Summary
नए सिरे से lipogenesis और β-फैटी एसिड ऑक्सीकरण hepatocyte में महत्वपूर्ण चयापचय मार्ग, फैटी लीवर रोग सहित कई चयापचय संबंधी विकार, में आनाकानी कर रहे हैं कि रास्ते का गठन। यहाँ हम माउस प्राथमिक हेपाटोसाइट्स के अलगाव का प्रदर्शन और β-फैटी एसिड ऑक्सीकरण और lipogenesis की मात्रा का ठहराव का वर्णन है।
Protocol
सभी पशु प्रयोग स्थानीय और संघीय नियमों के अनुसार और एक संस्थागत IACUC और विकिरण सुरक्षा प्रशासन के अनुमोदन से बाहर किया जाना चाहिए।
1. तैयारी
- कई दिन पहले परख करने के लिए, लिवर डाइजेस्ट मध्यम (LDM) की 500 मिलीलीटर की बोतल पिघलना और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ~ 35 मिलीलीटर aliquots फ्रिज में। जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- एक दिन पहले परख करने के लिए, आटोक्लेव द्वारा स्वच्छ विच्छेदन उपकरण पूर्व बाँझ।
- परख के दिन, कोलेजन के साथ 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए आवश्यक राशि का इलाज।
- पीबीएस के 50 भागों के साथ 3 मिलीग्राम / एमएल चूहे की पूंछ कोलेजन के भाग 1 मिलाएं। 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए लगभग 500 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट (आरटी) के लिए सेते हैं। कोलेजन निकालें और प्लेट हुड में शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं। कम से कम एक अतिरिक्त समय दोहराएँ।
नोट: कोलेजन कोटिंग विज्ञापन में एक सप्ताह तक किया जा सकता हैवेंस और प्लेट प्लास्टिक की चादर में बंद 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
- पीबीएस के 50 भागों के साथ 3 मिलीग्राम / एमएल चूहे की पूंछ कोलेजन के भाग 1 मिलाएं। 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए लगभग 500 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट (आरटी) के लिए सेते हैं। कोलेजन निकालें और प्लेट हुड में शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं। कम से कम एक अतिरिक्त समय दोहराएँ।
- 37 डिग्री सेल्सियस तक पिघलना LDM और गर्म और 1 एन कोह का उपयोग कर 7.4 पीएच को समायोजित: परख के लिए Ldm तैयार करें। एक recirculating 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर और जगह का उपयोग फ़िल्टर।
- नहाने के पानी recirculating में 42 डिग्री सेल्सियस के लिए जिगर छिड़काव माध्यम से गर्म 25 मिलीलीटर।
- Polyvinylpyrrolidone समाधान के साथ लेपित 90% कोलाइडयन सिलिका तैयार: polyvinylpyrrolidone साथ लेपित कोलाइडयन सिलिका के 9 मिलीलीटर 10x DPBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 0.1 एन एचसीएल का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित करें। एक बाँझ 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर। आरटी पर स्टोर।
- 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म चढ़ाना मझौले।
प्राथमिक माउस Hepatocytes 2. अलगाव
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, ट्यूबिंग, और विच्छेदन तालिका सेट करें: बाँझ पानी की 10 मिलीलीटर के द्वारा पीछा आसुत जल में 5 मिलीलीटर 70% इथेनॉल के साथ निस्तब्धता द्वारा ट्यूबिंग जीवाणुरहित। भरने के लिए जिगर छिड़काव मध्यम में ट्यूबिंग और चलाने पंप की जगहट्यूबिंग की पूरी लंबाई।
- संस्थागत मंजूरी दे दी विधि द्वारा माउस बलिदान।
- उदर गुहा खुला काटना: 70% इथेनॉल के साथ उदारतापूर्वक माउस पेट का छिड़काव करें। कुंद अंत कैंची का प्रयोग, डर्मिस के माध्यम से पेट की लंबाई एक midline चीरा बनाने और पार्श्व दर्शाते हैं। विसरा को बेनकाब करने के पेरिटोनियम में एक समान चीरा।
- धीरे आंतों विस्थापित, एक कुंद साधन का प्रयोग पेट की वाहिका पेट अवर रग Cava (आईवीसी) और गुर्दे की नस को बाहर का रक्त वाहिका के नीचे एक सीवन, जगह का पर्दाफाश करने के लिए
- बाहर का सिवनी के लिए, सीवन के स्तर से परे यह आगे बढ़ाने, आईवीसी में एक सुई और कैथेटर जगह है। अभी भी जगह में सुई के साथ, यह जगह में पकड़ के लिए कैथेटर के आसपास सीवन टाई। ध्यान से सुई को हटा दें। अगर कैथेटर के माध्यम से प्रवाह के साथ, सही ढंग से खून किया।
- एक pipet का उपयोग करना, यह सुनिश्चित करना, छिड़काव मध्यम के साथ कैथेटर में शेष क्षेत्र को भरनेकि कोई हवा मौजूद है। बड़ी सावधानी के साथ, कैथेटर के लिए ट्यूबिंग देते हैं।
- फेफड़ों गुहा खुला काटना: धीरे डायाफ्राम को बेनकाब करने के लिए बेहतर जिगर पालियों दर्शाते हैं। फिर ध्यान, तेज टिप कैंची से डायाफ्राम पंचर पित्ताशय और फुफ्फुस वाहिका से बचने के लिए, देखभाल करने के फुफ्फुस गुहा का पर्दाफाश करने के लिए एक पार्श्व चीरा बनाते हैं। यकृत नस के लिए बस के समीपस्थ वक्ष अवर रग कावा के चारों ओर एक बुलडॉग दबाना रखें।
- पोर्टल नस कट और 3 पर पंप पर बारी - / मिनट 4 मिलीलीटर। छिड़काव माध्यम के लगभग 20 मिलीलीटर का उपयोग कर 5 मिनट के लिए जिगर छिड़काव मध्यम के साथ जिगर छिड़कना।
नोट: जिगर तुरंत तन / ग्रे लाल से बदलना चाहिए। जिगर के कुछ भागों लाल बने हुए हैं, तो यह संभावना गरीब छिड़काव इंगित करता है, और सफल अलगाव की संभावना बहुत कम है। छिड़काव के दौरान, बाहर नहीं चला है मध्यम सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहना होगा और कोई बुलबुले ट्यूबिंग दर्ज है। - 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, बंद करोपंप और लिवर डाइजेस्ट मध्यम पर ट्यूबिंग हस्तांतरण। (मध्यम समाप्त हो रहा है जब तक) 15 मिनट - पंप पुन: प्रारंभ करें और अन्य 10 के लिए जिगर छिड़कना।
- छिड़काव के अंत में, पंप बंद करो। जिगर एक गुलाबी रंग की है और कुछ हद तक बढ़े हुए दिखाई देनी चाहिए। सावधान विच्छेदन से जिगर आबकारी। पित्ताशय निकालें और 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के लिए जिगर हस्तांतरण।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, जिगर को चढ़ाना माध्यम के 10 एमएल (तालिका 1) जोड़ें। धीरे हेपाटोसाइट्स दूर करने के लिए या तो संदंश या एक छुरी का उपयोग कर जिगर परिमार्जन। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक 100 माइक्रोन सेल झरनी और हस्तांतरण का उपयोग निलंबन फ़िल्टर। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक अतिरिक्त 10 चढ़ाना मध्यम के मिलीग्राम और पूल के साथ थाली धो लें।
- 350 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं।
- 90% कोलाइडयन सिलिका के 10 मिलीलीटर पुलिस के साथ लेपित महाप्राण मध्यम और चढ़ाना माध्यम के 10 एमएल में resuspend गोली और जोड़नेlyvinylpyrrolidone। कदम 2.11 के रूप में धीरे और सेंट्रीफ्यूज मिलाएं। जीवित कोशिकाओं नीचे करने के लिए गोली जाएगा, जबकि बाद centrifugation, मृत कोशिकाओं की एक परत, मिश्रण के ऊपर तैर कर दिया जाएगा।
- महाप्राण मृत कोशिकाओं और मध्यम। चढ़ाना मध्यम, 2.11 के रूप में सेंट्रीफ्यूज के 20 मिलीलीटर के साथ 2 बार धोएं।
- चढ़ाना माध्यम के 10 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं। एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और कोलेजन का इलाज 24 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में 9 एक्स 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से जगह है। 2 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं। प्रत्येक प्लेट फैटी एसिड ऑक्सीकरण परख या lipogenesis परख सकते हैं या तो के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- वैकल्पिक रूप से, 37 डिग्री सेल्सियस पर रखरखाव मध्यम (1 टेबल) और संस्कृति के लिए कुओं बदल जाते हैं। परख परिणामों को प्रभावित किए बिना - 3 दिन कोशिकाओं 2 के लिए संवर्धित किया जा सकता।
3. फैटी एसिड ऑक्सीकरण परख
चेतावनी: रेडियोधर्मिता का प्रयोग खतरनाक हो सकता है। सभी क्रय, भंडारण, हैंडलिंग, और diरेडियोधर्मी सामग्री की sposal संस्थागत, राज्य और संघीय नियमों और दिशा निर्देशों के अनुसार बाहर किया जाना चाहिए।
- 16-20 घंटे से पहले परख करने के लिए, गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 2 बार धो लें। 20 एनएम ग्लूकागन साथ सीरम मुक्त सीरम भुखमरी मध्यम (तालिका 1) के लिए कोशिकाओं को बदलें और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
नोट: भ्रूण गोजातीय सीरम चयापचय हार्मोन के एक अज्ञात एकाग्रता (जैसे इंसुलिन, ग्लूकागन) होता है क्योंकि, सीरम इस परख पर हो सकता है कोई confounding प्रभाव को दूर करने के लिए कोशिकाओं को भूखा। प्रकोष्ठों> 24 घंटे के लिए सीरम भुखमरी मध्यम में सक्षम हैं। ग्लूकागन उपचार हेपाटोसाइट्स भीतर फैटी एसिड ऑक्सीकरण को प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। - परख की सुबह, पूर्व ऊष्मायन मध्यम तैयार: 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 100 मिमी समाधान और गर्मी बनाने के लिए ultrapure पानी में सोडियम Palmitate का एक उचित मात्रा Resuspend। इस बीच, अपेक्षित राशि (24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीलीटर) तैयार25 मिमी HEPES, 1% बीएसए भिन्न वी, और 20 एनएम ग्लूकागन साथ DMEM की। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी।
- Solubilized एक बार, मध्यम करने के लिए 250 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए Palmitate जोड़ें। मध्यम-ऊष्मायन से पहले और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हेपाटोसाइट्स बदलें। बाद में उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कुछ पूर्व ऊष्मायन मध्यम सुरक्षित रखते हैं।
- ऊष्मायन के दौरान, नाइट्रोजन गैस के तहत वाष्पीकरण द्वारा 14 सी-Palmitate का एक उचित मात्रा (0.5 μCi / अच्छी तरह से) सूखी।
- उदाहरण के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली में 24 नमूने को मापने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब 0.1 μCi / एमएल 14 सी-Palmitate के 120 μl हस्तांतरण। धीरे-धीरे एक धूआं हुड में 3-5 सेमी की दूरी से समाधान पर नाइट्रोजन गैस उड़ाने से विलायक इथेनॉल लुप्त हो जाना। ट्यूब के नीचे में सूखे 14 सी-Palmitate छोड़ रहा है, 40 मिनट - विलायक में लगभग 30 लुप्त हो जाना चाहिए।
- लगभग 15 मिनट ऊष्मायन के अंत से पहले, 14 resuspend0.1 एन NaOH में सी-Palmitate (12.5 μl / μCi)। 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। गर्म पूर्व ऊष्मायन मध्यम के तीन खंडों जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
- पतला 14 सी-Palmitate के 25 μl के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक स्पाइक। धीरे थाली कमाल मिक्स और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इस परख थाली है।
- ऊष्मायन के दौरान, फिल्टर पेपर प्लेट (चित्रा 1) तैयार करते हैं।
- एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली से कवर निकालें। कुओं में से प्रत्येक के तल में फिल्टर पेपर में से एक 2 सेमी x 2 सेमी टुकड़ा रखें। 4 "x 7" parafilm का एक टुकड़ा के साथ थाली ओवरले।
- इस तरह के एक micropipettor टिप बॉक्स के रूप में, एक बड़ा आयताकार वस्तु का उपयोग करना, अच्छी तरह से खुलने पर parafilm छेदना और थाली के शेष पर एक मुहर बनाने के लिए कुओं पर Parafilm रगड़ें। अब कुओं को कवर parafilm का छिद्रित हलकों निकालें। थाली अब कसकर अच्छी तरह ओ को छोड़कर सभी क्षेत्रों में parafilm के साथ कवर किया जाना चाहिएpenings।
- 10 मिनट ऊष्मायन के अंत से पहले, फिल्टर पेपर तरल के सभी अवशोषित कर लेता है, यकीन है कि फिल्टर पेपर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए 3 एन NaOH के 200 μl जोड़ें।
- ठंड के लिए वैकल्पिक रूप से पहले, एक ताजा 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए मध्यम हस्तांतरण। पीबीएस के साथ एक बार धोने के बाद, 0.1 एन एचसीएल में शेष कोशिकाओं lyse और बीसीए परख द्वारा प्रोटीन सामग्री की गणना।
- ऊष्मायन के अंत में, तरल नाइट्रोजन में परख थाली स्नैप-फ्रीज। पूरी तरह से आगे बढ़ने से पहले जमे हुए है अच्छी तरह से प्रत्येक को सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहें।
- परख थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 70% परक्लोरिक एसिड के 100 μl जोड़ें। इसके तत्काल बाद फिल्टर पेपर प्लेट के साथ कवर। 2 घंटे के लिए आरटी पर 80 आरपीएम की कक्षीय गति से एक कक्षीय प्रकार के बरतन और चट्टान पर प्लेटें प्लेस।
- ऊष्मायन के बाद, नमूने प्रक्रिया:
- एक जगमगाहट में 4 मिलीलीटर तरल जगमगाहट तरल पदार्थ को फिल्टर पेपर चौकों हस्तांतरण, सीओ 2 अंश को मापने के लिएशीशी और उपाय 14 सी संकेत।
- , अम्ल घुलनशील सामग्री को मापने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए माध्यम के 400 μl हस्तांतरण करने के लिए। 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र। संक्षेप में 1 क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (वी / वी), और भंवर: 2 के 500 μl के परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला के 100 μl जोड़ें।
- फिर मिश्रण को पानी के 250 μl जोड़ें, और भंवर। 3,000 x जी पर 10 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र। स्थानांतरण एक जगमगाहट शीशी में 4 मिलीलीटर तरल जगमगाहट तरल पदार्थ के लिए ऊपरी चरण के 200 μl और 14 सी संकेत उपाय।
4. lipogenesis परख
- शाम से पहले परख शुरुआत करने के लिए, गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 2 बार धो लें। 100 एनएम इंसुलिन के साथ सीरम भुखमरी को मध्यम पर हेपाटोसाइट्स बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
नोट: भ्रूण गोजातीय सीरम एक चयापचय हार्मोन की अज्ञात एकाग्रता (जैसे इंसुलिन होता है क्योंकि, ग्लूकागन), सीरम इस परख पर हो सकता है कोई confounding प्रभाव को दूर करने के लिए कोशिकाओं को भूखा। प्रकोष्ठों> 24 घंटे के लिए सीरम भुखमरी मध्यम में सक्षम हैं। इंसुलिन lipogenesis प्रोत्साहित करने के लिए इस परख में प्रयोग किया जाता है। - 100 एनएम इंसुलिन, 10 माइक्रोन ठंड एसीटेट और 0.5 μCi 3 एच एसीटेट प्रति अच्छी तरह से साथ सीरम भुखमरी मध्यम: lipogenesis माध्यम बनाओ। Lipogenesis मध्यम पर कोशिकाओं को बदलें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। हित के किसी भी यौगिकों परीक्षण किया जाना शामिल करें।
- ऊष्मायन अवधि के बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2 बार धो लें। 0.1 एन एचसीएल के 120 μl में scraping द्वारा Lyse कोशिकाओं। रिजर्व 10 प्रोटीन परख के लिए μl (बीसीए परख द्वारा आकलन), और हस्तांतरण 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब 100 μl।
- 2 के 500 μl के अलावा द्वारा निकालें लिपिड: 1 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल (वी / वी)। भंवर संक्षिप्त और 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। पानी, भंवर के 250 μl जोड़ें और एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। नमूने अपकेंद्रित्र 3,000 XG, आरटी पर 10 मिनट। ध्यान सेएक जगमगाहट शीशी में 4 मिलीलीटर तरल जगमगाहट तरल पदार्थ को कम चरण हस्तांतरण और 3 एच गतिविधि को मापने।
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Representative Results
3 10 x 7 कुल कोशिकाओं - Hepatocyte विलगन आम तौर पर 1 में परिणाम। रात ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं (चित्रा 2) binucleated हो जाएगा, जिनमें से कई हेक्सागोनल दिखाई देगा। स्वस्थ कोशिकाओं कोशिका मृत्यु का संकेत कर रहे हैं, जो ग्रेनुलेशन या blebs, से रहित होना चाहिए।
सामान्य तौर पर, फैटी एसिड ऑक्सीकरण परख परीक्षण परिसर प्रति 3-4 प्रतिकृति में चलाया जाता है। सीओ 2 के नमूने लिए मायने रखता है अम्ल घुलनशील सामग्री से प्राप्त उन लोगों में से लगभग एक पांचवें कर रहे हैं। हम आम तौर पर (जो है, साइट्रिक एसिड चक्र के माध्यम से ऑक्सीकरण राशि है) पूरा ऑक्सीकरण का एक उपाय के रूप में अम्ल घुलनशील सामग्री के लिए सीओ 2 के अनुपात की गणना। ऐसे कार्बोनिल साइनाइड-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) के रूप में कोशिकीय श्वसन को बढ़ावा देने कि पदार्थ, टीसीए चक्र के माध्यम से अधिक ऑक्सीकरण का संकेत है, सीओ 2 की ओर इस अनुपात में बदलाव होगा। सांस की श्रृंखला के अवरोधकों पर पूरे ऑक्सीकरण कम होगा(चित्रा 3)। इस परख विमान का संचालन करते हैं, यह प्रक्रिया सेल विशिष्ट गतिविधि का उत्पादन होता है सत्यापित करने के लिए एक नहीं, सेल नियंत्रण शामिल करने के लिए सबसे अच्छा है।
Lipogenesis परख सबसे अधिक बार एक शून्य timepoint नियंत्रण (कटाई के तुरंत पहले सब्सट्रेट के साथ इलाज किया कोशिकाओं) की तुलना में है। परख ऊष्मायन के कम से कम चार घंटे के माध्यम से समय बनाम रैखिक होना चाहिए। ऐसे oligomycin के रूप में इस तरह के FCCP के रूप में, फैटी एसिड ऑक्सीकरण बढ़ाने, या एटीपी संश्लेषण कम यौगिकों जो, lipogenic गतिविधि (चित्रा 4) कम हो जाएगा।
चित्रा 1: 3.6 चरण में वर्णित के रूप में फिल्टर प्लेट तैयार करने के लिए फिल्टर प्लेट की तैयारी, एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली से कवर निकालें। अच्छी तरह से प्रत्येक के आधार पर फिल्टर पेपर के एक 2 सेमी x 2 सेमी टुकड़ा रखें। पैरा की एक 7 "एक्स 4" टुकड़ा के साथ पूरी थाली ओवरलेफिल्म, और कसकर कुओं के शीर्ष सील करने के लिए थाली रगड़ें। इस हटाया जाना चाहिए, जो अच्छी तरह से खुलने, पर parafilm का छिद्रित हलकों उत्पन्न होगा। कदम 3.9 में परक्लोरिक एसिड के अलावा के बाद, एक सील का उत्पादन करने के लिए परख थाली पर कसकर फिल्टर पेपर प्लेट रखें।
चित्रा 2: संस्कृति चरण में प्राथमिक Hepatocytes 16 घंटा कोलेजन लेपित 24 अच्छी तरह प्लेटें में चढ़ाना के बाद स्वस्थ और अस्वस्थ प्राथमिक माउस हेपाटोसाइट्स की छवियों इसके विपरीत। स्केल बार, 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्राथमिक द्वारा फैटी एसिड ऑक्सीकरण संस्कृति 14 (ए) के सीओ 2, (बी) एसिड घुलनशील पदार्थ, और (सी) वाहन, FCCP, या oligomycin के साथ incubated प्राथमिक हेपाटोसाइट्स से अम्ल घुलनशील सामग्री के लिए सीओ 2 के अनुपात को सी-Palmitate ऑक्सीकरण में माउस Hepatocytes। डेटा ± SEM मतलब हैं। * पी <0.05, एक पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा वाहन बनाम ** पी <0.01। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: lipogenesis संवर्धित में प्राथमिक माउस Hepatocytes (ए) 3 एच एसीटेट और वाहन, oligomycin, या FCCP की उपस्थिति में (बी) lipogenic गतिविधि के साथ इलाज प्राथमिक हेपाटोसाइट्स में समय बनाम Lipogenic गतिविधि। डेटा ± SEM मतलब हैं। *** पी <एक पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा 0,001 बनाम वाहन।
| तालिका एक | |||
| संस्कृति मीडिया | |||
| चढ़ाना मझौले | |||
| DMEM | 500 मिलीलीटर | ||
| एफबीएस | 10% | ||
| सोडियम पाइरूवेट | 2 मिमी | ||
| पेन / Strep | 2% | ||
| Dexamethasone | 1 माइक्रोन | ||
| इंसुलिन | 0.1 माइक्रोन | ||
| रखरखाव मझौले | |||
| DMEM | 500 मिलीलीटर | बीएसए भिन्न वी | 0.2% |
| सोडियम पाइरूवेट | 2 मिमी | ||
| पेन / Strep | 2% | ||
| Dexamethasone | 0.1 माइक्रोन | ||
| इंसुलिन | 1 एनएम | ||
| भुखमरी मझौले | |||
| DMEM | 500 मिलीलीटर | ||
| बीएसए भिन्न वी | 0.2% | ||
| सोडियम पाइरूवेट | 2 मिमी | ||
| पेन / Strep | 2% | ||
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Discussion
छिड़काव के लिए बलिदान से समय आदर्श छिड़काव और जिगर की collagenase पाचन के लिए कम से कम 3 मिनट होना चाहिए। छिड़काव मध्यम के साथ छिड़काव शुरू की है एक बार, जिगर तुरंत लाल पीला से करने के स्वरूप को बदल देना चाहिए। LDM साथ ऊष्मायन के लगभग 10 मिनट के बाद, जिगर में सूजन और गुलाबी दिखाई देंगे। छिड़काव के लिए अपर्याप्त है कि घटना में, जिगर इन परिवर्तनों का प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं, और यह आमतौर पर एक कम hepatocyte उपज में परिणाम होगा।
धोने के कदम के बाद, पृथक हेपाटोसाइट्स से पहले चढ़ाना के लिए बर्फ पर निलंबन में कई घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है। चढ़ाया जाने के बाद, सुसंस्कृत हेपाटोसाइट्स पालन और प्रसार के लिए बाहर कई घंटे की आवश्यकता होती है। चढ़ाना मध्यम में ऊष्मायन के 2 घंटे बाद, हेपाटोसाइट्स छोटे और गोल रहेगा। एक रात ऊष्मायन के बाद, हेपाटोसाइट्स binucleated हो जाएगा, जिनमें से कई एक अधिक विशेषता हेक्सागोनल उपस्थिति, पर ले जाएगा। तैयारी अस्वस्थ है, तो गELLs कोशिका मृत्यु का संकेत कई ग्रेनुलेशन और सामयिक blebbing, प्रदर्शन करेंगे। सबसे अच्छा संस्कृति व्यवहार्यता बनाए रखने के क्रम में, मीडिया हर 24 घंटा परिवर्तित किया जाना चाहिए और हवा को खोलने के लिए जोखिम को कम करने के लिए ध्यान रखा।
सोडियम Palmitate यह पूरी तरह से भंग कर देना चाहिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, हालांकि, आरटी पर पानी में अघुलनशील है। आर टी के संपर्क में इस प्रकार यह तेजी से काम करने के लिए जरूरी है, लिपिड तेजी से जमना करने के लिए प्रेरित करेगा। Palmitate पूर्व ऊष्मायन मध्यम में भंग कर दिया गया है, यह लिपिड की घुलनशीलता बनाए रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
जैसा कि ऊपर कहा, फैटी एसिड ऑक्सीकरण परख से सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, मध्यम तरल नाइट्रोजन में पूरी तरह से स्थिर होना चाहिए। इस वेल्स को परक्लोरिक एसिड के अलावा दौरान सीओ 2 के किसी भी भागने से बचाता है। इसके तत्काल बाद जमे हुए नमूने के परक्लोरिक एसिड के अलावा के बाद, परख थाली कसकर ग होना चाहिएफिल्टर पेपर प्लेट से overed, कुओं के बीच गैस हस्तांतरण के लिए प्लेटों के लिए पंक्ति में यकीन कर रही है। फिल्टर पेपर NaOH के एक अतिरिक्त के साथ भिगो जाता है, प्रतिक्रिया के stoichiometry 3 NaHCO के रूप में जारी सीओ 2 कब्जा करने में सक्षम है। इस प्रोटोकॉल के बाद प्रयोगों ठेठ प्रतिकृति होने% CV के साथ, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न किया ≤ अगर जरूरत पड़ी तो 10, फैटी एसिड ऑक्सीकरण परख या lipogenesis परख से सेल lysate से अम्ल घुलनशील सामग्री -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और कार्रवाई की जा रही करने में सक्षम हैं बाद में परिणामों पर किसी भी पर्याप्त प्रभाव के बिना। ऊपर वर्णित assays माउस जिगर से अलग प्राथमिक हेपाटोसाइट्स में लिपिड चयापचय आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और समय कुशल तंत्र के लिए अनुमति देते हैं। पूर्व vivo संस्कृति के उपयोग के माध्यम से, इन तरीकों में फैटी एसिड ऑक्सीकरण और lipogenesis पर कई शर्तों के प्रभाव के परीक्षण की अनुमति। इस प्रोटोकॉल इन प्रक्रियाओं पर आनुवंशिक परिवर्तन की भूमिका का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैsses, तथापि, हेपाटोसाइट्स के अलगाव के समय सीमित है और इस तरह इन विवो में कुछ ट्रांसजेनिक पशु मॉडलों की जांच के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है विश्लेषण करती है। कई hepatocyte तैयारियों का विश्लेषण आवश्यक है, तो वैकल्पिक कदम 3.7.1 में वर्णित है और सामान्य बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में प्रोटीन के स्तर को परख मूल्यों को सामान्य किया जा सकता है। हम कई तैयारियों में प्रदर्शन assays के लिए एक उपयुक्त नियंत्रण बनाम रिश्तेदार परिवर्तन के रूप में तुलना की जा सलाह देते हैं।
अंत में, हम अब संस्कृति अवधि का विकल्प खोज नहीं की है, हालांकि, हेपाटोसाइट्स संस्कृति में कई दिनों के बाद बराबर उपापचयी लक्षण दिखा सकता है। मामूली संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल लिपिड चयापचय पर यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने से पहले कई दिन के उपचार के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquot and store at -20 °C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Collagen | Life Technologies | A1048301 | |
| Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillin / Streptomycin | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulin | Sigma | I0516-5ML | |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumin (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| Tygon S3 Tubing | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Male Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" Catheter | SurFlo | SROX2419CA | |
| Perma-Hand Silk Suture | Ethicon | 683G | |
| Cell Strainer | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath | Fisher | 13-874-3 | |
| MasterFlex C/L Peristaltic Pump | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilize in autoclave |
| 5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilize in autoclave |
| 24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilize in autoclave |
| 60 ml Syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50 ml conical tubes | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| Serological pipets | |||
| 1,000, 200, 20 μl pipet and tips |
References
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al. Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).
- Angulo, P.
- Adams, L. A., et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).
- Feldstein, A. E., et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).
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- Parks, E. J., Hellerstein, M. K. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).
- Befroy, D. E., et al. Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy. Nature medicine. 20, 98-102 (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malaria journal. 6, 169 (2007).
