Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה ( doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.

Abstract

תת-אוכלוסיות חיידקים במחקרי שדה ומעבדה הוכחו להציג גבוהה ההטרוגניות בפרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים. קביעת המצב בזמן אמת של תא חיידקים חורג קטגוריות חיות או מתות, כחיידקים יכולים להתקיים במצב רדום, לפי חלוקת תאים ופעילות מטבולית מופחתות. בהתחשב בצורך באיתור וכימות של חיידקים, cytometry זרימה (FCM) עם בדיקות מולקולריות מספקת שיטה מהירה ומדויקת כדי לקבוע את הכדאיות אוכלוסייה כללית. באמצעות Sytox הירוק וSytox אורנג 'כבחוליות מודל Microcystis aeruginosa לזהות שלמות קרום, אנו מפתחים שיטה להעברה לאינדיקציה מהירה של תמותת תא בודדת. הבדיקות מולקולריות המשמשות בכתב עת זה תופנה לבדיקות חומצות גרעין ירוקות או כתומות כבהתאמה (אם כי יש מוצרים אחרים עם אורכי גל עירור ופליטה דומים שיש לי מצבים דומים כיצד תפעלn, אנו מתייחסים באופן ספציפי לקדמת הבמה ציינו בדיקות). פרוטוקולים באמצעות בדיקות מולקולריות להשתנות בין מינים, שונים בעיקר בזמני ריכוז ודגירה. בעקבות פרוטוקול זה יצא לM.aeruginosa הבדיקה חומצות גרעין הירוקה הייתה מותאמת בריכוזים של 0.5 מיקרומטר לאחר 30 דקות של דגירה והבדיקה הכתומה חומצות הגרעין במיקרומטר 1 לאחר 10 דקות. בשני ריכוזי הבדיקות פחות מאופטימלית האמור הוביל לתחת דיווח של תאים עם נזק קרום. לעומת זאת, 5 מיקרומטר ריכוזים וגבוהים בשתי הבדיקות הפגינו סוג של כתמים שאינם ספציפיים, לפיה תאים "חיים" המיוצרים על הקרינה יעד, שמוביל לייצוג יתר של מספרים סלולריים "שאינם בר-קיימא". הבקרות החיוביות (-נהרג חום) הניתנות ביומסה המתה הניתנת לבדיקה, אם כי ההתאמה של דור שליטה נשארת נושא לדיון. על ידי הוכחת רצף הגיוני של צעדים לייעול הבדיקות הירוקות וכתומות חומצות גרעין אנחנו דהmonstrate כיצד ליצור פרוטוקול שניתן להשתמש כדי לנתח מצב פיסיולוגי cyanobacterial ביעילות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התא הוא מערכת מורכבת, שמגיבה כל הזמן לסביבה על ידי שינוי פרמטרים פיסיולוגיים ולשנות את תפקודו. הדינמיקה של אוכלוסיות חיידקי אוכלוסיית isogenic הן בטבע והמעבדה מושפעות מההתפתחות של תת-אוכלוסיות, המתרחשת גם בתנאים סביבתיים קבועים יחסית 1 - 3. ההשתנות של קהילות חיידקים טבעיות מתעוררת בשל האופי משתנה מאוד של תנאים סביבתיים. תהליכים סטוכסטיים לפעמים אלה לאחר מכן לייצר תת-אוכלוסיות ששונות מאוד לממוצע האוכלוסייה. העדויות אחרונות גילו כי תת-אוכלוסיות הפיזיולוגיות אלה מגיבות באופן שונה לתנאי סביבה ויכולות לייצר תרכובות אות או מעכבים שלהשפיע באופן דרמטי ולהשפיע על 3,4 האוכלוסייה הכללית.

הקמת שיטה להגדיר ההטרוגניות באוכלוסייה היא מפתח להאו"םderstanding האקולוגיה של חיידקים בסביבות שונות וחיוני בעת בניית ידע של כחוליות מטרד, כגון Microcystis הרעיל, אשר משפיע במידה רבה על ביטחון מים אנושי. מין כגון Anabaena להציג ההטרוגניות מורפולוגיים בתגובה לתנודות סביבתיות, פיתוח תאים מיוחדים כמו heterocysts וakinetes 2. לעומת זאת, תאי Microcystis לא להציג ההטרוגניות מורפולוגיים ברורה בתגובה ללחץ. האפליה בין תאי קיימא ולא ברי-קיימא היא ההיבט החשוב ביותר של בידול פיסיולוגי ומאפשרת הבנה טובה יותר של דינמיקה של אוכלוסיות חיידקים. עם זאת, הבעיה הרעיונית של כדאיות חיידקים עצמו עדיין קשה ומאופיין 1,5,6 גרוע.

Cytometry זרימה (FCM) הוא שיטה אמינה ומהירה של ניתוח תאים בודדים. כדי להגביר את ההבנה של פיזיו תא הבודדמשעמם בFCM, בדיקות מולקולריות שימשו להבחין מספר חילוף החומרים והתהליכים ביוכימיים 7. זה הוביל לידע מוגבר של מינים ברמה תאית ואוכלוסייה בתורו עזר ניהול משאבי מים 8,9. עם זאת, אורגניזמים שונים במונחים של ספיגת בדיקה מולקולרית וזרימה בגלל הנקבוביות והמשאבות בקירות וקרומים תאיים, שהובילו למספר עיצוב בדיקה המולקולרי ויישום פרוטוקול 6,10,11. בדיקות מולקולריות זמינות למטרות מסחריות ומחקר לעתים קרובות מסופקות עם פרוטוקול גנרי אשר עשוי להיות רלוונטיות לסוג תאים שונה מאוד. אחד חייב להיות זהיר מאוד בהעברת פרוטוקולים שפותחו עבור סוג תא אחד עד 6 אחר, על כן משימה חיונית כדי לייעל את הבדיקות מולקולריות ביעילות לפני השימוש.

בדיקות חומצות גרעין הירוקות וכתומות להיקשר לשתי חומצות גרעין פעמיים התקועות ויחידות עם בסיס מינימאלי בחרivity ומשמש להעריך את שלמות קרום פלזמה של תאים. יש הבדיקה חומצות הגרעין הירוקה אות הקרינה תיוג התא השתפרה במידה ניכרת בהשוואה לבדיקות אחרות מולקולריות, כגון תרכובות המבוסס יודיד propidium 12, שיכול לשמש גם חיווי של כדאיות תא. "כדאיות התא" המונח כאן מניחה ששפלת DNA מתרחשת לאחר אובדן שלמות קרום פלזמה. בדיקות חומצות הגרעין הן צבעי cyanine סימטריים עם שלושה מטענים חיוביים ולא יכולות להיכנס לתאים וקרומים תחת ריכוזים מאופיינים, בשני 11,13 ופרוקריוטים 14,15 אורגניזמים האיקריוטים. הכריכה של בדיקה חומצת גרעין לחומצות גרעין יכולה לגרום לגידול של פי> 500 של פליטת הקרינה מאותות אנדוגני בתאים שיש להם שלמות הקרום בסכנה. למרות שבדיקות מולקולריות כגון הבדיקה חומצות גרעין הירוקה יכולות להיות אינדיקטור טוב של פיזיולוגיה של תא בודד, יש צורך לאo לייעל כל בדיקה עם אורגניזם המטרה המיועד, כפעמי דגירה שנעו בין 7 דק '- 30 דק' וטווחי ריכוז מ0.1 מיקרומטר - 0.5 מיקרומטר בניסויי Microcystis לבד 15-19.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לייעל את מבחני cytometric של ירוק ובדיקות החדשות יחסית כתומות חומצות הגרעין (שעד כה לא נבדקו על מיני cyanobacterial M.aeruginosa). מתודולוגיה המפותחת הבאה לאחר מכן ניתן להעביר למינים אחרים ומשמשת כפלטפורמה לייעול פרוטוקולים בבדיקות מולקולריות אחרות, ובכך להגדיל את ההבנה של חיידקים וההתנהגות האקולוגית שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנה של החללית המולקולרית וcytometer הזרימה

  1. לדלל פתרונות מניות של בדיקות חומצות גרעין, אשר מסופקות כפתרון 5 מ"מ בdimethylsulfoxide (DMSO) לaliquots של ריכוזים הנדרשים בultrapure המסונן H 2 O.
  2. אחסן את בדיקות חומצות גרעין בתנאים חשוכים בין -5 מעלות צלזיוס ו-- 25 o C עד שימוש.
  3. הפעל את cytometer הזרימה וחבילת תוכנת עומס (ראה טבלה של חומרים / ציוד למפרטי FCM).
  4. מניחים צינור ריק haemolysis (12 x 75 מ"מ) בבדיקת הזרקת מדגם (SIP), לחץ על סתימה ולאחר מכן שטיפה כדי להתחיל את תהליך ניקוי FCM.
    הערה: חלק שלבים לדוגמה עבור SIP יכולים להכיל מספר סוגים של צינורות כוללים צינורות microcentrifuge. נוזל diluent הבדיקה והנדן המולקולרי המשמש במנגנון FCM הוא מכיתה אנליטיים "סוג 1" מקור מסונן 0.22 מיקרומטר קרום.
  5. מָקוֹםצינור haemolysis טרי עם 2 מיליליטר של H המסונן ultrapure 2 O על SIP, להגדיר מגבלת זמן עבור 10 - 15 דקות ומהירות fluidic לצום (או קצב זרימה של> 66 μl / min).
  6. בחר תא נתונים חדש, לשים על סף רלוונטי לקרינה וערוצי פיזור אור כדי להפחית את רעש רקע ולחץ על 'הפעלה'.
  7. אם האירועים הכולל לשנייה הם לא מתחת ההמלצה של היצרנים, ולאחר מכן להפעיל מדגם 2 מיליליטר של תמיסת חיטוי למשך 2 דקות במהירות ולאחר מכן חזור על השלבים 1.4 & 1.5.
    הערה: אנא בדוק ההמלצות של יצרנים לFCM הזנק ניקוי פרוטוקולים, כפי שהם יכולים להשתנות בין דגמים. בדיקות לסף מסוים גם צריכה להיות בקו אחד עם מודל FCM כחלק ציוד מאפשר למשתמש להפעיל את רווחי מתחים לצינורות מכפיל (PMTs) שיפור או ירידת האות החשמלי שנרשם מהגלאים האופטיים. מודל FCM משמש בהתנסות זוment יש קבוע PMTs מתח ומשמש סף של 80,000 פיזור אור קדימה (FSC-H) להוציא חלקיקים קטנים יותר מאשר 2.0 מיקרומטר ורעש אלקטרוני.

2. הכנת תרבויות וספירת תאים ראשונית

  1. 98 מיליליטר החיטוי של 2 O ו -2 מיליליטר ultrapure המסונן H של תקשורת אצות (ריכוז x50) בכוס 250 מיליליטר במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלסיוס
  2. מmonoculture הראשוני של M.aeruginosa (PCC 7806) במקום גבוה מצב יציב צפיפות 2 מיליליטר של המדגם לתוך צינור מתחת SIP. משורש כל הקמת מושבה על ידי vortexing או sonication 20 ולאשר תאים מפוזרים באופן שווה באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: חשיפה מוגזמת לגלים קוליים יכולה להוביל לתמוגה תא ויש להשתמש בזהירות. מאז sonication יכול להתמוטט שלפוחית ​​גז (כפי שנמצא במינים כמו M.aeruginosa) פלטים כגון פיזור צד אור (SSC-H) עוצמה יכולה להיות יותר sensitive.
  3. בתוך תוכנת FCM, בחר עלילת היסטוגרמה כדי להקליט נתונים מפיזור אור קדימה (FSC-H) ולהגדיר את מפרטי עלילה על ידי לחיצה על "יומן" כדי להציג בקנה מידת יומן על הציר.
  4. בפלט נפרד, בחר היסטוגרמה אחרת (יומן ציר) כדי להקליט הקרינה טבעית כגון phycocyanin אבזר פיגמנט הפוטוסינתזה (FL4-H, 675 ± 12.5 ננומטר), שנמצא בM.aeruginosa.
  5. השתמש במקור אור שיכול לרגש phycocyanin וגלאי שלסנן את הפליטות מהקרינה וכתוצאה מכך.
    הערה: פיגמנט פוטוסינתזה כמו כלורופיל יכול להיות נרגש עם הלייזר הכחול ננומטר 488 הנפוץ, ואילו phycocyanin הוא נרגש מעל 600 ננומטר ויזוהה רק עם מקור אור אדום 21. בדוק עם יצרן הזרימה cytometers למקורות אור העירור ואת הספקטרום של גלאי פליטה, כאן שני ננומטר 488 וליזר 640 ננומטר שימש יחד עםמסנן אופטי ננומטר 675 ± 12.5.
  6. להקלטה של ​​ההגדרות בחרו הרזולוציה הגבוהה ביותר הקרובות ביותר לגודל הליבה של האורגניזם היעד (10 מיקרומטר) וקצב זרימה איטי יחסית (14 μl / min).
    הערה: לדגימות הרזולוציה הטובות ביותר צריכה להיות מנוהלת על פי מייצר המלצה של אירועים בשניה.
  7. נתוני רכישה לפני להשתמש סף לשער מתוך פיזור אור ו / או אותות הקרינה הנגרמות על ידי רעש רקע אלקטרוני או מדגם פסולת תא.
  8. בחר תא נתונים חדש, ליצור עלילת צפיפות עם FSC-H ופרמטרי SSC-H בקנה מידת יומן ולחץ על הפעלה.
  9. אם צפיפות המדגם מובילה לשיעור אירוע מוגזם, צעדים שניתן לנקוט דילול כדי להגדיל את הדיוק ודיוק.
  10. על המגרש הצפיפות להחיל שערי תוכנה מהיסטוגרמה הקודמת להוציא אותות פיזור ברמה נמוכים, המיוצרים על ידי רעש רקע או פסולת (FSC <320,000). לעומת שער הקרינה היחסית גבוהה יותראותות phycocyanin מהתאים ולכלול רק את האירועים הללו (FL4, 56,000 - 1,950,000).
  11. השתמש במספר התאים שנרשמו באזורים המגודר ולחלק אותו על ידי הנפח הכולל של מדגם שעבר דרך FCM, לעבוד מתוך תאים כמה לכל מיליליטר.
    הערה: מודל FCM משמש כאן יש מערכת משאבת peristaltic המיקרו מבוקרת המאפשרת נפח דגימה שייקבע. ציוד FCM אחר עשוי לדרוש השעיה חרוז מכוילת או חישוב הבדלי 2 משקל O / נפח H לאמת מוחלט נפח דגימה.
  12. מוסיף את הנפח הנדרש של תאים לתקשורת מוכנה הטרי כדי להתחיל מחזור צמיחה אצווה (250,000 תאים / מיליליטר) של M.aeruginosa.
    הערה: מין יהיה שונה בשיעורי צמיחה בהתאם לפרמטרים שלהם באתר הסביבה וזמינות חומרי מזון, ולכן מחזור אצווה יש מוקלט מראש כדי לקבוע שלבי מחזור חיים.

3. Optimization של ספיגה המולקולרית של תא Probe

  1. מחצית יבול של תרבות M.aeruginosa מוכנה בשלב 2 משלב מעריכי ולהשתמש כביקורת "חי".
    הערה: דוגמאות מדוללות מתרבות צפיפות גבוהה ישר לשלב מעריכי עשויות להשפיע על תוצאות אופטימיזציה באמצעות התחלפות תאים מתים, בהשוואה לזה של תרבויות מחוסנת משלב פיגור / אינדוקציה ראשונית.
  2. הכן את החצי השני כביקורת "מת" על ידי שימוש בשיטות כגון אתנול 70%, דגימות חימום ב 60 מעלות צלסיוס במשך שעה 1, paraformaldehyde או פורמלין 4% למשך 30 דקות 6,11,22. בדקו וריאציות במייקרו-סביבת הדגימות (למשל., PH).
    הערה:, הביקורת החיובית, נהרג-החום 'המתה' בM.aeruginosa היא מכובדת ממדגם "חי" דרך ירידתו באותות phycocyanin. גרימת תמותה בשיטות אחרות לא תגרום לאותה התפוקה וvary במינים.
  3. הגדר את הדגימות מעורבות באמצעות יחסים שונים של "חי" ודגימות 'מתות' (לדוגמא, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. משורש הקמת מושבה על ידי vortexing או sonication ולבדוק pH.
  5. בחר לייזר 488 ננומטר צד גלאים שיכולים להקליט הקרינה מירוקה (FL1, 530 ± 15 ננומטר) וכתום (fl2, 585 ± 20 ננומטר) בדיקות חומצות גרעין וליזר 640 ננומטר להקליט אותות phycocyanin דרך הגלאים שלו בהתאמה.
    הערה: כאשר מחויב ל- DNA, יש הבדיקה חומצות גרעין הירוקה גל עירור הקרינה משוער של 504 ננומטר מקסימום ופליטה של 523 ננומטר, תוך הבדיקה חומצות גרעין הכתומה יש גל עירור של 547 ננומטר מקסימום והפליטה של 570 ננומטר. לייזר מצב מוצק יון ארגון 488 ננומטר יכול להיות מועסק על מנת לרגש את שני הבדיקות מולקולריות, לעומת זאת, לייזר ירוק (עד 547 ננומטר) יפיק הקרינה כתומה גבוהה יותר.
  6. כנקודת מוצא, להציגבדיקה מולקולרית עם יצרנים מומלצים ריכוז לתרבות 'המתה' 'החי' 50% ו- 50% ודגירה בחושך.
  7. בחר תא נתונים חדש, למקם את המדגם תחת SIP עם ספים וגורמים שיפחיתו רעשי רקע (FSC-H 80,000).
  8. צור עלילת צפיפות עם FSC-H ופרמטרי SSC-H, ושלוש היסטוגרמות. היסטוגרמה אחד באמצעות ערוץ בהתאמה הבדיקה מולקולרית גלאים אופטיים (FL1 או 2), אחד כדי לזהות את פליטת phycocyanin (FL4-H) וכל FSC-H האחר, בקנה מידת יומן.
  9. דגירה הדגימות של M.aeruginosa עם בדיקות חומצות גרעין בחושך עד 60 דקות, הקלטה בתאי נתונים נפרדים, במספר נקודות זמן (1, 5, 10, 15, 30 ו -60 דקות).
    הערה: כאשר התאמת פרמטרים כגון בדיקת pH עם מייצר לתגובות פוטנציאליות מכימיקלים מסוימים (לחומצות גרעין נבדקו בוחן חיץ לא יכול להכיל פוספטים או רמות גבוהות של חד ערכי או הדיווהקטיונים השאילו, כמחייב עם DNA יופחת).
  10. החל שער תוכנה לכלול את ההיסטוגרמה FSC-H (320,000 - 1,500,000) רק ליעד אורגניזמים גודל תא, להיסטוגרמה ערוץ בדיקה הקרינה בהתאמה.
    הערה: ריכוזי שימוש בפרוטוקול זה היו 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ו -100 מיקרומטר, אשר ניתן לשנות על ידי שני להגדיל או להקטין את עוצמת הקול של מדגם M.aeruginosa או פתרון מניות ראשוני של בדיקות גרעין.
  11. בערוץ הבדיקה הקרינה, יחול עוד שער תוכנה כולל לפסגה הגבוהה ביותר בהיסטוגרמה (FL1-H הירוק, 240,000 - 1,650,000, הכתום fl2-H, 30,000 - 165,000), ולאחר מכן השער שקרינת בדיקה חיובית לעלילת הצפיפות.
  12. הפעלת הצעדים 3.1-3.11 עם וכל דגימות 100% "חיים", 100% 'מתות' מעורבות התרבות, התאמת הריכוזים המולקולריים הבדיקה (למשל x 0.1 x 10 ל) ו / או טמפרטורה ורמות ה- pH במידת צורך.
  13. <li> להשוות את מספר אותות הקרינה בדיקה המולקולרית חיוביים לצפיפות המקורית התא של תאים "מתים" (נלקחה ממחצית סך FSC-H או 100% תרבות 'מת') כדי למצוא את האחוז הכולל של תאים מוכתמים בחומצות הגרעין בדיקות.
  14. האם זה עבור כל תקופה בכל ריכוז כדי למצוא את הפרוטוקול האופטימלי לאחוז הגבוה ביותר של ספיגת בדיקה גרעין תא מבלי לייצר כתמים שאינם ספציפיים (להשתמש באמצעים בדרך אחת-ANOVA או ניתוח בכיוון אחד קרוסקל-ווליס של שונות, אם הנתונים אינם פרמטרי).

4. מולקולרי בדיקה הקרינה אפליה

  1. לבדיקה של הפרעות הקרינה / חפיפה ממכתים תא פנימי או שאינו ספציפי בחר את הנתונים "חיים" 50% ו -50% 'המתים' מעורבות התרבות ולקחת את כל השערים.
  2. החל שער תוכנה לכלול את ההיסטוגרמה FSC-H (320,000 - 1,500,000) רק ליעד אורגניזמים גודל תא, לphycocyaninהיסטוגרמה ערוץ.
  3. שער הפסגה הגבוהה ביותר phycocyanin ותווית כ" חי ", עם התוספת של השיא הנמוך ביותר שכותרתו" מת ".
  4. לבצע צעד שער נוסף לערוץ היסטוגרמה בהתאמה מולקולרי הקרינה בדיקה, באמצעות אחד בכל פעם, אותות phycocyanin 'המת' 'חי' ולאחר מכן (FL4), הקלטת שני אורכי גל ממוצעים.
    הערה: מצב גרימת תמותה בניסוי זה נעשתה על ידי טיפול בחום, שעל-פי פרוטוקול זה ברור יורד אותות phycocyanin. שיטות אחרות של אוכלוסיות ייצור של תאים 'מתים' עשויות להניב תפוקות שונות בריצות רכשו.
  5. יחס אורכי הגל הממוצע של הקרינה החיובית המולקולרית בדיקה ("המתה") והאות הפנימית / שאינו ספציפית ("החי") כדי לקבוע רגישות פרוטוקול.
    הערה: כדי לשפר את אפליית הקרינה של popul 'המת' 'חי' וations, להגדיל את מקור פחמן לספיגת כתם פעיל בתאים מזינים מדולדל או חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כדי לשפר את דופן תא חדירות ואותות הקרינה כתוצאה 6. פיצוי מוגבל בחלק מדגמי FCM לחפיפה ספקטרלית יכול להתבצע על ידי תיקון pairwise-מניפולציות משתמש במהלך רכישת מדגם (שינויי מתח PMT) או מתוכנה מיוחדת שלאחר אנליטיות.
  6. בחר את הפרוטוקול מותאם בי את הסכום הגבוה ביותר של תאים 'מתים' כבר מוכתם ללא הכתמת ההתרחשות שאינה ספציפית. אם יש לי מספר מבחן תוצאות דומות קיבלו את הפרוטוקול עם זמן הריכוז ודגירה הנמוך ביותר, יחד עם אפליית אות הקרינה טובה. מעקב מייצר הוראות להליך כיבוי cytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיזור אור קדימה (FSC) ותפוקות צד פיזור אור (SSC) מתרבות אצווה M.aeruginosa בשלב מעריכי מספק מידע על גודל תא (קוטר) וגרעיניות פנימית בהתאמה (איור 1 א). FSC יכול להפלות תאים כי הם גדולים מדי ו / או קטנים להיות M.aeruginosa. אפליה או gating ניתן לעשות זאת על ידי נתונים זיקוק בין נקודות מסוימות של תפוקת FSC (איור 1 ג). Phycocyanin, חוקה עיקרית של מנגנון הפוטוסינתזה M.aeruginosa מייצרת אות חזקה כאשר נחקר על ידי מקור אור אדום (לשעבר: 640;: 675 ± 12.5 ננומטר), אשר יכול לשמש לאוכלוסיות שער נוספות, דומה לזו שנעשתה בFSC gating אבל עם הקרינה (1D איור). מאותות FSC וקרינה, יכולים להיות מגודר מהתפוקה המקורית (איור 1 א) לנתונים ספציפיים נתונים על M.aeruginosa לFספירת INAL תא (איור 1).

Autofluorescence לכל תא באוכלוסיות שונה כחוליות כפונקציה של מצב פיסיולוגי. הנה תאים נקצרו מתרבות שלב מעריכי מראה הקרינה כה אדומה גבוהה יחסית לאוכלוסיית שליטה "חי" והשליטה 'המתה' נחשפה לחום C 60 o עבור שעה 1. כאשר 'לחיות' פקדי פיגמנט נמוכים פיגמנט ו'מתים 'גבוהים יותר מעורבים משמרת הירידה בautofluorescence ברורה (האיורים 2 א & B). הקרינה 'המתה' התא ופרמטרי FSC יכולים לשמש כדי להפלות את התאים הכולל שלקחו את הבדיקה המולקולרית. בקרום נפגע או תאים "מתים" בדיקות חומצות הגרעין תפיק אות נוספת או ב; ערוץ FL1 (530 ± 15 ננומטר) לבדיקה הירוקה חומצות גרעין או ערוץ fl2 (585 ± 20 ננומטר) לAC הגרעין הכתוםבדיקה מזהה (איורים 3 א & B), בהשוואה ל'לחיות 'אות יליד הקרינה. אישור של שני בדיקות חומצות הגרעין בתאים עם ממברנות נזק ניתן לראות דרך מיקרוסקופ epifluorescence (איורים 4 א & D).

אחוז הכולל של תאים שהוכתמו על ידי הבדיקה חומצות גרעין הירוקה הושג מדגימות מעורבות, שהיו טרום מגודר לכלול M.aeruginosa רק בגודל תאים מהיסטוגרמה FSC-H (320,000 - 1,500,000). ב50:50 "חי: מת 'מדגם, תאי הקרינה ירוקים מגודר מהפסגה הגבוהה ביותר ב( ננומטר 530 ± 15) FL1 היסטוגרמה הושווה לצפיפות מקורית באוכלוסיית התא' המתה '(או על ידי וחצה FSC- הכולל H או ריצת ספירת תאים נפרדת רק בדגימות של 100% 'מתות' תא). מעל 100% היה מצביע על כך שמכתים אינם ספציפי מתרחשת. האחוז הממוצע של תאים שנלקח nucle הירוקIC בדיקה חומצה נעה בין; 15 ± 0.3% ב0.05 מיקרומטר לאחר 1 דקות כדי 177.1 ± 5.1% ב100 מיקרומטר במהלך 10 דקות של דגירה (טבלת 1). ריכוזים מעל 1 מיקרומטר (לא כולל) הראו כתמים שאינם ספציפיים (כלומר., תאים "חיים" שהתחילו לקחת את הבדיקה המולקולרית). דו סטרי ANOVA בין הריכוזים שלא להפגין צביעה שאינה ספציפית (0.05-1 מיקרומטר) והראה הבדל משמעותי הכולל באינטראקציה בין הריכוז של חללית ירוקה חומצות גרעין וזמן דגירה בM.aeruginosa, F (12 , 40) = 6.48, p <0.001. הייתה השפעה עיקרי על פני הריכוזים של חללית הירוקה חומצות גרעין משמשת F (3, 40) = 836.92, p <0.001 וזמני דגירה F (4,40) = 347.98, p <0.001. מבחן פוסט-הוק Tukey הצביע הבדל משמעותי בין כל הריכוזים מלבד 0.5 ו1 מיקרומטר (p <0.001) והבדל משמעותי בין כל זמני הדגירה של 1-60 דקות (p <0.001). עם זאת, מבחן Tukey בדיעבד מדרך אחת ANOVA חשף את הספיגה הממוצעת של בדיקה חומצת גרעין ירוקה אינו שונה בין 30 ל 60 דקות ל0.05 מיקרומטר (p> 0.05) ו1 מיקרומטר (p> 0.05) (איור 5 א). היחס הממוצע של אותות "חיים" ו'מתים 'ביחס הקרינה בFL1 לאפליה של אוכלוסיות (נמדדה באמצעות FL4) נע בבדיקת חומצות גרעין הירוקה מהגבוהה ביותר ב0.1 מיקרומטר לאחר 60 דקות של 714 ± 14.8 (RFU) ל הנמוך ביותר של 0.8 ± 0.0 (RFU) ב 100 מיקרומטר לאחר 30 דקות (טבלה 2). השוואת היחסים של יחידות הקרינה היחסית (RFU) לאפליית עוצמה בFL1 "החי" ו'מת 'מסמנת דרך ANOVA שני דוחות הבדל משמעותי הכולל באינטראקציה בין ריכוזים ובזמני דגירה F p <0.001 עם חללית חומצות גרעין הירוקה. היה גם הבדל משמעותי בהשפעה העיקרית על פני כל הריכוזים F (7,80) = 475.41, p <0.001 ודגירה הפעמים F (4,80) = 78.28, p <0.001. יחסי האפליה של אותות הקרינה בין והחום "חיים" הרגו תאים "מתים" גדלו עם זמן בין הריכוזים של 0.05 מיקרומטר ומיקרומטר 1 אבל ירדו בין 5 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר (איור 5).

אחוז התאים שהיו מוכתמים בבדיקת חומצות גרעין הכתומה ראה אחוז נמוך ממוצע של 4 ± 0.3%, בריכוז של 0.05 מיקרומטר לאחר 1 דקות, עולה 166 ± 3.5% ב100 מיקרומטר לאחר 10 דקות של דגירה (טבלה 3). שוב ריכוזים מעל 1 מיקרומטר הציג גם מכתים הלא ספציפית של תאי חיים. דו סטרי ANOVA between הריכוזים שלא הראה צביעה שאינה ספציפית (0.05-1 מיקרומטר) דיווחו הבדל משמעותי הכולל באינטראקציה בין כל הריכוזים של חללית חומצות גרעין הכתומה וזמני דגירה בM.aeruginosa, F (12, 40) = 133.55, p <0.001. הייתה השפעה העיקרית משמעותית מבחינה סטטיסטית על פני הריכוזים F (3, 40) = 6,919.67, p <0.001 וזמני דגירה F (3, 40) = 1,161.45, p <0.001. עם זאת בדיקה בדיעבד Tukey דרך דרך ANOVA אחת על רק 1 מיקרומטר הצביעה על כך שפעמים הדגירה בין 10, 30 ו -60 דקות לא היה הבדל סטטיסטי בספיגה של בדיקה הכתומה חומצות גרעין (את כל> 0.05 p) (איור 6 א). אפליית אות הקרינה בין אוכלוסיות "חיות" ו'מתות 'מוכתם בfl2 נעה בבדיקת חומצות גרעין כתומה מהנמוכה ביותר של 0.3 ± 0.0 (RFU) לאחר 60 דקות ב -50 מיקרומטר ו -30 מ'לגבוה ביותר של 158.3 ± 0.4 (RFU) 100 מיקרומטר לאחר 60 דקות בריכוז של 0.1 מיקרומטר (לוח 4). שתי הדרך ANOVA דיווח המובהקות ביחסי הגומלין בין ריכוזים וזמן הדגירה F (28, 80) = 28.12, p <0.001. ההשפעות העיקריות של F הריכוז (7, 80) = 607.9, p <0.001 וזמני דגירה F (4, 80) = 31.24, p <0.001 נמצאו גם להיות שונה באופן מהותי את כל. אפליה בין הקרינה האותות מהתאים 'מתים' 'חיים' וחום נהרג בfl2 גדלה עם זמן בין הריכוזים של 0.05 מיקרומטר ו0.5 מיקרומטר אך ירד בין 1 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר (איור 6). לכן הריכוז האופטימלי לבדיקת חומצת גרעין הירוקה הוא 0.5 מיקרומטר עם זמן דגירה של 30 דקות ולבדיקת חומצת גרעין הכתומה הריכוז האופטימלי incu 1 מיקרומטר עצורה במשך 10 דקות.

איור 1
איור 1. FCM יציאות של M.aeruginosa באמצעות FSC, SSC ורחוק אדום הקרינה (675 ± 12.5 ננומטר). FSC () וSSC של M.aeruginosa PCC 7806. (ב) אותו הפלט כאיור 1A עם FSC המגודר ו הרבה הקרינה אדומה (לשעבר: 640;: 675 ± 12.5 ננומטר). FSC (C) המייצג את הגדלים של התא. החץ האדום מציין בשורה האזור מגודר שכדי להפחית את רעש רקע או חלקיקים בגודל אחרים. אותות (ד) גבוהים phycocyanin מופקים מM.aeruginosa בתרבות אצווה שלב מעריכי עם אדום החציים מגודר אזורים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

FO: לשמור-together.within עמודים = "1"> איור 2
איור Shift 2. Phycocyanin האיתותים בM.aeruginosa כאשר טיפול בחום. השינוי של autofluorescence M.aeruginosa בתאים "חיים" ו'מתים 'המשמשים לאימות ספיגת בדיקה חומצות גרעין. (א) אותות רחוק אדומים עוברים מפיגמנט "חי" אוכלוסייה (ירוק) גבוהה יותר לאוכלוסיית פיגמנט נמוכה "מת" (אדום). FSC (B) ותפוקות הרבה הקרינה אדומה בשילוב עם שינוי של כמעט שני סדרי הגודל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור Shift 3. אורנג הקרינה M.aeruginosa מUnstaine 'בשידור חי'ד לתאים "מתים" ויטראז. ובקרות M.aeruginosa 'חיות' 'מתות' מעורבות מודגרות עם בדיקה חומצות גרעין כתומה בריכוז של 1.0 מיקרומטר למשך 30 דקות. () Fl2 (585 ± 20 ננומטר) ערוץ מדווח משמרת עלתה מ אוכלוסייה "חי" בלא כתם (ירוקה) לאוכלוסייה "מת" מוכתמת (כתום) באמצעות שני סדרי הגודל. אוכלוסייה (ב) 'המתה' מוכתמת (כתום) שירד הרבה אותות אדומים, אך עלו אותות fl2 מאוכלוסייה "חי" (ירוקה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. epifluorescence מיקרוסקופית של M.aeruginosa עם בדיקות מולקולריות. מיקרופוןroscope תמונות מM.aeruginosa 50:50 בשידור חי: אוכלוסייה המתה מודגרות עם בדיקות חומצות גרעין, את כל התמונות x1,000 הגדלה. תמונת epifluorescence של בדיקה חומצת גרעין ירוקה נלקחה על ידי תאים "מתים" (). תאים "חיים" מופיעים אדומים בשל autofluorescence של כלורופיל. צפה במיקרוסקופ האור של איור 4 א מראה תאים "חיים" ירוקים פיגמנט ותאי פיגמנט פחותים 'מתים', עם נזק קרום (B). (ג) בשידור חי: אוכלוסיית M.aeruginosa המתה 50:50 מעורבת. דגירה בדיקה חומצות גרעין אורנג 'מאיור 4C (ד'), עם תאים "מתים" חושפים צבע כתום באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescence. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 אחוז איור 5. בתאים מדביקים לו תווית עם גרין חומצות גרעין בדיקה והיחס של "חי" לאותות FL1 'המתה'. ממוצע אחוז תאי M.aeruginosa המוכתם בבדיקת חומצות גרעין הירוקה בזמני ריכוז ודגירה שונים. () 0.1 מיקרומטר לא להכתים מספיק תאים, מכתים הלא ספציפי 5 תכנית מיקרומטר וריכוזים של 0.5 מיקרומטר ו1 מיקרומטר מוכתם כמעט 100% מהאוכלוסייה, מראה פעמים דגירה אופטימליות לאחר 30 דקות (א). (ב) 'חיים: מת' יחסים של אותות FL1 משלב צמיחה המעריכית ודגימות טיפול בחום. ריכוזים של 0.5 מיקרומטר ו1 מיקרומטר להראות אפליה טובה של אותות FL1 גדלו עם זמן דגירה (יחסי RFU שני סדרי גודל). ריכוזים של 10 מיקרומטר ומעלה (לא מיוצג על גרף) מראים אפליית עניי אות הקרינה וחופפת של "חי"אוכלוסיות 'מתות' ד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
אחוז איור 6. מדביקים לו תווית של תאים עם אורנג חומצות גרעין בדיקה והיחס של "חי" לאותות 'המת'. תוצאות משינויי ריכוז וזמן דגירה באוכלוסיות של M.aeruginosa. () ממוצע אחוז התאים שנרשמו אות כתומה הקרינה בfl2 עם ריכוזים; 0.1 מיקרומטר ו0.5 מיקרומטר לא מכתימים מספיק תאים, 5 תאי חיים מכתים מיקרומטר (כתמים שאינם ספציפיים), יחד עם הריכוז האופטימלי של 1 מיקרומטר לאחר 10 דקות (א). הבדיקה (ב ') הכתומה חומצות גרעין "חי: מתים' יחסים בfl2 להראות אפליה טובה ולא מעל לחיכהשל אותות הקרינה בריכוזים של 1 מיקרומטר או פחות ואותות עניים חופפים fl2 (יחס סדר נמוך יותר מגודל אחד) בריכוזים מעל 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קונצרט כלשהו. זמן דגירה (דקות)
(מיקרומטר) 1 5 10 30 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 1.5 44.1 1.8 54.7 1.6 70.5 0.8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0.8 98.8 0.1
1 58.5 1.6 77.4 0.7 88.4 0.4 98.0 0.1 99.2 0.1
5 91.4 0.9 98.7 0.5 99.3 0.7 102.2 1.3 106.3 0.8
10 96.1 0.5 97.7 0.1 97.9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99.5 2.3 112.7 3.8 148.7 2.4 153.9 13.0
100 165.8 3.1 174.4 5.7 177.1 5.1 161.5 2.5 159.7 6.6

טבלת 1. אחוז הספיגה של חומצות גרעין הירוק בדיקה בתאים. נתוני לוח מראה מניסוי אופטימיזציה באמצעות הבדיקה הירוקה חומצות גרעין ושל 50% מדגם אוכלוסייה (שטופלה בחום) "חי" ו -50% "מת". האחוזים הממוצעים של תאים שנרשמוהקרינה בדיקה חומצות גרעין ירוקה (FL1) חושבה על המספר הכולל של תאים "מתים" המתקבלים מספירת FSC-H. ערכים מעל 100% מכתים הלא ספציפי תכנית (SE קו תחתון).

קונצרט כלשהו. זמן דגירה (דקות)
(מיקרומטר) 1 5 10 30 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237.2 14.9 -385.5 15.0 481.9 17.7
0.1 178.3 18.1 343.0 19.5 437.0 20.6 619.1 12.1 714.1 14.8
0.5 202.5 5.9 308.3 13.1 365.8 33.5 426.8 67.2 480.4 73.2
1 205.8 12.1 225.9 13.7 237.3 15.6 241.5 5.8 263.1 8.1
5 69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0.8 0.1 0.8 0.1

יחס טבלה 2. של אותות הקרינה ירוקים בתאים המוכתמים M.aeruginosa 'המתה' 'בשידור חי' ו. אפליית FL1 אות בין התאים מוכתמים עם החללית הירוקה חומצות גרעין והקלטות פנימיות שאינם ספציפיות. המדגם הכיל 50% "חי" ו -50% "מת" (טיפול בחום) M.aeruginosaשל אותה האוכלוסייה שנמדדה על כל הפעמים הריכוז ודגירה (SE קו תחתון).

קונצרט כלשהו. זמן דגירה (דקות)
(מיקרומטר) 1 5 10 30 60
0.05 4.0 0.3 14.9 0.2 23.5 0.8 39.1 2.4 37.6 1.5
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0.8 94.8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
5 91.4 1.5 93.5 1.8 102.9 5.4 118.9 0.1 124.8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132.9 6.0 148.9 4.8 132.8 5.1
50 107.5 3.7 130.6 16.6 145.2 0.2 135.4 16.2 114.6 6.6
100 97.1 0.1 130.7 7.8 166.1 3.5 144.7 6.8 115.1 6.2

טבלת 3. אחוז הספיגה של אורנג חומצות גרעין בדיקה בתאים. טבלה עם נתונים אופטימיזציה באמצעות הבדיקה הכתומה חומצות גרעין ומדגם "חי" 50% ו -50% "מת" (טיפול בחום) אוכלוסייה. האחוז הממוצע של תאים שנרשמו הקרינה בדיקה חומצות גרעין כתומה (fl2) חושבו על המספר הכולל של תאים "מתים" מספירת FSC-H (SE קו תחתון).

קונצרט כלשהו. זמן דגירה (דקות)
(מיקרומטר) 1 5 10 30 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80.4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76.1 2.4 100.9 3.1 146.2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124.9 2.4 137.3 1.1 138.7 </ Td> 2.1 132.8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 6.5
5 10.4 0.6 7.5 0.1 5.0 1.0 2.7 0.5 1.5 0.1
10 7.0 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 1.6 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 1.6 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0.7 0.1 0.3 0.0 0.5 0.2

לוח 4. יחס של אורנג חומצות גרעין בתאים המוכתם M.aeruginosa 'המתה' 'בשידור חי' ו. אפליית fl2 אות בין התאים מוכתמים מהבדיקה הכתומה חומצות גרעין (fl2) והקלטות פנימיות שאינם ספציפיות. המדגם כלול "חי" 50% ו -50% "מת" (טיפול בחום) M.aeruginosa של אותה האוכלוסייה שנמדדה על כל הפעמים הריכוז ודגירה (SE קו תחתון).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המספרים מוגברים של פרסומים באמצעות בדיקות מולקולריות מציין שניתן להשיג נתונים אמינות ואינפורמטיבי 5,6,8 - 15,19,22,23. כמו של עוד אין כתם מושלם לכדאיויות תא שיכול להיות יעיל בכל המינים באותה עת ריכוז ודגירת 6,10. אפילו אותו הסוג של בדיקה עם פליטת הקרינה שינה מציג צורך בהקמה זמן ריכוז ודגירה הנכון (לוחות 1 ו -3). כפי שניתן לראות בעת השימוש בפרוטוקול זה, ריכוז ודגירת הזמן האופטימלי לבדיקת חומצת גרעין כתומה הוא 10 דקות במיקרומטר 1, ואילו הבדיקה חומצות גרעין הירוקה הייתה רק צריכה חצי הריכוז אבל לוקח שלוש פעמים (איורים 5 ו -6) עוד. שני מונומרים cyanine אלה תא-impermeant עם ריכוזים מעל 1.0 מיקרומטר התחילו לייצר חפיפה בפליטת ספקטרום עם תאים שאינם קרום נפצע. חפיפה זו של סיgnals מספק ראיות לכך שמכתים אינם ספציפי מתרחש בו תאים "חיים" לוקחים את הבדיקה המולקולרית. וכתוצאה מכך על הקרינה מהכתמה אינה ספציפית שנוצרה חיובי שגוי, והדגישה את הצורך בפיתוח פרוטוקול שיוקם בזהירות לכל בדיקה מולקולרית ואורגניזם היעד. השלבים הקריטיים ביותר באופטימיזציה של בדיקה מולקולרית יהיו: 1) להבין כיצד הבדיקה המולקולרית אינטראקציה עם מכשיר FCM; 2) אימוץ חיות מתאימות ובקרות מתות; 3) פיתוח ידע של gating פרמטרים מתפוקות FCM ו- 4) שינוי הפרוטוקול באמצעות הבנה של סביבות באתר.

מקור האור, מסננים אופטיים, היכולת לשנות מתח PMT וגלאים בתוך הזרימה cytometers משתנים מיצרן ליצרן, כך מודעות למה עירור גל מהליזר ובי ספקטרום הפליטה טמון ביחס לערוצי הקרינה הן קריטיות. עם רכישות של נתונים,ניתן להטיל ספי רזולוציה הגדלת שאחרת יאבד לאולי רעשי רקע, פסולת או אגרגטים תא מתים. בדיקות מולקולריות עשויות להציע תובנות הכדאיות של מינים ללא טיפוח, באמצעות פרמטרים בודדים כגון, פוטנציאל הממברנה, תוכן DNA ופעילות אנזים. עם זאת, בתוך דגימות סביבתיות יכולים להיות אורגניזמים רבים של גודל תא דומה וקרינה. בנוסף בתוך תרבויות uniagal, אוכלוסיות של תאים באופן בלתי נמנעות יש מידה מסוימת של מדינות פיסיולוגיות 3, אשר עשוי להשפיע ספיגת בדיקה מולקולרית. אחד היתרונות העיקריים של FCM הוא היכולת להבחין ולאפיין מדינות פיסיולוגיות ברמת התאים הבודד בזמן אמת, שהוא חיוני כאשר לומד כדאיות מיקרואורגניזמים באתר, כפי שהם לעתים קרובות נתון לתנאים מהירים ודינמיים. למרות השימוש התדיר, מושג כדאיות תא עדיין קשה להגדיר. בדרך כלל להחיל תרבות תאים,כדאיות היא מאוד הבקיע בגישה מבוססת צמיחה. הנחה תיאורטית זה יכול להספיק, כתנאים מסוימים לא יתאימו לתאים בודדים להתרבות אבל הם עדיין עשויים להיות נסבלים. תאים במצב פיסיולוגי nonproliferating שנכנסו קפאון או G (0) שלב מחזור תא מאי 27 לא אינטראקציה עם בדיקה מולקולרית נותנת שליליים כוזבת במחזור DNA או חילוף חומרים בדיקות מבוססות.

שימוש בתאי מעבדה גדלה או מבודדים טרי כדי לייעל בדיקות מולקולריות יסייע הזיקוק של הנתונים המשמשים במחקרים אקולוגיים. תאים המשמשים באופטימיזציה מתרבויות אצווה נלקחים בדרך כלל בשלבים נייחים מעריכי או בתחילה והניחו לי הכדאיות הגבוהה ביותר. עם זאת, יש לקחת בזהירות בעת השימוש בצפיפויות גבוהות תא, אלה בשלב מאוחר נייח או חיידקים מייצרים מטריצות תאית. בפרוטוקול זה השליטה לאוכלוסייה המתה של תאים נחשפו לחום C 60 o עבור שעה 1,עם אישור של נזק קרום והשפלה פיגמנט ראה דרך מיקרוסקופ (איור 4) ותפוקות הקרינה FCM (איורים 2 ו -3). מדמה את סיבות מות תא טבעי קשה מאוד כ; בליעה על ידי אוכלים, תמוגה ויראלי, מוות של תאים מתוכנת או את האפשרות של החלוקה סימטרית 24 הן לא תמיד אפשרית או שנצפה בתנאי מעבדה. מצבים ניסיוניים של מוסר לעתים קרובות נחקרו כפי שהם לא יכולים להיות שווי ערך ללחצים הנגרמים מהסביבה (למשל, הרג חום) וייתכן שיש תגובה הטרוגנית, שבו אנשים מסוימים נהרגים ותאים אחרים לא מראים השפלה תא נצפית או מוות 3 , 25. כדי להימנע מפרדוקס כזה ההגדרה המבצעית שבו הניסויים נמדדו חייבים להיות ברור שהוקמה כדי שלא לגרום לבלבול 6,23, הקלת נורמליזציה בין מחקרים.

שיטות חלופיות שונות havדואר הועסק לכדאיויות תא ניתוח בתרבויות בשיתוף עם בדיקות מולקולריות. מיקרוסקופיה epifluorescence היא טכניקה מסורתית המשמשת, למרות photobleaching או ההקדמה של אותות artefact מהתאים סמוכים עשויה לתת מתחת או מעל אומדן אוכלוסיות מצב פיסיולוגי אם לא נרשם מספיק מהר. זה עושה אופטימיזציה באמצעות הדמיה קשה מאוד, עם דיוק פוטנציאלי נמוך. הערכה הגנומי של כדאיות סלולרית באמצעות שתי שיטות הגברה DNA ו- RNA כגון; תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), להפוך טרנסקריפטאז (RT-PCR) והגברה מבוססת רצף חומצות גרעין (NASBA) יש גם נעשה שימוש. עם זאת, הערכה הגנומי משמשת רק כשיטת עקיפה של אימות כדאיות כהתמדה של חומצות גרעין תלויה במידה רבה בתנאים סביבתיים, עם המתאם של כדאיות תא בפועל עלול להיות השונים מאוד 28. באמצעות שילוב של פיזור ו / או הקרינה אור בתמונות טבעיותgating פיגמנטים ynthetic (איור 1) של אוכלוסיות יכולה: הרזולוציה גידול של נתונים, לזהות תגובות אוכלוסייה נדירות ולהפחית תוצאות חיוביות שגויות. עומד FCM יחד בדיקות מולקולריות מ- הטכניקות ציינו הקודמות בבדיקות פיסיולוגיות תא בודד למהירות, הדיוק וההקלטה של ​​מספר פרמטרים שלה.

FCM הוא כלי אנליטי רב עוצמה במיקרוביולוגיה הימית ובתוספת של בדיקות מולקולריות יש פוטנציאל רחב במספר תחומים ביניהם, תא בודד וניתוח קהילה למגזרים תעשייתיים (למשל., ניטור אספקה ​​מי שתייה). התקדמות עתידית יכלה לראות FCM לשלב הקרינה הכלאה באתר (דגים), שיכול לזהות ולמקם רצפים גנטיים ספציפיים בתאים בודדים בתוך דגימות הטרוגניות צפופות. הפיתוח של FCM וניידות בדיקה מולקולרית להקלטות באתר יכול לספק נתונים חיוניים על מקורות מים ליישם מוקדם שלtrategies לניהול משאבים. בעקבות פרוטוקול אופטימיזציה פיתח כאן, FCM ובדיקות מולקולריות עלולים לשחק תפקיד קריטי במתן נתונים יקרי ערך על פיזיולוגיה של חיידקים בסביבות מימיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר דוקטורנט דייב הרטנל ואוניברסיטת בורנמות לתמיכה ומימון למחקר ומתקנים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144, (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6, (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8, (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77, (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42, (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28, (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47, (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57, (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64, (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47, (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517, (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19, (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8, (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47, (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13, (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60, (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36, (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62, (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53, (2), 175-183 (2003).
מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה (<em&gt; Aeruginosa Microcystis</em&gt;) שימוש cytometry הזרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter