبة CD4 + الخلايا الليمفاوية في العقدة اللمفاويةالصورة (~ 50٪) أكبر مما كانت عليه في الطحال (~ 25٪)، وبالتالي تنقية ستكون أكثر فعالية.

  1. جعل التعليق وحيدة الخلية من الغدد الليمفاوية
    1. إزالة الإربي، الإبطين، العضدية، عنق الرحم والغدد الليمفاوية المساريقي 23 من OTII الفئران المعدلة وراثيا ونقل في طبق من البلاستيك مع 10 مل من RPMI 10٪ FBS المتوسطة.
    2. الغدد الليمفاوية طحن تحت غطاء العقيمة باستخدام شريحتين المجهر بلوري. وضع الغدد الليمفاوية على الجانب متجمد من شريحة واحدة المجهر، وفرك مع الجانب متجمد من الشريحة الثانية حتى كانت أجهزة الأرض.
    3. يغسل تعليق خلية واحدة في المخزن PBS / BSA / EDTA.
    4. تصفية الخلايا على الرغم من مصفاة الخلية (70 ميكرون) لإزالة النسيج الضام، ويغسل مع PBS / BSA / العازلة EDTA.
    5. Resuspend الخلايا في 1 مل من ACK العازلة تحلل واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.
  2. عزل خلايا CD4 + T
    1. يغسل مرة أخرى كما في الخطوة 2.1.3 والعدالخلايا ل resuspend لهم في 100 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA. إضافة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز ضد CD8، الغلوبولين المناعي، B220، CD19، MHC من الدرجة الثانية (I-أب)، CD11b، CD11c وو DX5 في 1: 250 لمدة 30 دقيقة على الجليد لاختيار السلبية في وقت لاحق من خلايا CD4 + T.
    2. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA واحتضان الخلايا (100 × 10 6 خلية / مل) مع بلي streptavidin في التركيز الموصى به في بروتوكول الشركة المصنعة لمدة 15 دقيقة على الجليد.
    3. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA وتصفية لهم على الرغم من مصفاة الخلية (30 ميكرون) قبل CD4 + T زنزانة انفرادية.
    4. عزل خلايا CD4 + T عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام المغناطيسية آلة فصل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    5. عد الخلايا وضبط 4 × 10 6 خلية / مل مع RPMI 10٪ FBS المتوسطة (بدون المضادات الحيوية).
    6. إصلاح والحفاظ على الجليد معزولة CD4 + T الخلايا (3 × 10 5 الخلايا) للتحقق من نقاء التدفقالكريات كما هو موضح 24. يظهر مثال CD4 + T الخلايا تنقية في الشكل 3C.

3. T خلية Transinfection قياس من قبل حماية جنتاميسين الفحص

ملاحظة: يلخص الشكل 2 هذه الخطوة الثالثة من البروتوكول.

  1. T خلية Transinfection
    1. احتضان خلايا CD4 + T معزولة مع الخلايا المصابة DC (1: 1) (أصيبوا في البلدان النامية لمدة 1 ساعة وغسلها للقضاء على البكتيريا الحرة) لمدة 30 دقيقة للسماح تشكيل المشبك المناعي في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
    2. إضافة 0.5 مل من الخلايا المعزولة CD4 + T (2 × 10 6 خلايا) و 0.1 مل من البلدان النامية المصابة (2 × 10 6 خلايا) على لوحة الثقافة 24 أيضا. كما سيطرة سلبية، تصيب بشكل مباشر 0.5 مل من خلايا CD4 + T في وزارة الداخلية من 10 البكتيريا لمدة 30 دقيقة.
    3. وتشمل الضوابط الإضافية التي تفصل البلدان النامية المصابين من خلايا T باستخدامحاجز البولي transwell (مع 3 ميكرون من حجم المسام)، التي تعوق DC-T الاتصال الجسدي. إضافة 0.1 مل من البلدان النامية داخل transwell و 0.5 مل من خلايا CD4 + T في حجرة أقل من البئر (لوحة 24 أيضا).
    4. وأخيرا، مع استكمال RMPI المتوسطة حتى يكون هناك 0.6 مل في كل بئر لجعل كميات متساوية في جميع العينات.
    5. بعد 30 دقيقة من تشكيل المشبك المناعي، إضافة 100 ميكروغرام / مل من جنتاميسين واحتضان لمدة 1 ساعة قبل جمع الخلايا في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
  2. إعادة عزل خلايا CD4 + T
    1. جمع الخلايا غير ملتصقة و resuspend لهم في المخزن PBS / BSA / EDTA. لا تزال تعلق معظم البلدان النامية إلى لوحة الثقافة البلاستيك. أنابيب دوامة بلطف لضمان تصنيف الخلية. تبقي 500 ميكرولتر من طاف الخلية عن السيطرة لإظهار أن الجنتاميسين عملت بشكل جيد.
    2. إعادة عزل خلايا CD4 + T من العينات التي تحتوي على البلدان النامية وخلايا T معا كما في الخطوة 2.2، على الرغم من أن معظم البلدان النامية يجب أن تعلق على لوحة. الحفاظ على عينات السيطرة على الجليد. تأخذ بعين الاعتبار التجارب فقط مع التلوث أقل من 2٪. يظهر مثال CD4 + T الخلايا تنقية بعد transinfection في الشكل 3D.
  3. ليز خلايا تي والبذور منها على البكتيريا لوحات المتوسطة أجار.
    1. غسل خلايا CD4 + T مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    2. عد الخلايا و resuspend لهم في 2 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 في 500 ميكرولتر من الخلايا T ليز لهم في 1 × 10 6 خلية / مل، والإفراج عن البكتيريا داخل الخلايا من الخلايا T.
    4. تقديم 3 التخفيفات العشرية المسلسل من الخلايا هي lysed والبذور 50 ميكرولتر من كل تخفيف على البكتيريا لوحات أجار المتوسطة. تقسيم لوحات إلى 4 أجزاء والبذور التخفيفات مختلفة من الخلايا هي lysed في كل جزء. وتظهر نتائج ممثل في الشكل (4).
      1. كعنصر تحكم، وأيضا لوحة لعملت المخزنة طاف خلية من خلايا تقارن على أجار، للتأكد من أن الجنتاميسين جيدا. أيضا لوحة البلدان النامية المصابة كعنصر تحكم إضافية. في حالة حدوث انخفاض التلوث البلدان النامية (<2٪)، وطرح وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) المقابلة لانخفاض التلوث DC.

4. الكمي لT خلية Transinfection بواسطة التدفق الخلوي

ملاحظة: يلخص الشكل 2 هذه الخطوة.

  1. T خلية Transinfection
    1. تصيب BMDCs كما في الخطوة 1.3، ولكن استخدام GFP معربا عن البكتيريا في هذه الحالة.
    2. خلايا CD4 + T وصمة عار (معزولة من الغدد الليمفاوية في الخطوة 2.2) مع aminocoumarin تعقب خلية كلورو (تواجه المركز) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    3. غسل المسمى خلايا CD4 + T مرتين مع RMPI 10٪ FBS (بدون المضادات الحيوية).
    4. احتضان البلدان النامية المصابة (بعد 1 ساعة الحضانة مع البكتيريا) مع صفت CD4 +خلايا T لمدة 30 دقيقة للسماح تشكيل المشبك المناعي عند 37 درجة مئوية بما في ذلك جميع الضوابط شرح في الخطوة 3.1.1.
  2. تلطيخ الخلايا المصابة CD4 + T
    1. بعد 30 دقيقة من DC-T تشكيل المشبك المناعي، وجمع الخلايا وغسلها في برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA.
    2. بعد سنتين يغسل مع PBS / BSA / EDTA العازلة، والخلايا مجمعة منفصلة من قبل vortexing بلطف الأنابيب.
    3. إصلاح عينات في 0.2 مل / أنبوب PBS تحتوي على 3٪ PFA لمدة 15 دقيقة في RT. ثم غسلها في برنامج تلفزيوني.
    4. احتضان مع مكافحة فأر CD16 / CD32 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (2.5 ميكروغرام / مل) في 50 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لمدة 15 دقيقة على الجليد لمنع مستقبلات القطعة Fc من الخلايا الجذعية.
    5. إضافة أرنب المضادة للبكتيريا الأجسام المضادة (10 ميكروغرام / مل كما التركيز النهائي) في 50 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لمدة 30 دقيقة على الجليد وصمة عار البكتيريا خارج الخلية.
    6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA واحتضان مع الأجسام المضادة ضد ماوس CD11c ومترافق مع فيكوإيريترين (PE) وحد ذاتهاالأجسام المضادة ضد condary أرنب مترافق مع تألقي الأخرى مثل اليكسا فلور 647 في 1: 200 في 100 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    7. غسل الخلايا وتحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. لا تنسى أن تشمل عينة من خلايا T transinfected باستخدام البكتيريا غير الفلورسنت السيطرة والعينات سلبية كما وصفت واحدة فقط من كل تألقي المستخدمة في التجربة لتعويض العينات وضبط التدفق الخلوي ضبط 25. ويظهر تحليل تمثيلي في الشكل (5).
      ملاحظة: إذا البكتيريا لا تعبر عن GFP، للتمييز بين الخلايا والبكتيريا خارج الخلية، والتسمية البكتيريا خارج الخلية، وإصلاح، وpermeabilize العينات مع تريتون X-100 عند 0.5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. وصمة عار بعد ذلك مجموع البكتيريا (داخل الخلايا + خارج الخلية) مع تألقي مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا وصفنا كيفية أداء الفئران خلايا T transinfection بكتيريا من نخاع العظم المصاب المستمدة من البلدان النامية وكيفية قياس transinfection بكتيريا عبر نهجين مختلفين: التدفق الخلوي والجنتاميسين بقاء فحص يلخص الشكل 1 الإجراء للحصول على الخلايا. يتم إنشاؤها من قبل البلدان النامية حضانة خلايا نخاع العظام مع GM-CSF لمدة 9 أيام. ثم، يتم maturated البلدان النامية مع LPS لزيادة MHCII على غشاء لتحميلها في وقت لاحق مع الببتيد محددة من OVA (OVAp). كعنصر تحكم، لا يتم تحميل بعض البلدان النامية مع OVAp. يصاب كل من البلدان النامية (OVAp تحميلها وغير محملة) في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 البكتيريا. من ناحية أخرى، يتم عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية من الفئران المعدلة وراثيا OTII، والتي تعترف OVAp محددة الشكل 2 يصور الداخلي لأداء وتحديد الخلايا التائية transinfection بما في ذلك ضوابط السلبية المناسبة. كما descriالفراش قبل، لا يتم تحميل بعض البلدان النامية مع OVAp. في هذه الحالة، هناك تفاعل بين البلدان النامية وخلايا T، ولكن ليس المناعي تشكيل المشبك بسبب غياب OVAp. يتم تضمين عنصر تحكم إضافية، تفصل البلدان النامية وخلايا T بحاجز البولي transwell (مع 3 ميكرون من حجم المسام)، مما يعوق DC-T الاتصال الجسدي. تدرج البلدان النامية داخل transwell. ونتيجة لذلك فهي ليست قادرة على المرور عبر هذا حجم المسام. أدرج سيطرة سلبية أخرى أيضا، وإصابة الخلايا T المباشر، التي يحتضنها خلايا T مباشرة في وزارة الداخلية من 10 البكتيريا. T خلية transinfection يمكن قياسها كميا بواسطة النهجين: التدفق الخلوي أو الجنتاميسين بقاء الفحص. لقياس التدفق الخلوي، البلدان النامية ينبغي أن يكون قد أصيب سابقا مع خلايا البكتيريا GFP وCD4 + T وصمة عار مع تعقب الخلايا (خلايا تي زرقاء). بعد تشكيل المتقارن، يجب أن تكون ملطخة الخلايا مع أجسام مضادة ضد البلدان النامية (CD11c و-PE). وينبغي أيضا أن تكون ملطخة البكتيريا خارج الخلية من أجل quantifذ نسبة الخلايا المصابة CD4 + T التدفق الخلوي في وقت لاحق. لقياس transinfection التي كتبها الجنتاميسين بقاء الفحص، يتم تحضين الخلايا مع الجنتاميسين لمدة 1 ساعة لقتل البكتيريا خارج الخلية، ثم خلايا T يتم إعادة معزولة إلى البذور على لوحة أجار. مصنوعة التخفيفات المسلسل العشرية إلى البذور 50 ميكرولتر من كل تخفيف على لوحة أجار وتسهيل عملية فرز CFUs.

كما هو مبين في الشكل (3)، وإلى أن يتم التحقق DC التمايز التدفق الخلوي (الشكل 3A و 3B). البلدان النامية يجب أن يعبر عن CD11c وو MHCII (الشكل 3A) وليس GR-1، الذي هو علامة من العدلات. كما هو مبين في الشكل 3B، بعض العدلات (3.27٪ من GR-1 +، MHC -) قدمت في الثقافة، ولكن ثقافة البلدان النامية مع أكثر من 5٪ من تلوث العدلات لا ينبغي أن تستخدم. يجب فحص CD4 + T خلايا النقاء بعد عزلة من لايالعقد ميل في الساعة (الشكل 3C) وبعد الانفصال من البلدان النامية تقارن تشكيل (الشكل 3D). تأخذ بعين الاعتبار التجارب مع أقل من 2٪ من الملوثات بعد تشكيل تقارن.

ويبين الشكل 4 مثال T transinfection التجربة باستخدام السالمونيلا. كما هو موضح في الشكل 4A، وتنقسم لوحات في أربعة أجزاء البذور التخفيفات التسلسلي في كل جزء. السالمونيلا نمت على لوحات أجار LB والوحدات المكونة للمستعمرة يمكن عدها. كما هو مبين في الشكل 4A، تم القبض على السالمونيلا من قبل خلايا T من البلدان النامية المصابين وتعززت هذه العملية بشكل واضح مع الاعتراف OVAp (لوحات على يسار الشكل 4A) والشكل (4B). ومع ذلك، عندما كان هناك حاجز مادي تعوق الاتصال بين الخلايا البلدان النامية وT، ولم يكن هناك transinfection، كما في حالة القيام T المباشر إصابة الخلايا (لوحات على يمين الشكل 4A) والشكل (4B).

كما هو مبين في الشكل (5)، T خلية transinfection يمكن قياس التدفق الخلوي باستخدام بكتيريا تعبر عن GFP مشرق. خلايا T البلدان النامية ويمكن أن تكون متباينة من حيث الحجم والتعقيد في مؤامرة الأمام والجانب مبعثر، ولكن علامات مختلفة يمكن استخدامها للتمييز بشكل جيد لهم. وصفت خلايا CD4 + T مع تعقب الخلية (تواجه المركز) والبلدان النامية مع الأجسام المضادة ضد CD11c و. كانت ملطخة البكتيريا خارج الخلية مع الضد الأرنب ضد السالمونيلا والثانوي الأضداد المضادة للأرنب مترافق مع فلور اليكسا 647. ولذلك، فإن النسبة المئوية للخلايا CD4 + T المصابة يمكن قياسها كميا لأنها وصفت مع ذلك المركز (وليس مع CD11c و-PE)، وأعرب عن GFP (البكتيريا GFP)، لكنها لم تكن ملطخة الأجسام المضادة ضد البكتيريا خارج الخلية (فلور اليكسا 647).

ntent "FO: المحافظة على together.within صفحة =" 1 "> الشكل 1
الشكل رقم 1. تدفق الجيل DC وCD4 + T زنازين العزل. على الجانب الأيسر من الشكل، وعملية للتمييز الخلايا الجذعية (DCS) من خلايا نخاع العظام هو مفصل. بعد تشريح عظام الفخذ وtibias، يتم استخراج خلايا نخاع العظام من داخل العظام. بعد ذلك، يتم هي lysed خلايا الدم الحمراء (RBC) وخلايا نخاع العظام ومثقف مع الفئران colony- تحفيز عامل محببة بلعم المؤتلف (GM-CSF) لمدة 9 أيام. مرة واحدة هم متباينة بشكل جيد، يتم تحضين البلدان النامية مع lipopolysaccharide في (LPS) لزيادة مجمع الرائد التوافق النسيجي II (MHCII) التعبير. ثم، يتم تحميل البلدان النامية مع الببتيد ovoalbumin معين (OVAp) والمصابين وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 البكتيريا. بعضهم لا يتم تحميلها مع OVAp كمجموعة تحكم. على الجانب الأيمن من الشكل، كيفيةعزل خلايا CD4 + T من يمثل الفئران المعدلة وراثيا OTII. الغدد الليمفاوية (LNS) قد ألغيت والأرض، الحصول على تعليق وحيد الخلية. وأخيرا، يتم عزل خلايا CD4 + T عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام المغناطيسية آلة فصل الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
يتم تحضين الشكل 2. مخطط تدفق T إجراء transinfection الخلية. المصابة (وصفت البكتيريا باللون الأخضر) وOVAp محملة البلدان النامية (خلايا الدم الحمراء) مع خلايا CD4 + T (خلايا الزرقاء) للسماح تشكيل المشبك المناعي. يتم تحضين البلدان النامية المصابة (ولكن ليس محملة OVAp) أيضا مع خلايا T، والذي يسمح التفاعل بين كل من الخلايا ولكن دون تشكيل المشبك المناعي. يتم تضمين عنصر تحكم إضافية، فصل CD4 + الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تدفق الكريات تحليل نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية وخلايا CD4 + T معزولة. نقطة المؤامرات التمثيلية للنخاع العظام المستمدة من البلدان النامية التي حللهاالتدفق الخلوي. أعرب (A) البلدان النامية MHCII وCD11c و(85.8٪؛ الربع العلوي الأيمن) أعرب (B) البلدان النامية MHCII ولكن ليس GR-1 (85٪؛ الربع السفلي الأيمن). ومع ذلك، كان هناك 3.27٪ من الخلايا التي أعربت GR-1 ولكن ليس خلايا MHCII (الربع الأيسر). وكانت هذه الخلايا العدلات الملوثة طفيفة. (C و D) المدرج الإحصائي الذي يمثل النقاء من خلايا CD4 + T معزولة من الغدد الليمفاوية (C)، وبعد تشكيل المترافقة مع الخلايا الجذعية (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. الخلايا التائية transinfection كميا بواسطة الجنتاميسين بقاء الفحص. تم تقسيم لوحات أجار LB إلى 4 أجزاء الموافق ديسيمال التخفيفات المسلسل هي lysed خلايا CD4 + T. (A) مستعمرة تشكيل نمت وحدات من السالمونيلا الملهبة على لوحات أجار LB الموافق T خلية transinfection في وجود (+) أو غياب (-) من OVAp على سطح DC المصابين، وفي ظروف تتيح الاتصال DC / T الخلية (- TW) أو في وجود حاجز مادي تعوق هذه الاتصالات (+ TW). ويرد أيضا لوحة فارغة المطابقة للإصابة الخلايا T المباشر (المراقبة السلبية). فلم يكن هناك أي transinfection عندما أعاق DC / T خلية الاتصال (+ TW). (B) الكمي لمستعمرة وحدات تشكيل (CFUs) من العديد من التجارب التي تبين نسبة بكتيريا التي استولت عليها خلايا T من البلدان النامية المصابة. إصابة الخلايا T المباشر، والظروف التي تعوق DC / T خلية الاتصال تنتج شيئا يذكر لولا مستويات العدوى الخلايا التائية. عندما سمح DC / T الاتصالات المحمولة، وكان هناك الخلايا التائية transinfection، وتعززت عن طريق التعرف على المستضد (+ OVAp). الحانات عمود تمثل متوسط ​​3 طتجارب ndependent. أشرطة الخطأ تشير إلى SD. وتتمثل الاختلافات الكبيرة التي *** الموافق ص <0،0001. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الخلايا التائية transinfection كميا عن طريق التدفق الخلوي. نقطة التمثيلية مؤامرة تظهر البلدان النامية وT تقارن الخلية بعد عملية transinfection. خلايا CD4 + T صغيرة ومستديرة إلى الأمام والجانب مبعثر (FCS - SSC) عروض دوت صمة عار، ولكي تكون متباينة بشكل جيد، وكانت ملطخة تعقب الخلية (تواجه المركز). لا وصفت البلدان النامية التعبير عن CD11c ومع ذلك المركز وعدد أكبر من الخلايا T CD4 + T مع شكل غير منتظم. الخلايا المصابة CD4 + T التي تحتوي على الخلايا البكتيريا GFP لكن سلبية لextracelالبكتيريا lular (6.19٪) وترد في الربع السفلي الأيمن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خلايا T أو T الليمفاوية هي نوع من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في مناعة خلوية وتنتمي إلى الاستجابة المناعية التكيفية 26. خلايا T هي صهر لإصابتها في المختبر ولكن تشير بعض التقارير أنها يمكن أن تصاب في الجسم الحي 14،15. الاتصالات الحميمة من خلايا APC وT خلال المشبك المناعي بمثابة منابر لتبادل المواد البيولوجية 13، بما في ذلك بعض الفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية (11). وقد تبين مؤخرا أن يتعارض مع العقيدة، وخلايا T، ونموذج من خلايا المناعة التكيفية، هي أيضا قادرة على التقاط البكتيريا عن طريق transinfection بكفاءة من البلدان النامية المصابة 11،16. هنا نظهر انه مفصل بروتوكولات لتحديد الخلايا التائية transinfection بكتيريا في المختبر من BMDCs المصابين.

وتعززت T خلية transinfection بكتيريا التي كتبها الاعتراف مستضد 16. أظهرنا أنه باستخدام خلايا CD4 + T معزولة عنالفئران المعدلة وراثيا OTII الاعتراف OVAp محددة، BMDCs محملة OVAp والفئران المصابة ببكتيريا مختلفة (هنا يتم تقديم البيانات من السالمونيلا الملهبة). يتم تحضين CD4 + T الخلايا المعزولة من OTII الفئران مع البلدان النامية المصابة لمدة 30 دقيقة للسماح تشكيل المشبك المناعي. البيانات المقدمة هنا تتوافق مع البكتيريا أن الخلايا T يمكن التقاط من البلدان النامية في هذه الفترة القصيرة من الزمن. ونحن نعلم أن التعرض أطول من خلايا T إلى البلدان النامية المصابة أسفرت يلتقط البكتيرية أكبر (لا يظهر)، ولكن كما خلايا T أيضا تدمير البكتيريا المستحوذ بسرعة كبيرة، وأثبتت الكمي لtransinfection البكتيرية التي تحدث خلال أطول DC / T الاتصالات الوقت خلية من الصعب . جنتاميسين بقاء الاختبار هو طريقة حساسة جدا لتحديد الخلايا التائية transinfection لأنه قادر على كشف واحد تصيب بكتيريا واحدة 21. بعد الحضانة مع الجنتاميسين التي تقتل البكتيريا خارج الخلية فقط، وخلايا T معزولة و lysed البذور على البكتيريا المتوسطة أجار ررآتش. عزل خلايا T بعد تشكيل تقارن مع البلدان النامية هي خطوة حاسمة في إطار البروتوكول. ينبغي أن تؤخذ التجارب الوحيدة مع أقل من 2٪ من الملوثات في الاعتبار. ويمكن قياس التلوث DC التي يجب أن تطرح التدفق الخلوي وCFUs الموافق منخفضة التلوث DC. بدلا من ذلك، خلايا CD4 + T نقاء يمكن تحسينها باستخدام فرز الخلايا.

مقاربة أخرى لقياس transinfection T الخلية هو التدفق الخلوي، وذلك باستخدام GFP معربا عن البكتيريا ووصفها البكتيريا خارج الخلية مع fluorophore متوافق. واحد الحد من هذا النهج هو أن البكتيريا لديها للتعبير عن GFP الذي هو مشرق بما فيه الكفاية للكشف عن الخلايا المصابة على خلفية تألق ذاتي. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون ملطخة البكتيريا قبل اصابة البلدان النامية مع تعقب الخلية. وهناك نهج آخر يتمثل تلطيخ البكتيريا خارج الخلية، permeabilizing الخلايا T، ثم وصفها جميع البكتيريا (داخل الخلايا + خارج الخلية)مع تألقي مختلفة.

وفيما يتعلق بالتوجهات المستقبلية من هذا البروتوكول، ونحن نحاول لإعداد بروتوكول لتحديد عدد الخلايا T التي استولت على البكتيريا بعد أطول المعرض إلى البلدان النامية المصابة، وذلك باستخدام البكتيريا مزينة الجزيئات المغناطيسية. فإن خلايا T التقاط البكتيريا تحتفظ الجزيئات المغناطيسية وبالتالي فإنه يجب أن يكون من السهل عزل عليها باستخدام المغناطيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Fisher Scientific SH3025501
r-GMCSF Peprotech 315-03
LPS SIGMA L2630-10mg
Na Pyruvate Thermo Scientific SH3023901
2-ME Gibco 31350-010
OVAp OTII (323–339) GenScript
Cell Strainer 70uM BD 352350
 30 uM Syringe Filcons Sterile BD 340598
AutoMacs Classic Miltenyi Biotec 130-088-887
Gentamicin Normon 624601.6
Transwell Costar 3415
LB Pronadisa 1231
Agar Pronadisa 1800
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100
CD8 biot BD Biosciences 553029
IgM Biot ImmunoStep Clone RMM-1
B220 Biot BD Biosciences 553086
CD19 biot BD Biosciences 553784
MHC-II Biot (I-A/I-E) BD Biosciences 553622
CD11b biot Immunostep 11BB-01mg
CD11c biot Immunostep 11CB3-01mg
DX5 biot BD Biosciences 553856
Gr-1 biot BD Biosciences 553125
CD16/CD32 ImmunoStep M16PU-05MG
anti Salmonella ABD Serotec 8209-4006
CD11cPE BD Biosciences 553802
CD4-APC Tonbo Biosciences 20-0041-U100
Gr-1 APC BD Biosciences 553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC BD Biosciences 553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Invitrogen A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) Life technologies C2110
BSA SIGMA A7030-100G
Streptavidin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-101
BD FACSCanto II BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
  2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
  3. Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
  4. Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
  5. Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
  6. Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
  7. Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
  8. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
  9. Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
  10. Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
  11. Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
  12. Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
  13. Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
  14. McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
  15. Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
  16. Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
  17. Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
  18. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
  19. Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  20. Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
  21. Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
  22. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
  24. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  25. Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
  26. Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).

Tags

علم المناعة، العدد 107، transinfection، تقديم المستضد، وخلايا T والخلايا الجذعية، والبكتيريا، جنتاميسين بقاء الفحص
T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cruz-Adalia, A.,… More

Cruz-Adalia, A., Ramírez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacón, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (107), e52976, doi:10.3791/52976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter